Extrakt prasečí placenty Zvyšuje buněčnou hladinu NAD v lidských epidermálních keratinocytech Ⅱ

Diskuse

Mnoho studií prokázalo, žepokles NADv důsledku stárnutí koreluje sfunkční pokles tkáníarozvoj nemocí souvisejících s věkem a rakoviny11,22. V epidermis způsobuje UV záření, nejdůležitější vnější faktor stárnutí kůže, vyčerpání NAD a takéchronologické stárnutí23. Vzhledem k tomu, že kůže je v každodenním životě neustále vystavována UV záření, zdá se, že lokální aplikace látek zvyšujících NAD je rozumným přístupem k prevenci snížení NAD a ochraně pokožky před poškozením UV zářením. Bylo prokázáno, že zvýšení NAD v kůži zabraňuje rakovině kůže vyvolané UV zářením a imunosupresi u myší24. Jacobson a kol. uvedli, že lokální deriváty kyseliny nikotinové zvýšily obsah NAD v kůži a zlepšily bariérovou funkci25.

Klikněte sem a získejte Cistanche – nejlepší bylinky proti stárnutí

Kromě toho několik klinických studií ukázalo, že lokální aplikace prekurzoru NAD NAM snižujeznámky stárnutí pleti26,27. Tyto in vivo a klinické údaje podporují možnost, že zvýšené hladiny NAD bránípoškození kůže a zpomalení stárnutí. Již dříve jsme také uvedli, že udržování adekvátních hladin NAD je nezbytné pro ochranu lidských epidermálních buněk před UV stresem21. V této studii jsme prokázali, že PPE zvyšuje intracelulární hladiny NAD v keratinocytech. Zjistili jsme také, že jeho aktivní složky mají LMW menší než 3 kDa, což je účinné jak pro monovrstvu, tak pro 3-rozměrné modely kultury epidermis. Tato zjištění naznačují, že aktivní složky PPE by mohly být transdermálně absorbovány, a proto zdůrazňují jeho potenciální aplikaci jako topické činidlo pro zvýšení hladiny NAD v kůži.

Tabulka 1. Obsah prekurzoru NAD v OOP.

V kůži nedostatek NAD snižuje funkci hlavních energetických metabolických drah, jako je glykolýza a oxidativní fosforylace. Glykolýza je nezbytná pro udržení rovnováhy mezi proliferací a diferenciací keratinocytů28. Vystavení UV záření snižuje hladiny NAD, a proto může urychlit tuto nerovnováhu. Bylo pozorováno, že poměr diferenciace k proliferaci se výrazně zvýšil u pokožky vystavené slunci ve srovnání s kůží chráněnou před sluncem29. Tan a kol. zjistili, že léčba FK866 urychlila diferenciaci a snížila metabolickou aktivitu v NHEK a že NAM zvrátil tyto události vyvolané FK{5}} obnovením hladin buněčného NAD28.

Obrázek 4. Topická PPE ukazuje aktivitu obnovy NAD, ale neovlivňuje buněčnou metabolickou aktivitu u RHE. (A) Schematické znázornění modelu RHE. (B) PPE (2 mg/ml) byl aplikován na stranu stratum corneum RHE a inkubován po dobu 48 hodin v přítomnosti nebo nepřítomnosti FK866 (5 nM). Celkové hladiny NAD v tkáních byly stanoveny pomocí testovací soupravy NAD plus/NADH. (C) PPE (0, 1, 2 nebo 10 mg/ml) nebo 1 procento TX-100 (jako pozitivní kontrola) byly aplikovány na stranu stratum corneum RHE a inkubovány po dobu 48 hodin . Buněčná metabolická aktivita byla stanovena MTT testem. **str<0.01, the comparison to the control.

V této studii jsme zjistili, že PPE obnovuje vyčerpání NAD vyvolané FK866-. Zjištění, zda PPE může udržet diferenciaci a proliferaci v epidermis s ochuzenou NAD, může tedy poskytnout lepšípochopení jehomechanismus proti stárnutí.

Nedávno Aioi et al. ukázaly, že lokální používání OOP výrazně redukovalo mimické vrásky a zlepšilo hydrataci pokožky17. Náš předchozí klinický test ukázal, že topická aplikace OOP krému vedla k významnému zlepšeníparametry proti stárnutí pleti, jakovrásky,hydrataci pokožky, prověšenía oční váčky (nepublikovaná data). Závěry této studie mohou přispět k pochopení základního mechanismu, kterým PPE redukuje vrásky a zlepšuje hydrataci pokožky. Předchozí zpráva ukázala, že intracelulární celkové hladiny NAD pozitivně korelují s expresí složek extracelulární matrice, jako je prokolagen a elastin, ve fbroblastech lidské kůže30. Léčba fibroblastů pomocí PPE má za následek zvýšenou produkci kolagenu typu I17. V kombinaci s těmito skutečnostmi může PPE podporovat produkci kolagenu zvýšením obsahu NAD ve fibroblastech, což může vést ke zmírnění kožních vrásek pozorovaných v klinických studiích. Hydratace kůže je úzce spojena s bariérovou funkcí epidermální vrstvy. Několik studií naznačilo, že NAD je nezbytným kofaktorem pro udržení funkce kožní bariéry. Ming a kol. ukázaly, že NAD-dependentní deacetyláza SIRT1 reguluje expresi filaggrinu, který hraje kritickou roli jako prekurzorový protein přirozených zvlhčujících faktorů v integritě kožní bariéry31. Kromě toho klinická studie prokázala, že topická aplikace látky zesilující NAD výrazně snížila transepidermální ztrátu vody spolu se zvýšením tloušťky stratum corneum v kůži poškozené světlem25. Tyto zprávy naznačují, že PPE může zlepšit funkci kožní bariéry zvýšením hladin buněčného NAD v epidermis, což pravděpodobně vede ke zlepšení hydratace kůže zaznamenané v klinických studiích.

V posledních letech se ukázalo, že boostery NAD jsou užitečné při posilování antioxidačních a protizánětlivých účinků. U diabetických a septických myších modelů podávání NR významně snížilo zánět mozku vyvolaný dietou s vysokým obsahem tuků a zabránilo lipopolysacharidům indukovanému endoteliálnímu oxidativnímu stresu, v tomto pořadí 32,33. Podobně jako u NR bylo prokázáno, že suplementace NMN u starých myší zvrátila prozánětlivý profil exprese mRNA v neurovaskulární jednotce a zlepšila kardiovaskulární funkce snížením oxidačního stresu34,35. Kromě toho klinická studie u starších mužů odhalila, že orální NR snížil hladiny cirkulujících zánětlivých cytokinů36. Dohromady tyto in vivo a klinické studie podporují myšlenku, že aplikace látek podporujících NAD poskytuje antioxidační a protizánětlivé účinky. Zesílená aktivita SIRT byla navržena jako jeden z pravděpodobných mechanismů, kterými tyto posilovače NAD vykazují protizánětlivé a antioxidační účinky. O PPE je známo, že má antioxidační a protizánětlivé účinky15; dosud však byl proveden relativně omezený mechanistický průzkum. Tato studie poskytuje alespoň částečné vysvětlení účinků OOP.

Je známo, že PPE obsahuje hojné proteiny podporující růst buněk, jako je laminin, cytokiny a růstové faktory. Nedávné studie, včetně naší, ukázaly, že buněčné hladiny NAD jsou spojeny s buněčným růstem v epidermálních keratinocytech21,28. Proto jsme spekulovali, že některé z těchto proteinů by mohly přispět ke zvýšení obsahu NAD. Na rozdíl od našich očekávání jsme však zjistili, že část obsahující molekuly s nízkou molekulovou hmotností menší než 3 kDa podporuje produkci NAD v keratinocytech. Je zajímavé, že frakcionace části PPE pomocí HPLC odhalila, že produkce NAD byla pozorována pouze ve frakci 3. Také jsme zjistili, že v této frakci byly přítomny prekurzory NAD, jako jsou NMN, NR a NAM, což naznačuje, že by mohly vysvětlit účinek OOP na výrobu NAD, alespoň částečně. Protože však každá složka obsažená v PPE byla detekována ve velmi nízkých koncentracích, zdá se obtížné vysvětlit, že tyto složky samotné jsou zodpovědné za schopnost PPE podporovat obsah NAD v keratinocytech. Nedávné zprávy ukázaly, že redukované formy těchto prekurzorů NAD, NRH a NMNH, mají větší schopnost produkovat NAD než NR a NMN37–40. Ačkoli jsou zapotřebí další analýzy, aby se určilo, zda PPE obsahuje NRH a NMNH, schopnost PPE zesilovat NAD pozorovaná v této studii může být připsána více zesilovačům NAD, včetně NMN, NR, NMNH, NRH a dalších neznámých prekurzorů NAD.

Materiály a metody

teplota v exsikátoru byla hmotnost měřena přesnými váhami. Obsah sušiny PPE byl 10,98 mg/ml.

Buněčné kultury.

NHEK (novorozenci/muž, Termo Fisher Scientifc, Waltham, MA, USA) byly kultivovány v médiu EpiLife™ obsahujícím 60 μM vápníku doplněného doplňkem pro růst lidských keratinocytů (oba od Termo Fisher Scientifc) při 37 stupních ve zvlhčené atmosféře s 5 procenty CO2 . Médium bylo měněno každý druhý den, dokud kultura nedosáhla přibližně 50% konfluence, načež bylo měněno každý den. Buňky byly pasážovány, když dosáhly 80–90% konfluence. NHEK nebyly použity po pasáži 5.

Kvantifikace NAD a test výtěžnosti.

Množství NAD bylo měřeno pomocí soupravy NAD plus/NADH Assay Kit-WST (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japonsko) podle pokynů výrobce. Stručně, 1.0× 105 NHEK bylo naočkováno do 12-jamkových destiček. Po 24 hodinách byly buňky ošetřeny PPE s různými možnostmi koncentrátu (0, 0,25, 0,5 a 1 mg/ml) a kultivovány po dobu 1–24 hodin v přítomnosti nebo nepřítomnosti 5 nM FK866 (AdooQ Bioscience, Irvine, CA, USA). Buňky byly lyžovány dodaným extrakčním pufrem NAD plus/NADH a ultrafiltrovány za použití odstředivého filtračního zařízení Ultracel-10 K (Merck, Darmstadt, Německo). Pro výpočet koncentrace NADH byla polovina filtrátů inkubována při 60 stupních po dobu 60 minut, aby došlo k rozkladu NAD plus. Všechny filtráty byly podrobeny enzymatické reakci při 37 stupních po dobu 1 hodiny. Poté byla měřena absorbance vzorků při 450 nm pomocí čtečky destiček Infinite 200 Pro (Tecan, Männedorf, Švýcarsko). Obsah NAD plus byl vypočten odečtením obsahu NADH od celkového obsahu NAD. Hladiny NAD plus/NADH byly normalizovány na příslušné koncentrace proteinu stanovené pomocí proteinového testu Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific).

s 300 μl 1 mg/ml roztoku MTT (Thermo Fisher Scientific) při 37 stupních a 5 procentech CO2 po dobu 3 hodin. Po trojím promytí PBS byl formazan infiltrovaný v NHEK extrahován 200 ul dimethylsulfoxidu při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Optická absorpce při 560 nm byla stanovena pomocí čtečky destiček Infnite 200 Pro (Tecan).

Ultrafiltrace OOP. PPE (500 μl) byl aplikován na odstředivé filtrační zařízení Ultracel-3K (Merck Millipore) a centrifugován při 16 100 x g při 4 stupních po dobu 60 minut. Filtráty byly použity jako LMW frakce PPE. Pro získání zbytků na filtru byla filtrační zařízení umístěna dnem vzhůru do nové centrifugační zkumavky a centrifugována při 1000 x g při 4 stupních po dobu 5 minut. Te zbytky byly rekonstituovány s 500 ul fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku (PBS) a použity jako HMW frakce PPE.

min: držet na 100 procentech rozpouštědla A od 0 do 10 minut, poté lineární gradient od 0 procent B za 10 minut do 95 procent B za 30 minut. Te eluenty byly shromažďovány do zkumavek na vzorky každé 2 minuty a sušeny pomocí odstředivé odparky CVE-3100 (EYELA, Tokio, Japonsko). Zbytky byly rekonstituovány 100 μl PBS a filtrovány přes 0,22 μm membránu před použitím testu regenerace NAD.

Analýzy prekurzorů NAD.

NMN, NR a NAM byly detekovány a kvantifikovány izotopovým ředěním LC–MS/MS. Analýzy byly provedeny pomocí systému ACQUITY UPLC H-Class spojeného s TQS-mikrotrojitým kvadrupólovým hmotnostním spektrometrem (Waters, Milford, MA, USA) s elektrosprejovou ionizací provozovanou v režimu kladných iontů. K oddělení každého vzorku byla použita kolona Capcell Pak ADME HR (2 μm, 2,1×100 mm, Osaka Soda, Osaka, Japonsko). Mobilní fáze A–B byly voda-methanol (obsahující {{10}},1 procenta kyseliny mravenčí a 10 mM mravenčan amonný). Podmínky gradientu byly následující: 0–0,5 minuty (99 procent A), 0,5–3 minuty (99–60 procent A), 3–5 minut (60–2 procent A) a 5–7 minut (2 procenta A). Rychlost průtoku byla 0,2 ml/min. Kapilární napětí bylo 0,75 kV, teplota zdroje byla 150 stupňů a desolvatační teplota byla 500 stupňů. Průtok kuželového plynu byl 50 l/h a průtok desolvatačního plynu byl 1100 l/h. Pro kvantifikaci každého prekurzoru NAD byl do vzorků přidán NAM-13C6 v koncentraci 78 nM jako vnitřní standard. Ionty byly monitorovány pomocí monitorování více reakcí (MRM) s následujícími přechody: m/z 335→123 pro NMN, m/z 255→123 pro NR, m/z 123→80 pro NAM a m/z 129→85 pro NAM-13C6. NMN byl zakoupen od Oriental Yeast (Tokio, Japonsko). NR a NAM-13C6 byly získány od společnosti Merck (Darmstadt, Německo). NAM byl zakoupen od Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japonsko).

RHE. In vitro RHE model EpiDerm™ (EPI{0}}) byl zakoupen od společnosti MatTek (Ashland, MA, USA) a kultivován v médiu EPI-100-ASY (MatTek) při 37 stupních a 5 procentech CO2. Sto mikrolitrů PPE (1, 2 a 10 mg/ml) nebo 1 procento TX-100 bylo aplikováno na stranu stratum corneum RHE. RHE byl inkubován po dobu 48 hodin v EPI-100-ASY médiu v přítomnosti nebo nepřítomnosti FK866 (5 nM). Po inkubaci byl RHE třikrát promyt PBS. Pro test obnovy NAD byly celkové hladiny NAD v RHE kvantifikovány pomocí soupravy NAD plus/NADH Assay Kit-WST. Pro test buněčné metabolické aktivity byl RHE přenesen na 24-jamkovou destičku a inkubován s 300 μl 1 mg/ml roztoku MTT (Thermo Fisher Scientific) při 37 stupních a 5 procentech CO2 po dobu 3 hodin. Po trojnásobném promytí PBS byl formazan infiltrovaný v RHE extrahován 2 ml dimethylsulfoxidu při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Optická absorpce při 560 nm byla stanovena pomocí čtečky destiček Infnite 200 Pro (Tecan). Absorbance s 1 procentem TX-100 ošetřeného RHE byla použita jako pozitivní kontrola pro test buněčné metabolické aktivity.

Statistická analýza. Data jsou prezentována jako průměr ± standardní chyba průměru alespoň tří nezávislých experimentů. Všechny statistické analýzy byly provedeny pomocí softwaru EZR verze 1.55 (Saitama Medical

Reference

Appl. 11, 101–109 (2021).

Požádat o víc:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: plus 86 15292862950