Ishophloroglucin A izolovaný z Ishige Okamurae potlačuje melanogenezi indukovanou -MSH: in vitro a in vivo část 2

3. Diskuse

sdasdad

Sloučenina DPHC izolovaná z IOE již vykazovala inhibici tyrosinázyaktivitu a ochranný účinekproti poškození buněk způsobenému UV-B zářenímin vitro[8]; nicméně,antimelanogenetický účineksložek odvozených z IOE in silico interakcí styrosináza,in vivove fenotypových studiích na zvířecích modelech a jejich základních molekulárních mechanismech,dosud nebyly zkoumány. V této studii jsme stanovili antimelanogenezi a tyrosinázuinhibiční aktivity IPA, florotaninu izolovaného z IO a IOE, v modelu zebřičky na obratlovcíchin vivo a v buňkách melanomu B16F10 in vitro, po indukci -MSH.

Léčba s - Je známo, že MSH indukuje syntézu melaninu a aktivitu tyrosinázy [20]. Navíc bylo prokázáno, že tyrosináza je nezbytná pro melanogenezi.29]. Předchozí studieukázali, že molekulární dokování lze použít k hodnocení inhibiční aktivity tyrosinázy [30,31]. Byly tedy provedeny výpočty molekulárního dokování pro pochopení vazebného modelu IPAa DPHC, známý polyfenol izolovaný z IO, který odhalil vyšší vazebnou energii vantimelanogenezní aktivitu než arbutin, jako pozitivní kontrola. Podle výsledků (obr1), IPA odhalila nejnižší skóre dokování, což naznačovalo interakci IPA s cílemprotein tyrosináza byl silnější než další dvě sloučeniny, DPHC a arbutin. Nicméně,existuje omezení v korelaci inhibice aktivity houbové tyrosinázy s inhibicí buněčnéprodukce tyrosinázy nebo melaninu v kultivovaných melanocytech [32]. Tedy inhibiční účinkyna IPAaktivita tyrosinázy a melanogeneze byly zkoumány u zebřičkyin vivomodel a myší B16F10melanomové buňky.

Melaninové pigmenty se hromadí na povrchu zebřičky, což umožňuje mikroskopické pozorováníproces pigmentace bez složitých experimentálních postupů, což z nich činí vhodný modelpro screening inhibitorů melanogeneze [33,34]. Hodnotili jsme inhibiční účinky na melaninIPAa IOE v modelu larev zebřičky stimulované -MSH stanovením obsahu melaninu.Všechny testované vzorky vykazovaly hluboké inhibiční účinkyna zebřičce bez signifikantní pigmentacetoxicita (obrázek S2). Inhibiční účinkymorfologické analýzylarvy zebrafish související s různýmiošetření (obr2). Kromě toho použití raného stádia larevspíše než dospělá fáze poskytuje další výhodu při testování perkutánních účinkůléčivýchnebo kosmetické směsi [33,35]. V tomto případě jsme zvolili -MSH jako induktor jak u zebřiček in vivoa v buňkách melanomu B16F10in vitro. Podle obou výsledků u embryí zebřičky a B16F10melanomových buněk se obsah melaninu zvýšil o - stimulace MSH.

Obsah melaninu přímo koreluje s aktivitou a hladinou proteinů tyrosinázy [36]. Proto,zjišťovali jsme inhibiční účinkyIPA a IOE na aktivitu tyrosinázy indukovanou - MSH zapnutobuňky B16F10. Zjistili jsme, že skupina léčená IPA měla sníženou aktivitu tyrosinázy a melaninuobsah stimulovaný tím -MSH, se snížením aktivity tyrosinázy přibližně o 35 procent a o 40 procentobsah melaninu (obr4A, C). IOE inhibovala aktivitu tyrosinázy způsobem závislým na dávce avýznamně snížila melanogenezi v buňkách B16F10 (obr4B, D). Ve srovnání s arbutinem, IPA aIOE mají významné inhibiční účinkyna produkci melaninu a aktivitě tyrosinázy, která byla kvýsledky předchozích studií molekulárního dokování.

Prozkoumat mechanismus inhibičních účinkůna - MSH-indukovaná syntéza melaninu vbuněk, byl proveden Western blotting. Hladiny exprese proteinů příbuzných melaninu, včetněByly hodnoceny ERK, JNK a p38 po léčbě IPA nebo IOE. Aktivovaná fosforylaceERK může podporovat degradaci MITF prostřednictvím dráhy závislé na ubikvitinu-proteazomu [28]. To naznačuje, že potenciální inhibitory melanogeneze mohou potlačovat syntézu melaninu podporouproteasomální degradace MITF, která souvisela s aktivací ERK signalizacecesty [37]. ERK, JNK a p38 MAPK patří do rodiny MAPK [38–40]. navícaktivace dráhy p38 MAPK indukovaná expresí MITF [41]. V této studii Western blotanalýza ukázala, že IPA podporuje p-JNK a p-p38 (obr5PŘED NAŠÍM LETOPOČTEM). Naproti tomu hladiny p-ERKse při léčbě IPA a IOE nezměnila (obr5A). Tyto výsledky naznačují, že inhibiční účinkyIPA a IOE na aktivitu tyrosinázy a melanogenezi může souviset s JNK a p38signální dráhy.

4. Materiály a metody

4.1. Chemikálie a činidla

dimethylsulfoxid (DMSO), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT),L-DOPA, hormon stimulující alfa-melanocyty ( -MSH) a fosfátový pufrfyziologický roztok (PBS)byly zakoupeny od Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Dulbecco je upravenEagleovo médium (DMEM) a fetální bovinní sérum (FBS) byly získány od společnosti Invitrogen–Gibco(Grand Island, NY, USA). Extracelulární signálem regulovaná kináza (ERK1/2), fosforylovaný ERK1/2 (p-ERK1/2), c-Jun N-terminální kináza (JNK), fosforylovaná JNK (p-JNK), p38, fosforylovanáp38 (p-p38), cAMP response element-binding protein (CREB), fosforylovaný CREB (p-CREB),transkripční faktor spojený s mikroftalmií (MITF), protein související s tyrosinázou-1 (Trp-2),protein související s tyrosinázou-1 (Trp-1), tyrosináza (TYR), protilátky proti myším a králičím IgGbyly zakoupeny od společnosti Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Všechna ostatní činidla, včetně -MSH, byly zakoupeny od Sigma-Aldrich Chemical Co.

4.2. Molekulární dokování tyrosinázy

Pro studii dokování byla krystalová struktura tyrosinázy (PDB: 3NM8) získána zProteinová databanka. Studie dokování byly provedeny pomocí CDOCKERv Accelrys Discovery Studio 3.{1}} (Accelrys, Inc., San Diego, CA, USA). Když celý nukleotidsekvence je pokryta mřížkou receptoru, předpokládá se, že ligandy vybírají nejlepší dokovací pozici [42]. Postup dokování byl zmíněn v předchozí studii. Stručně řečeno, následovaly tři kroky: (1)převod 2D struktury na 3D strukturu; (2) výpočet poplatků; a (3) přidáníatomy vodíku pomocí flexibilního dokovacího programu [31,43].

4.3. Příprava IOE a izolace IPA

IO byla sklizena v červnu 2018 podél východního pobřeží ostrova Jeju v Koreji. Řasa byla dvakrát promytavodou z vodovodu, abyste odstranili sůl, epifyty a písek připojený k povrchu. Dále to bylo opatrněopláchnuta čerstvou vodou a byla uchovávána v lékařské lednici při−20 ◦C. Poté se zmrazířasa byla před extrakcí lyofilizována a homogenizována v mlýnku. IOE bylo extrahováno z 50 procentethanol (v/vve vodě) za míchání po dobu 24 hodin při teplotě místnosti, poté byla zfiltrována. Filtrátextrakt byl zakoncentrován za dekomprese a lyofilizován na prášek (IOE). 50 procent etanoluExtrakt IO byl proveden společností Shinwoo Co. Ltd. (šarže č. SW9E29SA, Gyeonggi-do, Korea). IPA bylaizolovaný z IOE, jak bylo popsáno dříve [9]. Stručně, IOE byl frakcionován za použití odstředivkydělicí chromatografie. Všechny frakce byly shromážděny a IPA byl nakonec purifikován pomocí asemipreparativní HPLC kolona (YMC-Pack ODS-A, 10 mm, 250 mm, 5 m). IPA byla stanovena jako apolyfenol a jeho chemická struktura (obrázek S1, doplňkové materiály) byla identifikována pomocí LC/SLEČNAanalýza s hmotnostím/z z 992,1315, což ukazuje na molekulární vzorec C96H66O48 (1986,26 zvypočítaná molekulová hmotnost,∆0.6, [M − 2H] 2−).

4.4. Původ a údržba rodičovské zebřičky

Dospělé zebřičky byly získány od komerčního prodejce (Seoul Aquarium, Soul, Korea) a 10ryby byly konzervovány v 3-l akrylové nádrži při 28,5◦C, s cyklem světlo:tma 14:10 h. Zebrafish bylykrmení dvakrát denně po dobu 6 dnů⁄týden s doplňkovým krmivem s vločkami Tetramin (SEWHAPET Food Co.,Soul, Korea). Embrya byla odebrána během 30 minut přirozeným třením a indukována ránorozsvícením světla. Experiment se zebřičkami byl schválen organizací Animal Care and UseVýbor Národní univerzity Jeju (č. schválení 2017-0001).

4.5. Měření obsahu melaninu v larvách zebřičky

IPA a IOE a stimulátor Ke zkoumání účinků byly použity koncentrace -MSHzsoustředění na vývoj embrya. Do každého bylo nasazeno patnáct embryí zebrafish (3–4 hpf).jamka, obsahující 1,9 ml embryonálního média, v 12-jamkové osazovací destičce. Testované vzorky byly rozpuštěnyv 1 procentu DMSO s 1× PBS a dobře promíchejte. Každé ráno pro prvních 5 pdf byla životaschopná embryavyjmenované pro získání míry přežití. Pro stanovení obsahu melaninu se embrya at7–9 hpf bylo naočkováno do 6-jamkové destičky s 30 embryi v každé jamce do 2,{5}}ml embryonálního média.Po 3 dnech byly larvy dvakrát opláchnuty 1× PBS k odstranění případných zbytkových činidel nebočástice a podobná množství larev byla umístěna do e-zkumavek. Před měřením melaninuNěkolik larev z každé skupiny bylo zachyceno mikroskopem a zbývající byly odstředěny.

Po odstředění byla peleta rozpuštěna v 1 ml 1N NaOH při 90 °C◦C po dobu 60 min. Směsse pak energicky vortexoval, aby se rozpustil melaninový pigment. Absorbance supernatantu bylaměřeno při 490 nm. Výsledek byl porovnán s kontrolou, která byla považována za jednusto. Obsah melaninu byl kalibrován množstvím proteinu a pozorování byla opakovánav trojím vyhotovení.

4.6. Cytoxicita IPA a IOE v buňkách B16F10

B16F10 myší melanomové buňky byly získány z ATCC (American Type Culture Collection,Manassas, VA, USA). Buňky B16F10 byly kultivovány v DMEM doplněném 100 U/ml penicilinu,100 µg/ml streptomycinu a 10 procent FBS. Buňky byly poté inkubovány v atmosféře 5 procent CO2 na37 ◦C a poté byly subkultivovány každých 3–5 dní. Cytotoxicita IPA a IOE proti B16F10buňky byly zkoumány pomocí kolorimetrického MTT testu. Stručně, buňky byly nasazeny na 24-jamkové destičky v a

koncentrace 2× 104buňky/ml. Asi 16 hodin po naočkování byly buňky inkubovány s IPA a IOEpři různýchkoncentrace po dobu 72 hodin a byla stanovena jejich životaschopnost.

4.7. Stanovení obsahu buněčného melaninu

Obsah buněčného melaninu byl měřen pomocí dříve popsané metody [33]. Buňky(2 × 104 buňky/ml) byly inkubovány s různými koncentracemi IPA a IOE po dobu 72 hodin; proto,byly promyty v ledově chladném PBS. Stručně, buňky byly inkubovány při 80 °C◦C po dobu 1 hodiny v 1 ml 1 NNaOH/10 procent DMSO a poté byly vortexovány, aby došlo k rozpuštění melaninu: absorbance byla měřena při450 nm. Optická hustota inhibice u kontroly byla považována za 100 procent . Údaje jsouprezentovány ve formě středních procent a výsledky byly opakovány třikrát.