Předběžné nálezy zvýšených zánětlivých plazmatických cytokinů u dětí s autismem, které mají komorbidní gastrointestinální příznaky, část 1

Abstraktní:

Porucha autistického spektra (AU) je přítomna přibližně u 2 procent populace a je často spojena s komorbiditami, které mohou ovlivnit kvalitu života. Jednou z nejčastějších komorbidit u autismu je přítomnost gastrointestinálních (GI) symptomů sestávajících z nepravidelného vyprazdňování, jako je zácpa, průjem nebo střídavé vyprazdňování.

V posledních letech, s prohlubujícím se výzkumem poruchy autistického spektra (ASD), stále více lidí začíná věnovat pozornost vztahu mezi PAS a imunitou. Přestože současné výsledky výzkumu nejsou zcela konzistentní, většina studií prokázala, že mezi ASD a imunitou skutečně existuje souvislost.

Za prvé, mnoho dětí se rodí s nízkou imunitou, což může zvýšit jejich riziko rozvoje ASD. Za druhé, stále více studií ukázalo, že existují abnormality v imunitním systému pacientů s ASD. Mohou mít například alergické reakce, autoimunitní onemocnění atd. Některé studie navíc zjistily, že pacienti s ASD mají vyšší hladinu oxidačního stresu, což může vést k poškození buněk a neurodegeneraci.

Neměli bychom však přehlížet pozitivní aspekty života s PAS. Lidé s ASD mohou mít silnější imunitu. Studie ukázaly, že jejich imunitní systém se může lépe vypořádat s některými bakteriálními a virovými invazemi. Kromě toho mohou mít pacienti s ASD také více imunitních buněk a jejich imunitní systém může být stabilnější a méně náchylný k přehnaným reakcím.

Celkově je vztah mezi ASD a imunitou komplexní a není pouze pozitivní nebo negativní. Tato otázka musí být v budoucnu prozkoumána do hloubky prostřednictvím důslednějšího výzkumu. Bez ohledu na to bychom měli být všichni proaktivní ohledně PAS a pracovat s lidmi s PAS a jejich rodinami, aby se mohli lépe přizpůsobit společnosti. Z tohoto pohledu musíme zlepšit imunitu. Cistanche může výrazně zlepšit imunitu, protože popel z masa obsahuje různé biologicky aktivní složky, jako jsou polysacharidy, houby a Huang Li. Tyto složky mohou stimulovat různé buňky imunitního systému a zvýšit jejich imunitní aktivitu.

Click cistanche tubulosa výhody

Důkaz imunitní infiltrace a imunitní aktivace byl prokázán v ileu a tlustém střevě dětí s AU s GI symptomy. Kromě toho je imunitní dysfunkce faktorem přispívajícím k mnoha onemocněním GI a předpokládáme, že by to bylo zjevnější u dětí s AU, které vykazují příznaky GI, než u dětí, které nemají příznaky GI.

Tato předběžná studie měla za cíl zjistit, zda existují změněné hladiny cytokinů v plazmě u dětí s AU s GI symptomy ve srovnání s dětmi s AU bez GI symptomů, typicky se vyvíjejícími (TD) dětmi s GI symptomy a TD dětmi bez GI symptomů, ze stejné populační kohorta. Plazmatické hladiny cytokinů byly hodnoceny multiplexními testy.

U TD kontrol s nebo bez GI symptomů nebyly pozorovány žádné rozdíly v plazmatických cytokinech; avšak mnoho vrozených (IL-1, TNF, GM-CSF, IFN) a adaptivních cytokinů (IL-4, IL-13, IL-12p70) bylo zvýšeno v AU děti s GI symptomy ve srovnání s dětmi s AU bez GI symptomů. Slizničně relevantní cytokin IL-15 byl zvýšen u AU s GI symptomy ve srovnání se všemi skupinami.

Naproti tomu regulační cytokin IL-10 byl snížen u AU se symptomy GI a může naznačovat nerovnováhu v prozánětlivých/regulačních signálech. Tyto údaje naznačují, že děti se symptomy AU a GI mají nerovnováhu v imunitní odpovědi, která je evidentní v hladinách jejich cirkulujících plazmatických cytokinů. Zjištění, které by mohlo poukázat na potenciální terapeutické a/nebo monitorovací strategie pro GI problémy v AU.

Klíčová slova:
autismus; ASD; imunní; zánět; gastrointestinální; komorbidity; cytokiny; nařízení; schizofrenie; tolerance; imunita; adaptivní imunita; slizniční imunita.

1. Úvod

Prevalence neurovývojových poruch, jako je porucha autistického spektra (AU), na celém světě rychle narůstá. Jejich etiologie je z velké části neznámá, ale ve většině případů je pravděpodobně způsobena kombinací genetických a environmentálních faktorů. Diagnóza AU je v současné době omezena na behaviorální rysy včetně opakujícího se a stereotypního chování a narušení komunikace a sociální interakce.

Mnoho jedinců s AU však také trpí jednou nebo více zdravotními komorbiditami, včetně gastrointestinální (GI) dysfunkce [1–7] GI symptomy u autismu byly hlášeny již 80 let [8], s nepravidelnými střevními příznaky zácpy a průjmu. nejčastější [9–11].

V naší velké kohortové studii 1000 účastníků měly děti s AU 6–8krát vyšší pravděpodobnost, že budou trpět symptomy GI ve srovnání s typicky se vyvíjejícími dětmi stejného věku; navíc GI symptomy byly spojeny s horším skóre hodnocení chování [12].

Navzdory častým zprávám o dysfunkci GI v AU chybí doporučení na specializované kliniky nebo vhodná léčba GI symptomů. Absence studií biologických signatur u komorbidit AU také bránila strategiím, které by mohly pomoci zmírnit problémy s GI.
Slizniční imunitní buňky zahrnují přibližně 70 procent imunitních buněk v těle a dysfunkce těchto buněk může mít nepříznivé důsledky pro funkci GI. Změněná slizniční imunita může ovlivnit funkci epiteliální bariéry hostitele, diverzitu komenzálních bakterií ve střevě a střevní nervový systém [3].

Mnoho zpráv popisuje imunitní abnormality u AU včetně změn v imunitní genetice, zkreslené produkce cytokinů, změněné funkce T buněk a zesílených vrozených imunitních odpovědí [13–16]. Navíc byla imunitní aktivace hlášena u téměř dvou třetin dětí s AU a je spojena se závažnějším chováním [13]. Endoskopické analýzy dětí s AU s GI symptomy odhalily přítomnost jemného, ​​difuzního zánětu střevního traktu (přehled v [1,4]).

Přesná povaha tohoto zánětu však byla diskutována a v současné době není jasná. Histologické, imunohistochemické a průtokové cytometrické důkazy konzistentně prokázaly pan-enterickou infiltraci imunitních buněk, jako jsou lymfocyty, monocyty, přirozené zabíječe (NK) a eozinofily do stěn GI traktu u dětí s AU, ve srovnání s typicky se vyvíjejícími ( TD) děti s GI symptomy [9,17–21].

Tyto zprávy ukázaly, že u dětí s AU a GI symptomy jsou zvýšené infiltráty imunitních buněk v tlustém střevě, ileu, duodenu a žaludku. Kromě toho infiltrující lymfocyty vykazují výrazný prozánětlivý fenotyp – se zvýšenými buňkami CD3 plus IL-6 plus, CD3 plus TNF plus buňkami a sníženým regulačním CD3 plus IL-10 plus buňkami u dětí s AU a GI symptomy ve srovnání s kontrolami [17,18].

Srovnání intracelulární produkce cytokinů před a po imunizaci v periferních T buňkách odhalilo podobný profil se zvýšenou produkcí prozánětlivých cytokinů, ale se sníženou regulací u dětí s AU, které měly GI symptomy ve srovnání s kontrolami [22].

Stimulované cytokinové reakce pozorované u dětí s AU a GI symptomy se lišily od dětí s AU bez GI symptomů, stejně jako u dětí s kontrolou TD a naznačují, že produkce cytokinů po imunitní stimulaci může být jedinečná u dětí s AU a GI symptomy.

Imunitní profily u dětí s AU a GI symptomy se také lišily od dětí s prokázaným zánětlivým střevním onemocněním (IBD), jako je Crohnova choroba, celiakie a ulcerózní kolitida [9,17–19,21]. Podobné nálezy zvýšené produkce prozánětlivých cytokinů po stimulaci, IL-1, IL-6 a TNF, byly prokázány u dětí, které mají AU a potravinovou senzitivitu ve srovnání s kontrolami [23,24].

Hledání biologických signatur nebo biomarkerů u autismu bylo dosud málo prozkoumanou oblastí. Pravděpodobně největší užitečnost biologických signatur v kontextu AU nebude při určování hlavních symptomů, ale v souvisejících komorbiditách. Tyto komorbidity mají často hluboký vliv na závažnost symptomů nebo souvisejícího chování, jako je spánek, podrážděnost, agresivita nebo úzkost [3].

Některé plazmatické cytokiny nebo imunitní mediátory byly zkoumány pro svůj potenciál jako biomarkerů, většinou v kontextu závažnosti AU [14,25–27]. Plazmatické markery, které by mohly pomoci identifikovat nebo sledovat trajektorii GI symptomů u AU, chybí. V této studii se snažíme charakterizovat profily plazmatických cytokinů u dětí s AU s nebo bez GI symptomů z náhodného odběru vzorků populační studie případ-kontrola.

2. Materiály a metody

Tato studie zahrnovala 79 účastníků, kteří byli zařazeni do studie CHARGE (Childhood Autism Risk from Genetics and Environment), probíhající populační studie případ-kontrola [28]. Stručně řečeno, účastníci studie CHARGE byli vybráni ze 2 vrstev: autistické poruchy (AU) a kontroly z obecné populace s typicky se vyvíjejícím (TD).

Způsobilé děti byly ve věku od 24 do 60 měsíců, narodily se v Kalifornii, žily alespoň s jedním biologickým rodičem, který mluvil anglicky nebo španělsky, a bydlely ve spádových oblastech uvedeného seznamu regionálních center v Kalifornii. Děti s AU byly identifikovány prostřednictvím regionálních center, poskytovatelů/klinik, doporučování samy a prostřednictvím široké veřejnosti.

Děti s TD byly identifikovány ze státních záznamů o narození a byl vytvořen stratifikovaný náhodný vzorek pomocí frekvenčního porovnávání s projektovaným rozložením případů AU podle věku, pohlaví a spádové oblasti. Děti s významnými motorickými a smyslovými poruchami (např. slepota a hluchota), které by bránily validnímu hodnocení vývoje, byly vyloučeny.

Protokol studie CHARGE byl schválen institucionálními kontrolními komisemi Kalifornské univerzity v Davisu a Výborem státu Kalifornie pro ochranu lidských subjektů. Před účastí byl získán písemný informovaný souhlas.

Pro tuto studii bylo náhodně vybráno 40 případů s kontrolami AU a 40 TD ze skupiny účastníků studie CHARGE zařazených mezi dubnem 2003 a dubnem 2008, poskytli vzorek krve, vyplnili dotazník GI historie a měli potvrzenou diagnózu AU nebo TD. Případy a kontroly byly porovnány podle věku při odběru krve (v 3-měsíčních intervalech) a podle toho, zda měly či neměly časté GI příznaky nepravidelného pohybu střev (definované jako častý průjem nebo zácpa v posledních 3 měsících).

Původním cílem studie bylo mít 20 případů a 20 kontrol s častými GI symptomy a také 20 případů a 20 kontrol bez častých GI symptomů. Protože v době studie mělo pouze 9 kontrol v celé studii CHARGE časté GI symptomy, případy a kontroly se shodovaly pouze podle věku při odběru krve.

Konečný vzorek 80 dětí tvořilo 20 případů (průměrný věk 41,7 ± 9,6 měsíce; 16 mužů) a 9 kontrol (průměrný věk 41,6 ± 9,1 měsíce; 7 mužů) s častými GI příznaky a 20 případů (průměrný věk 41,9 ± 9,3 měsíce; 19 muži) a 31 kontrol (průměrný věk 42,2 ± 9,3 měsíce; 26 mužů) bez častých GI symptomů. Protože se jednalo o náhodný výběr, nevylučovali jsme na základě užívání léků.

Jen málo dětí užívalo léky v době odběru krve: mezi ně patřily antimikrobiální látky, jako je acyklovir, ketokonazol (2 případy s GI příznaky a 2 případy a 2 kontroly bez GI příznaků), steroidy, jako jsou astmatické inhalátory, Nasonex (2 případy a 1 kontrola s GI příznaky a 1 případ a 1 kontrola bez GI příznaků) a léky související s GI, jako je Miralax, Nexium, magnézium (2 případy a 3 kontroly s GI příznaky).

Žádný z účastníků neužíval antipsychotika. Nezjistili jsme žádné účinky léků na data při společné analýze (léčených vs. neléčených, v rámci skupin) nebo u jednotlivých léků.

Diagnóza autismu byla potvrzena pomocí hodnocení zlatého standardu: Autism Diagnostic Interview-Revised (ADI-R; [29]) a Autism Diagnostic Observation Schedule (ADOS; [30]). Kontroly byly skrínovány na AU pomocí dotazníku sociální komunikace (SCQ; [31]) a žádná nebyla hodnocena nad hraniční hodnotou (SCQ větší nebo rovno 15).
Případům a kontrolám byly aplikovány Mullenovy škály raného učení (MSEL; [32]) a Vinelandovy škály adaptivního chování (VABS; [33]) za účelem stanovení kognitivního a adaptivního vývoje. Typický vývoj u kontrol byl definován jako složené skóre vyšší nebo rovné 70 v obou hodnoceních a bez předchozí diagnózy opoždění vývoje.

Všichni lékaři v UC Davis MIND (Medical Investigation of Neurodevelopmental Disorders) Institute dosáhli spolehlivosti výzkumu na vývojová hodnocení, která provedli (ADI-R, ADOS, MSEL a VABS). Dvojjazyčný personál studie byl k dispozici pro podávání informovaného souhlasu a všech nástrojů/dotazníků ve španělštině.

2.1. Odběr krve a analýza cytokinů
Periferní krev byla odebrána od každého subjektu do acid-citrát-dextróza Vacutainers (BD Biosciences; San Jose, CA, USA). Krev byla centrifugována při 2100 rpm po dobu 10 minut, plazma byla poté odebrána a skladována při -80 °C před analýzou cytokinů. Koncentrace cytokinů v plazmě účastníků byly stanoveny metodou multiplexing bead immunoassays assay (Millipore, Billerica, MA, USA). Vzorky a referenční kontroly byly prováděny podle protokolu výrobce.

Stručně řečeno, 25 µl vzorku plazmy bylo inkubováno s fluorescenčními kuličkami spojenými s protilátkou, poté promyto a inkubováno s biotinylovanými detekčními protilátkami a následně streptavidin-fykoerytrinem. Kuličky byly poté analyzovány pomocí průtokového systému suspenzního pole Luminex™ 100 (Bio-Plex 200; BioRad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Standardní křivky byly vytvořeny softwarem Bio-plex Manager pro stanovení neznámé koncentrace vzorku. Všechny vzorky a referenční cytokiny byly připraveny podle doporučení výrobce a hladiny cytokinů a chemokinů byly hodnoceny multiplexní analýzou Luminex™.

Hodnoty vzorků jsou vyjádřeny v pg/ml. Analyzovanými cytokiny/chemokiny byly interleukin (IL){{0}}, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL{ {5}}, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL{{10}} (p4{{48} }), IL-12 (p7{{50}}), IL-13, IL-15, IL-17, stimulující kolonie granulocytů a makrofágů faktor (GM-CSF), faktor stimulující kolonie granulocytů (G-CSF), interferon-gama (IFN ), IFN- 2, tumor nekrotizující faktor alfa (TNF), TNF, eotaxin, monocytový chemotaktický protein (MCP )-1, makrofágový zánětlivý protein (MIP)-1, MIP-1 a 10 kDa protein indukovaný interferonem gama (IP-10), minimální detekční limity pro tyto cytokiny/chemokiny byly 2,4, 0,3, 1,2, 1,3, 2,2, {{60}},2, 1,1, 2,4, 0,9, 0,3, 34,9, 0,8, 1.0, 0,8, 0,4, 5,0, 0,9, 0,5, 0,4, 1,5, 0,9, 5, 1,8, 5, 10 7, respektive 3,6 pg/ml.

Koncentrace získané pod mezí detekce (LOD) metody byly vypočteny jako polovina meze detekce (LOD/2) pro statistické srovnání. Hodnoty získané odečtením vzorků, které přesáhly horní mez citlivostní metody, byly dále zředěny a podle toho byly vypočteny koncentrace cytokinů.

Variace hladin cytokinů uvnitř a mezi plotnami/testem s použitím reprezentativních vzorků na všech plotnách byly menší než 5 procent. Alikvoty plazmy nepodstoupily žádný předchozí cyklus zmrazení/rozmrazení. Cytokinový analytik byl slepý k případu nebo kontrolnímu stavu každého vzorku.

For more information:1950477648nn@gmail.com