Inhibice krevních destiček zabraňuje aktivaci zánětu NLRP3 a poranění ledvin vyvolané sepsí

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Marivee Borges-Rodriguez a kol

Abstraktní:

Krevní destičky, buněčné mediátory trombózy, jsou aktivovány během sepse a jsou stále více uznávány jako mediátory imunitní odpovědi. Aktivace krevních destiček je významně zvýšena u pacientů se sepsí ve srovnání s kontrolními pacienty na JIP. Navzdory této korelaci zůstává úloha aktivovaných krevních destiček při přispívání k patofyziologii sepse nejasná. Již dříve jsme prokázali aktivaci zánětu zánětu receptoru proteinu 3 (NLRP3) NOD u krevních destiček vyvolaných sepsí u potkanů ​​s punkcí slepého střeva (CLP). Aktivované krevní destičky byly spojeny se zvýšeným plicním edémem a glomerulárním poškozením u CLP vs. SHAM kontrol. V této studii jsme zkoumali, zda by inhibice aktivace krevních destiček zeslabila aktivaci NLRP3 a poškození ledvin a plic v reakci na CLP. CLP byla provedena u samců a samic potkanů ​​Sprague Dawley (SD) (n=10/skupina) k vyvolání břišní sepse a potkani SHAM sloužili jako kontroly. Podskupina zvířat CLP byla léčena klopidogrelem (10 mg/kg/den, CLP plus CLOP) k inhibici aktivace krevních destiček. 72 hodin po CLP byla hodnocena aktivace krevních destiček a sestavení zánětu NLRP3, IL-1 a IL-18 byly měřeny v plazmě a byly hodnoceny tkáně, renální a plicní patologie a funkce ledvin. Aktivované krevní destičky byly 7,8 ± 3,6 procenta u Sham, 22 ± 6 procent u CLP a významně se snížily na 14,5 ± 0,6 procenta u CLP plus CLOP (n=8–10/skupina, p < 0,05)="" .="" sestavení="" zánětu="" nlrp3="" bylo="" inhibováno="" v="" krevních="" destičkách="" zvířat="" clp="" plus="" clop="" vs.="" clp.="" významné="" zvýšení="" plazmatického="" a="" ledvinového="" il-1="" a="" il-18="" v="" reakci="" na="" clp="" bylo="" při="" léčbě="" klopidogrelem="" sníženo.="" renální="" poškození,="" ale="" nikoli="" plicní="" histologie="" nebo="" renální="" funkce="" se="" zlepšily="" u="" clp="" plus="" clop="" vs.="" clp.="" tato="" data="" poskytují="" důkaz,="" že="" aktivované="" krevní="" destičky="" mohou="" přispívat="" k="" poškození="" ledvin="" vyvolanému="" sepsí,="" pravděpodobně="" prostřednictvím="" aktivace="" nlrp3="" v="" krevních="" destičkách.="" krevní="" destičky="" mohou="" být="" terapeutickým="" cílem="" ke="" snížení="" poškození="" ledvin="" u="" septických="">

klíčová slova:sepse; NLRP3; krevní destičky; clopidogrel; multiorgánové poranění; aktivace endotelu;zánět

Extrakt z cistanche tubolosa: protizánětlivý

1. Úvod

Sepse je život ohrožující dysregulovaná zánětlivá reakce hostitele na infekční agens [1] a jedna z hlavních příčin úmrtí ve světě. Nejméně 1,7 milionu dospělých v Americe onemocní sepsí a téměř 270000 Američanů ročně zemře na následky sepse [2]. Sepse vede k multiorgánové dysfunkci včetně akutního poškození plic (ALI) [3],akutníledvinazranění(AKI) [4,5], hematologická dysfunkce a dysfunkce centrálního nervového systému, mimo jiné. Rostoucí počet orgánů zapojených do sepse je spojen se zvýšenou mortalitou [6]. Současné léčebné modality se zaměřují na podpůrnou péči; úmrtnost však zůstává vysoká. Uvádí se, že přibližně 35 až 50 procent úmrtí v nemocnici je způsobeno sepsí [7]. Je zásadní určit terapeutický cíl, který může zlepšit mortalitu v důsledku sepse.

Bylo zjištěno, že krevní destičky hrají roli v imunitě [8,9], kromě jejich úlohy v hemostáze a trombóze. Trombocytopenie je často pozorována u sepse a předpokládá se, že k ní dochází v důsledku aktivace a spotřeby krevních destiček; jeho role v procesu onemocnění však zůstává nejasná. Trombocytopenie je spojena s rozvojem (multiorgánového selhání) MOF a zvýšenou 90-denní mortalitou [10–14]. Krevní destičky mohou být nedílnou součástí zánětlivé odpovědi na sepsi. Potenciální mechanismus, kterým mohou krevní destičky přispívat k poškození více orgánů, je prostřednictvím aktivace NOD-like receptor protein 3 inflammasom (NLRP3). NLRP3 je cytosolický imunitní signální receptor, který vede ke štěpení a aktivaci IL-1B a IL-18 zprostředkovanému kaspázou{11}} a je zapojen do patogeneze procesů zánětlivých onemocnění, jako je astma [15 ], Parkinsonova choroba [16], zánětlivé onemocnění střev [17] a sepse [18]. Ukázalo se, že inhibice sestavení zánětu NLRP3 chrání před poškozením orgánů vyvolaným sepsí [19–23]. Již dříve jsme prokázali, že inflammasom NLRP3 je aktivován v krevních destičkách v reakci na punkci slepého střeva (CLP) a je spojen s multiorgánovým poškozením v reakci na polymikrobiální sepsi v 72h CLP potkaním modelu. V této studii jsme předpokládali, že blokování aktivace krevních destiček klopidogrelem (CLOP) sníží aktivaci zánětu NLRP3, poškození ledvin a plic v reakci na polymikrobiální sepsi.

cistanche flavonoidy: protizánětlivě

2. Výsledky

2.1. Aktivace destičky a sestavení zánětu NLRP3

Pomocí průtokové cytometrie jsme stanovili procento aktivace krevních destiček mezi skupinami. Zjistili jsme, že aktivace krevních destiček byla u CLP potkanů ​​zvýšena o 22 ± 6 procent ve srovnání s SHAM o 7,8 ± 3,6 procenta (p < 0.{{10}}5)="" a="" zeslabena="" u="" clp="" plus="" clop="" krysy="" o="" 14,5="" ±="" 0,6="" procenta="" (p="">< 0,05,="" obrázek="" 1).="" sestavení="" zánětu="" nlrp3="" v="" krevních="" destičkách="" bylo="" hodnoceno="" vizualizací="" společné="" lokalizace="" nlrp3="" s="" apoptózou="" asociovaným="" speck-like="" proteinem="" (asc)="" pomocí="" imunocytochemie="" (obrázek="" 2).="" společná="" lokalizace="" inflammasomových="" složek="" v="" krevních="" destičkách="" clp="" byla="" 83krát="" větší="" ve="" srovnání="" s="" kontrolními="" destičkami="" (obrázek="" 2c).="" kromě="" toho="" se="" v="" porovnání="" s="" clp="" u="" krevních="" destiček="" clp="" plus="" clop="" snížilo="" seskupení="" zánětlivého="">

2.2. Cytokiny spojené s inflflammasomem

Aktivace NLRP3 vede k uvolnění prozánětlivých cytokinů IL-1 a IL-18 do jejich aktivních forem. Měřili jsme oba cytokiny v plazmě,plíce, aledvinahomogenizujeSHAM, CLP a CLP plus CLOP pomocí ELISA. Plazmatická IL{{0}} se významně zvýšila z 9 ± 21 pg/mL u Sham na 77 ± 31 pg/mL u CLP (p < {{10}}.0="" 5,="" obrázek="" 3a).="" podávání="" klopidogrelu="" ukázalo="" pokles="" plazmatického="" il-1="" 48="" ±="" 38="" pg/ml;="" pokles="" však="" nebyl="" statisticky="" významný="" ve="" srovnání="" s="" clp="" (p="">< 0.05="" vs.="" sham).="" podobně="" byl="" renální="" il-1="" zvýšen="" v="" clp="" 4="" ±="" 3="" pg/mg,="" ve="" srovnání="" se="" simulací="" 2,5="" ±="" 0,9="" pg/mg="" (p="">< 0,05,="" obrázek="" 3b).="" léčba="" klopidogrelem="" významně="" snížila="" renální="" il-1="" na="" 1,8="" ±="" 0,8="" pg/mg="" (p="">< 0,05).="" v="" plicích="" byl="" il-1="" významně="" zvýšen="" ze="" 70="" ±="" 16="" pg/mg="" u="" sham="" na="" 106="" ±="" 36="" pg/mg="" u="" clp="" (p="">< 0,05)="" a="" nebyl="" významně="" odlišný="" u="" zvířat="" léčených="" clopidogrelem="" (80="" ±="" 23="" pg="" g,="" obrázek="">

Plazmatická IL{{0}} nebyla detekovatelná u SHAM potkanů; avšak průměrný plazmatický IL-18 byl 26 ± 6 pg/ml v CLP. Důležité je, že podávání klopidogrelu vedlo k nižším hladinám plazmatického IL-18 (12 ± 9 pg/ml; p < 0.{{20}}5,="" obrázek="" 3d).="" podobně="" byl="" renální="" il{{10}}="" zvýšen="" u="" clp="" (396="" ±="" 65="" pg/mg)="" ve="" srovnání="" s="" sham="" (317="" ±="" 73="" pg/mg;="" p="">< 0,05).="" léčba="" klopidogrelem="" snížila="" renální="" il-18="" na="" 214="" ±="" 70="" pg/mg="" (p="">< 0,05,="" obrázek="" 3e).="" v="" plicích="" byl="" il-18="" významně="" zvýšen="" ze="" 704="" ±="" 219="" pg/mg="" u="" sham="" na="" 999="" ±="" 158="" pg/mg="" u="" clp="" (p="">< 0,05)="" a="" zůstal="" zvýšený="" u="" zvířat="" léčených="" clopidogrelem="" 1014="" ±="" 235="" pg/mg="" (="" p="">< 0,05="" vs.="" sham,="" obrázek="">

2.3. Endoteliální aktivace

Pomocí ELISA jsme měřili plazmatické hladiny angiopoetinu{{0}} a endokanu jako markerů aktivace endotelu u skupin Sham, CLP a CLP plus CLOP. Plazmatický endokan byl významně zvýšen z 1234 ± 327 pg/ml u Sham na 1978 ± 306 pg/ml u CLP (p < {{20}},05="" vs.="" sham).="" endokan="" byl="" významně="" snížen="" na="" 1521="" ±="" 283="" pg/ml="" u="" clp="" potkanů="" ​​léčených="" clopidogrelem="" (p="">< 0,05="" vs.="" clp,="" obrázek="" 4a).="" podobné="" výsledky="" byly="" nalezeny="" pro="" angiopoetin-2.="" angiopoetin-2="" byl="" významně="" zvýšen="" z="" 5603="" ±="" 2142="" pg/ml="" u="" sham="" na="" 56="" 767="" ±="" 40,000="" pg/ml="" u="" clp="" (p="">< 0,05="" vs.="" sham)="" a="" byl="" významně="" snížen="" u="" potkanů="" ​​léčených="" clopidogrelem="" na="" 22="" 486="" ±="" 13="" 616="" pg/ml="" (p="">< 0,05="" vs.="" clp,="" obrázek="">

2.4. Poranění plic

Histologická analýza plic z každé skupiny prokázala významný nárůst infiltrace neutrofilů s průměrným skóre {{0}},6 ± 0,2 u CLP potkanů ​​ve srovnání se skóre {{6} }.10 ± {{10}}.10 u falešných potkanů ​​(p < 0.05).="" také="" jsme="" pozorovali,="" že="" podávání="" klopidogrelu="" clp="" potkanům="" nezměnilo="" infiltraci="" neutrofilů="" (skóre="" 0,5="" ±="" 0,4,="" obrázek="" 5a).="" podobné="" výsledky="" byly="" zjištěny="" u="" tloušťky="" alveolární="" stěny="" s="" významným="" zvýšením="" clp="" s="" průměrnou="" tloušťkou="" 1,2="" ±="" 0,1="" µm="" ve="" srovnání="" s="" 0,8="" ±="" 0,3="" µm="" u="" potkanů="" ​​sham="" (p="">< 0,05).="" podávání="" klopidogrelu="" clp="" potkanům="" nezlepšilo="" tloušťku="" alveolární="" stěny="" (obrázek="">

2.5. Poranění ledvin

Jak jsme již dříve publikovali, GFR se významně snížila z 2,1 ± 0,8 ml/min/100 g, ale u potkanů ​​Sham na {{10}} 0,7 ± 0,2 ml/min/100 g, ale u CLP potkanů ​​(p < 0,05).="" podávání="" klopidogrelu="" ukázalo="" zlepšení="" gfr="" na="" 1,3="" ±="" 0,5="" ml/min/100="" g,="" ale="" ve="" srovnání="" s="" clp,="" avšak="" ne="" statisticky="" významné="" (obrázek="" 6a).="" histologická="" analýza="" prokázala="" zvýšené="" glomerulární="" poškození="" ve="" skupině="" clp="" ve="" srovnání="" s="" sham.="" léčba="" klopidogrelem="" významně="" zlepšila="" glomerulární="" poškození="" u="" zvířat="" s="" clp="" (obrázek="">

cistanche zdravotní přínosy: lepší funkce ledvin

3. Diskuse

Sepse je dysregulovaná imunitní odpověď na infekční agens, často spojená s multiorgánovým selháním a je známo, že má vysokou mortalitu. Existuje potřeba identifikace nové terapie, která může modulovat zánětlivou odpověď a snižovat mortalitu. Předpokládá se, že krevní destičky hrají roli v imunomodulaci. Přirozeně, koagulační kaskáda a aktivace krevních destiček byly prominentním předmětem výzkumu. Podávání proteinu C, antikoagulačního endogenního enzymu, bylo spojeno se zlepšením přežití u pacientů s těžkou sepsí [24]. V Japonsku pokyny pro sepsi zahrnují použití časovaného podávání antitrombinu u septických pacientů s DIC a prokázaly lepší výsledky [25]. To naznačuje, že inhibice aktivace krevních destiček může zlepšit výsledky u sepse. Zánětlivá odpověď během sepse je rozhodně složitá a může zahrnovat více než jednu dráhu. Již dříve jsme publikovali, že trombocyty z modelu CLP polymikrobiální sepse mají zvýšenou tvorbu/aktivaci NLRP3 trombocytů a jsou spojeny s poškozením plic a ledvin [26]. V této studii jsme se rozhodli určit roli inhibice krevních destiček v zánětlivé odpovědi na stejném modelu s použitím inhibitoru P2Y12, clopidogrelu.

Jak bylo dříve publikováno, aktivace krevních destiček byla zvýšena v reakci na polymikrobiální sepsi v modelu CLP ve srovnání s krysami Sham. Zjistili jsme, že podávání Clopidogrelu snížilo aktivaci krevních destiček u CLP potkanů ​​a zajímavé je, že byl také pozorován pokles v sestavování zánětu NLRP3 v krevních destičkách. Zjistili jsme také trend ve snižování cirkulujícího IL-1B a IL-18 v plazmě zvířat léčených klopidogrelem ve srovnání se skupinou CLP. V dříve publikované studii jsme uvedli, že přímá inhibice zánětu NLRP3 pomocí MCC950 vedla ke snížení IL-1B a IL-18 v plazmě [27]. To naznačuje, že inhibice aktivace krevních destiček klopidogrelem a pokles zánětlivých cytokinů v tomto modelu sepse je částečně zprostředkován mechanismy NLRP3. Proto je třeba provést další studie, aby se jasněji definovaly zánětlivé dráhy zprostředkované NLRP3 v krevních destičkách.

Multi-organ failure (MOF) occurs frequently in sepsis. Previously published studies reported that in mice, the CLP model caused significant pulmonary damage; and depletion of platelets reduced CLP-induced edema and neutrophil recruitment in the bronchoalveolar space by >60 procent [28]. Již dříve jsme publikovali, že zvýšená aktivace krevních destiček byla spojena s dysfunkcí a poraněním více orgánů v modelu CLP potkanů ​​[26]. Naše údaje ukazují významný pokles IL-1 a IL-18 vledvinyzvířat léčených klopidogrelem. Kombinace akutního selhání ledvin a sepse je spojena se 70% mortalitou ve srovnání se 45% mortalitou u pacientů se samotným akutním selháním ledvin [29]. Glomerulární filtrace (GFR) je indikátoremledvinafunkcea klesá se zvýšeným poškozením ledvin. Léčba klopidogrelem zlepšila poškození ledvin u CLP potkanů, což naznačuje, že aktivace krevních destiček může hrát roli ve vývoji AKI indukované sepsí.

Výhody extraktu z cistanche: zlepšuje funkci ledvin

V souladu s jeho úlohou při způsobení MOF je rozvoj ALI a syndromu akutní respirační tísně (ARDS) u pacientů se sepsí běžným jevem a často vede k potřebě mechanické ventilace u této populace pacientů. Důkazy naznačují, že aktivace krevních destiček hraje důležitou roli v rozvoji MOF u septických pacientů [8,30]. Předchozí studie to podpořily tím, že vykazovaly sníženou infiltraci neutrofilů v plicích septických myší vyvolaných CLP po depleci krevních destiček [28]. Dále Liverani a kol. uvedli, že myši předléčené klopidogrelem byly rezistentní na ALI vyvolanou sepsí [31]. Současná studie však nebyla schopna prokázat žádný významný důkaz snížení IL- 1, infiltrace neutrofilů nebo tloušťky alveolární stěny v plicích. To může být způsobeno použitím jiného živočišného druhu, dávkou Clopidogrelu a dalšími rozdíly v experimentálním uspořádání.

Kapilární prosakování je prominentním znakem sepse. Je známo, že proteiny, jako je vaskulární růstový faktor angiopoetin-2, podporují zánět, endoteliální dysfunkci a jsou spojeny se zvýšenou nemocniční mortalitou u pacientů se sepsí [32]. Endocan je dalším markerem dysfunkce endoteliálních buněk a souvisí se závažností onemocnění a výsledkem u septických pacientů [33]. Také jsme zjistili, že tyto markery aktivace a dysfunkce endotelu byly zvýšené v modelu CLP a sníženy ve skupině léčené klopidogrelem. Podobně jsme pozorovali mírné, ale nevýznamné zvýšení GFR ve skupině léčené klopidogrelem. To naznačuje, že aktivace krevních destiček má určitý modulační účinek na zánětlivou odpověď na sepsi.

V této studii se inhibice aktivace krevních destiček nepromítla do významného zlepšení funkce orgánů. Je možné, že zvolená dávka 10 mg/kg/den byla dostatečná ke zmírnění aktivace krevních destiček, aktivace NLRP3, cytokinů a markerů aktivace endotelu, ale nevedla ke zmírnění poškození plic nebo zlepšení funkce ledvin. Liverani a kol. dříve používali počáteční dávku 30/mg/kg/den u myší divokého typu a P2Y12 knock-out myší, což se promítlo do inhibice poškození plic vyvolaného sepsí [31]. Ve stejné studii byl Clopidogrel podáván před indukcí sepse. Tento hlavní rozdíl může vysvětlit nedostatek významných zlepšení funkce plic nebo ledvin pozorovaných v naší studii.

Zatímco současná studie naznačuje roli aktivace krevních destiček při přispívání k zánětu a aktivaci endotelu v reakci na sepsi, existují omezení, která je třeba poznamenat. Za prvé, zatímco byly měřeny markery aktivace endotelu, jsou zaručeny další experimenty pro hodnocení funkce endotelu. Navíc příspěvek dalších faktorů odvozených z krevních destiček nebyl v této studii kontrolován. Stále tedy existují nezodpovězené otázky týkající se toho, jak krevní destičky přispívají k patologii vyvolané sepsí a selhání orgánů.

Úloha klopidogrelu při snižování mortality u sepse byla kontroverzní se zprávami o klesající incidenci ARDS a mechanické ventilaci, ale bez poklesu mortality [34]. Je třeba provést další studie, aby se určil přesný mechanismus, kterým krevní destičky přispívají k poškození orgánů a dysfunkci při sepsi. Tato studie podporuje další zkoumání krevních destiček jako terapeutického cíle u septických pacientů.

cistanche tubolosa zdravotní přínosy: zlepšuje funkci ledvin

4. Materiály a metody

4.1. Zvířata

Byly použity samice a samci krys Sprague Dawley zakoupení od Envigo (Indianapolis, IN, USA). Všechny experimentální postupy provedené v této studii byly v souladu s pokyny National Institute of Health pro použití a péči o zvířata. Všechny protokoly byly schváleny Institutional Animal Care and Use Committee na University of Mississippi Medical Center. Péče a manipulace se zvířaty byly v souladu s pokyny Národního zdravotního ústavu pro etické zacházení se zvířaty.

4.2. Ligace a punkce céka

Všechny naše experimenty in vivo byly provedeny u 12- až 13-týdenních samců a samic potkanů ​​o hmotnosti přibližně 225–325 g. Zvířata byla náhodně rozdělena do dvou skupin: skupina s falešnou operací (SHAM, n=10) a skupina s punkcí slepého střeva (CLP, n=10). V anestezii isofluranem byla operace CLP provedena na podskupině potkanů ​​k vyvolání abdominální polymikrobiální sepse, jak jsme již dříve popsali [26,27]. Předehřátý fyziologický roztok (20 ml/kg, 37 ◦C) byl subkutánně injikován bezprostředně po operaci za účelem resuscitace. Falešně operovaná zvířata podstoupila stejný chirurgický zákrok bez podvázání nebo punkce slepého střeva. Krysy byly po operaci umístěny zpět do svých klecí a potrava a voda byly poskytovány ad libitum. 24 hodin po CLP byla předchozí incize znovu otevřena a nekrotické slepé střevo bylo pečlivě vyříznuto. Břišní dutina byla promyta 10 ml teplého sterilního fyziologického roztoku. Břišní řez byl opět uzavřen ve vrstvách. Zvířatům bylo denně podáváno širokospektré antibiotikum (Naxcel 5 mg/kg) a analgezie bylo dosaženo buprenorfinem SR (1,2 mg/kg) po dobu 72 hodin experimentu. Agregace krevních destiček byla blokována denním podáváním Clopidogrelu (10 mg/kg/den) po dobu 3 dnů u podskupiny CLP potkanů ​​(CLP plus CLOP; n=12) jícnovou sondou po dobu 3 dnů. Na konci protokolu byla zvířata utracena v hluboké anestezii. Krev a tkáně byly odebrány pro další analýzu.

4.3. Izolace krevních destiček

Arteriální krev byla odebrána do zkumavek vacutainer acid-citrát-dextróza a centrifugována při 200×g po dobu 20 minut, aby se získala plazma bohatá na krevní destičky. Plazma bohatá na destičky (PRP) byla smíchána se stejným objemem HEP pufru (140 mmol/l NaCl, 2,7 mmol/l KCl, 3,8 mmol/l HEPES, 5 mmol/l EGTA, pH 7,4) obsahujícího 1 uM PGE1. Tato směs byla poté centrifugována při 100 x g po dobu 20 minut pro peletizaci zbývajících RBC a WBC, ve kterých bylo 40 ul supernatantu použito k počítání krevních destiček. PRP byl poté centrifugován při 800 x g po dobu 20 minut, supernatant byl odstraněn a peleta byla resuspendována v Tyrodově pufru (134 mmol/l NaCl, 12 mmol/l NaHC03, 2,9 mmol/l KCl, 0,34 mmol/l Na2HPO4,1 mmol/l MgCl2, 10 mmol/l HEPES) obsahující 5 mmol/l glukózy a 3 mg/ml BSA.

4.4. Průtoková cytometrie

Čerstvě izolované krevní destičky (106) byly resuspendovány v 50 ul Tyrodova pufru. Krevní destičky byly inkubovány (RT po dobu 30 minut) s fluorescein isothiokyanátem (FITC) konjugovaným anti-myším CD41 (klon MWReg30, BioLegend, San Diego, CA, USA) a allophycocyanin (APC) konjugovaným anti-myší/krysí CD62P (klon RMP{ {9}}, Biolegend). Minimálně 10{11}} událostí na bránu bylo získáno pomocí MACsQuant Analyzer 10 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA) a analyzováno pomocí softwaru FlowLogic (Innovation, Sydney, Austrálie). Krevní destičky byly rozlišeny specifickou vazbou anti-CD41 a charakteristickým dopředným a bočním rozptylem. Krevní destičky barvené pozitivně na CD41 a CD62P byly označeny jako aktivované destičky.

4.5. Konfokální a světelná mikroskopie

Krevní destičky (10}7) z potkanů ​​Sham nebo CLP nebo stimulované s LPS nebo bez něj byly ponechány přilnout k permanoxovým sklíčkům (Lab-Tek, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Adherované buňky byly fixovány v 10% formalínu po dobu 30 minut, promyty 3X PBS po dobu 10 minut při teplotě místnosti a permeabilizovány ledově studeným 100% methanolem po dobu 10 minut. Sklíčka byla blokována v PBS s 10% kozím a králičím sérem po dobu 1 hodiny, promyta a inkubována s králičí anti-NLRP3 protilátkou (NBP2-12446, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA) po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Sklíčka pak byla promyta a inkubována s anti-králičí Alexa Fluor 488 (A11070, Thermo FisherScientific) po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Sklíčka byla znovu promyta a inkubována s Alexa Fluor647-konjugovanou králičí anti-ASC protilátkou (NBP1-78977AF647, Novus Biologicals) po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Kontroly byly zpracovány identicky, s výjimkou vynechání primárních protilátek. Preparáty byly upevněny v Cytoseal 60 (Thermo Fisher Scientific) a analyzovány na konfokálním skenovacím mikroskopu Nikon C1 (Nikon Inc., Melville, NY, USA). Snímky byly pořízeny pomocí mikroskopu Nikon Eclipse 55i vybaveného barevnou kamerou Nikon-Fi1 (Nikon) a analyzovány pomocí softwaru NIS-Elements D 3.0.

4.6. Kvantifikace biomarkerů endoteliální aktivace a cytokinů

Plazmatické hladiny Angiopoetinu-2 (MANG20, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) a Endocan-1 (MBS039900, MyBioSource, San Diego, CA, USA) byly měřeny jako markery endoteliální dysfunkce metodou ELISA podle podle protokolu výrobce. Plazma,ledvinaa plicní IL-1 (RLB00, R&D Systems) a IL-18 (ab213909, Abcam, Boston, MA, USA) byly kvantifikovány metodou ELISA podle protokolu výrobce.Ledvinya plicní lyzáty byly připraveny pomocí BioPlex Cell Lysis Kit (171304011, BioRad, Hercules, CA, USA) podle protokolu výrobce.

4.7. Posouzení poranění plic

Histological evaluation was performed on the lungs via hematoxylin and eosin (H&E)staining. A lung lobe was formalin-fixed. The tissue was subsequently paraffin-embedded and 5-µm sections were stained with (H&E). Sections were evaluated for neutrophil infiltration into the alveolar space. Five sections were scored in a blinded fashion on a scale of0–2 with 0 representing o neutrophils in the alveolar space, 1 representing 1–5 neutrophils in the alveolar space, and 2 representing >5 neutrofilů v alveolárním prostoru. Snímky byly pořízeny pomocí mikroskopu Nikon Eclipse 55i vybaveného barevnou kamerou Nikon DS-Fi1 (Nikon Inc.) při 40X pomocí softwaru NIS-Elements D 3.{10}}. Tloušťka alveolární stěny byla měřena pomocí softwaru NIS-Elements D 3.0. Data byla normalizována na falešné hodnoty.

4.8. Hodnocení renálního glomerulárního poškození

Ledvinywere collected, weighed, and fixed in a 10% buffered formalin solution. Paraffin sections (3 µm) were prepared and stained with Periodic acid-Schiff to assess the degree of glomerular injury on approximately 30 images per section, per rat. Thirtyglomeruli per section were scored in a blinded fashion on a 0–4 scale with 0 representing a normal glomerulus, 1 representing a 25% loss, 2 representing a 50% loss, 3 representing a 75% loss, and 4 representing >75procentní ztráta kapilár v chomáču. Snímky byly pořízeny pomocí stejného mikroskopu, kamery a softwaru, jak bylo uvedeno výše.

4.9. Měření funkce ledvin

Během postupu CLP byl do jugulární žíly zaveden katétr a subkutánně vyveden na zadní straně krku. Katétr byl každý den proplachován heparinizovaným fyziologickým roztokem až do konce třídenního protokolu. Poslední den protokolu podstoupily krysy krátkou anestezii isofluranem, aby mohly sestavit zařízení NIC-Kidney (MediBeacon; Mannheim, Německo) vyrobené ze dvou světelných diod, které excitují FITC sinistrin při 480 nm, fotodiodu, která vyzařuje světlo při 531 nm, mikroprocesor a baterie. Toto zařízení bylo připevněno k hřbetu krysy pomocí oboustranné adhezivní náplasti (MediBeacon) a zajištěno pláštěm pro hlodavce k oholené oblasti na hřbetě krysy. Potkani se nechali zotavit v oddělených klecích po dobu 15 minut a bylo zaznamenáno základní měření. Po základním měření byla do jugulární žíly podána bolusová injekce FITC-sinistrin (5 mg/100 g tělesné hmotnosti; FTC-FS001, MediBeacon) a následně bolusová injekce sterilního fyziologického roztoku. Během dvouhodinového období po bolusové injekci byla transkutánně měřena kinetika vylučování FITC-sinistrin a byla použita k výpočtu poločasu eliminace (t1/2) FITC-sinistrin pomocí jednokompartmentového modelu s vyhodnocovacím softwarem MDPLab. (MediBeacon) k výpočtu GFR z validovaného empiricky odvozeného konverzního faktoru [35,36].

cistanche recenze: zlepšuje funkci ledvin

4.10. Statistická analýza

Analýza síly určuje, že n z 10–12 zvířat/skupina by dosáhlo síly (1-) 0.80 a pravděpodobnosti chyby typu 1 ( ) 0,05 k detekci rozdílu alespoň 5–10 procent v aktivaci krevních destiček mezi potkany Sham a CLP. Všechna data jsou vyjádřena jako průměr ± SD. Všechna data byla zkontrolována, aby byla konzistentní s Gaussovou distribucí pomocí D'Agostino-Pearsonova testu normality. Statistické analýzy byly provedeny pomocí jednocestné ANOVA s Tukeyho testem vícenásobného srovnání jako post hoc analýza. Hodnota p < 0,05="" byla="" považována="" za="" statisticky="">

Příspěvky autora:

Konceptualizace, CAS, JMW a DCC; metodika, JMW a D.CC; validace, OKT, JMW a DCC; formální analýza, MB-R., CAS, OKT, JMW a D.CC; vyšetřování, MB-R., CAS, OKT, RWT, CHB, CAG, GAT, JMW a DCC; zdroje, JMW a DCC; zpracování dat, MB-R., CAS a DCC; psaní – příprava původního návrhu, MB-R. a CAS; psaní – recenze a úpravy, MB-R., CAS, OKT, RWT, CHB, CAG, GAT, JMW a DCC; vizualizace, MB-R., CAS, JMW a DCC; dohled, OKT a DCC; administrace projektu, DCC; získávání finančních prostředků, DCC Všichni autoři si přečetli publikovanou verzi rukopisu a souhlasili s ní.

Financování:

Výzkum uvedený v této publikaci byl podpořen Národním ústavem všeobecných lékařských věd Národního institutu zdraví pod číslem udělení P20GM104357 a P30GM103328. Tento výzkum financoval National Heart Lung and Blood Institute of the National Institutes of Health pod čísly ocenění F31HL149257 (OKT), R00HL130456 (DCC) a R01HL151407 (DCC) a National Institute of Diabetes and Digestive aledvinyNemociStátního zdravotního ústavu pod číslem udělení R01DK109133 (JMW) Za obsah zodpovídají výhradně autoři a nemusí nutně představovat oficiální názory Národního zdravotního ústavu.

Prohlášení institucionální revizní komise:

Všechny experimentální postupy provedené v této studii byly provedeny v souladu s pokyny Národního institutu zdraví pro použití a péči o zvířata. Všechny protokoly byly schváleny Institutional Animal Care and Use Committee na University of Mississippi Medical Center (protokol 1487A, schválen 07.02.2019). Péče a manipulace se zvířaty byly v souladu s pokyny Národního zdravotního ústavu pro etické zacházení se zvířaty.

Prohlášení o dostupnosti dat:

Všechny údaje na podporu uvedených výsledků jsou uvedeny v rukopise a jsou volně dostupné.

Střet zájmů:

Autoři nevyjadřují žádný střet zájmů.

Reference

1. Greco, E.; Lupia, E.; Bosco, O.; Vizio, B.; Montrucchio, G. Krevní destičky a multiorgánové selhání při sepsi. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18, 2200.
2. Rhee, C.; Dantes, R.; Epstein, L.; Murphy, DJ; Seymour, CW; Iwashyna, TJ; Kadri, SS; Angus, DC; Danner, RL; Fiore, AE; a kol. Výskyt a trendy sepse v nemocnicích v USA s využitím klinických vs. údajů o škodách, 2009–2014. JAMA 2017, 318, 1241–1249.
3. Kim, WY; Hong, SB sepse a syndrom akutní respirační tísně: Nedávná aktualizace. Tuberc. Respir. Dis. (Soul) 2016, 79, 53–57.
4. Alobaidi, R.; Basu, RK; Goldstein, SL; Bagshaw, akutní poškození ledvin spojené se sepsí SM. Semin. Nephrol. 2015, 35, 2–11.
5. Umbro, I.; Gentile, G.; Tinti, F.; Muresan, P.; Mitterhofer, AP Nedávné pokroky v patofyziologii a biomarkerech akutního poškození ledvin vyvolaného sepsí. J. Infect. 2016, 72, 131–142.
6. Bilevicius, E.; Dragosavac, D.; Dragosavac, S.; Araujo, S.; Falcao, AL; Terzi, RG Mnohočetné orgánové selhání u septických pacientů. Braz. J. Infect. Dis. 2001, 5, 103–110.
7. Liu, V.; Escobar, GJ; Greene, JD; Soule, J.; Whippy, A.; Angus, DC; Iwashyna, TJ Nemocnice úmrtí u pacientů se sepsí ze 2 nezávislých kohort. JAMA 2014, 312, 90–92.
8. Katz, JN; Kolappa, KP; Becker, RC Beyond thrombosis: Všestranné krevní destičky v kritickém onemocnění. Hrudník 2011, 139, 658–668.
9. Smyth, SS; McEver, RP; Weyrich, AS; Morrell, CN; Hoffman, MR; Arepally, GM; francouzština, PA; Dauerman, HL; Becker, RC; Platelet Colloquium, P. Funkce destiček mimo hemostázu. J. Thromb. Haemost. 2009, 7, 1759–1766.
10. de Stoppelaar, SF; van 't Veer, C.; van der Poll, T. Role krevních destiček v sepsi. Thromb. Haemost. 2014, 112, 666–677.
11. Nawaz, M.; Dickfeld, T.; Bogner, C.; Fateh-Moghadam, S.; Neumann, FJ Funkce krevních destiček u syndromů septické víceorgánové dysfunkce. Intensive Care Med. 1997, 23, 379–385.
12. Layios, N.; Delierneux, C.; Hego, A.; Huart, J.; Gosset, C.; Lecut, C.; Maes, N.; Geurts, P.; Joly, A.; Lancellotti, P.; a kol. Predikce sepse u kriticky nemocných pacientů podle markerů aktivace krevních destiček při příjmu na JIP: Prospektivní pilotní studie. Intensive Care Med. Exp. 2017, 5., 32.
13. Russwurm, S.; Vickers, J.; Meier-Hellmann, A.; Spangenberg, P.; Bredle, D.; Reinhart, K.; Losche, W. Aktivace destiček a leukocytů koreluje se závažností septické orgánové dysfunkce. Šok 2002, 17, 263–268.
14. Vanderschueren, S.; De Weerdt, A.; Malbrain, M.; Vankersschaever, D.; Frans, E.; Wilmer, A.; Bobbaers, H. Trombocytopenie a prognóza v intenzivní péči. Crit. Care Med. 2000, 28, 1871–1876.
15. Theofanis, E.; Semitekolou, M.; Morianos, I.; Sanitas, K.; Xanthou, G. Cílení na aktivaci zánětu NLRP3 u těžkého astmatu. J. Clin. Med. 2019, 8, 1615.
16. Haque, ME; Akther, M.; Jakaria, M.; Kim, IS; Azam, S.; Choi, DK Zacílení mikrogliálního zánětu NLRP3 a jeho role u Parkinsonovy choroby. MOV. Porucha. 2020, 35, 20–33.
17. Liu, L.; Dong, Y.; Ano, M.; Jin, S.; Yang, J.; Joosse, ME; Sun, Y.; Zhang, J.; Lazarev, M.; Brant, SR; a kol. Patogenní role aktivace zánětu NLRP3 při zánětlivých střevních onemocněních myší i lidí. J. Crohnova kolitida 2017, 11, 737–750.
18. Danielski, LG; Giustina, AD; Bonfante, S.; Barichello, T.; Petronilho, F. Inflammasom NLRP3 a jeho role ve vývoji sepse. Zánět 2020, 43, 24–31.
19. Luo, YP; Jiang, L.; Kang, K.; Fei, DS; Meng, XL; Nan, CC; Pan, SH; Zhao, MR; Zhao, MY Hemin inhibuje aktivaci zánětu NLRP3 při akutním poškození plic vyvolaném sepsí, které zahrnuje hemoxygenázu-1. Int. Immunopharmacol. 2014, 20, 24–32.

20. Měsíc, JS; Lee, S.; Park, MA; Siempos, II; Haslip, M.; Lee, PJ; Yun, M.; Kim, CK; Howrylak, J.; Ryter, SW; a kol. UCP2-indukovaná syntáza mastných kyselin podporuje aktivaci zánětu NLRP3 během sepse. J. Clin. Vyšetřování. 2015, 125, 665–680.

[PubMed]21. Gong, Z.; Zhou, J.; Li, H.; Gao, Y.; Xu, C.; Zhao, S.; Chen, Y.; Cai, W.; Wu, J. Kurkumin potlačuje aktivaci zánětu NLRP3 a chrání před LPS-indukovaným septickým šokem. Mol. Nutr. Food Res. 2015, 59, 2132–2142.
22. Wang, P.; Huang, J.; Li, Y.; Chang, R.; Wu, H.; Lin, J.; Huang, Z. Exogenní oxid uhelnatý snižuje akutní poškození ledvin vyvolané sepsí a inhibuje aktivaci zánětu NLRP3 u potkanů. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 20595–20608.
23. Kalbitz, M.; Fattahi, F.; Trailer, JJ; Jajou, L.; Malan, EA; Kámen, FS; Huber-Lang, M.; Russell, MW; Ward, komplement PA indukoval aktivaci srdečního zánětu NLRP3 v sepsi. FASEB J. 2016, 30, 3997–4006.
24. Bernard, GR; Vincent, JL; Laterre, PF; LaRosa, SP; Dhainaut, JF; Lopez-Rodriguez, A.; Steingrub, JS; Garber, GE; Helterbrand, JD; Ely, EW; a kol. a rekombinantní lidský protein CWEiSSsg. Účinnost a bezpečnost rekombinantního lidského aktivovaného proteinu C pro těžkou sepsi. N. Engl. J. Med. 2001, 344, 699-709.
25. Iba, T.; Thachil, J. Současnost a budoucnost antikoagulační terapie pomocí antitrombinu a trombomodulinu pro sepsí asociovanou diseminovanou intravaskulární koagulaci: Pohled z Japonska. Int. J. Hematol. 2016, 103, 253–261.
26. Cornelius, DC; Baik, CH; Travisi, OK; Bílá, DL; Young, CM; Austin Pierce, W.; Shields, CA; Poudel, B.; Williams, JM Aktivace zánětu NLRP3 v krevních destičkách v reakci na sepsi. Physiol. Rep. 2019, 7, e14073.
27. Cornelius, DC; Travisi, OK; Tramel, RW; Borges-Rodriguez, M.; Baik, CH; Greer, M.; Giachelli, CA; Tardo, GA; Williams, JM Inhibice zánětu NLRP3 zeslabuje aktivaci krevních destiček vyvolanou sepsí a zabraňuje multiorgánovému poškození při punkci slepého střeva. PLoS ONE 2020, 15, e0234039.
28. Asaduzzaman, M.; Lavasani, S.; Rahman, M.; Zhang, S.; Braun, OO; Jeppsson, B.; Thorlacius, H. Krevní destičky podporují plicní nábor neutrofilů při abdominální sepsi. Crit. Care Med. 2009, 37, 1389–1396.
29. Schrier, RW; Wang, W. Akutní selhání ledvin a sepse. N. Engl. J. Med. 2004, 351, 159–169.
30. Vincent, JL; Yagushi, A.; Pradier, O. Funkce krevních destiček při sepsi. Crit. Care Med. 2002, 30, S313–S317.
31. Liverani, E.; Rico, MC; Tsygankov, AY; Kilpatrick, LE; Kunapuli, SP Receptor P2Y12 moduluje zánět vyvolaný sepsí. Arter. Thromb. Vasc. Biol. 2016, 36, 961–971. [CrossRef]
32. Siner, JM; Bhandari, V.; Engle, KM; Eliáš, JA; Siegel, MD Zvýšené hladiny angiopoetinu 2 v séru jsou spojeny se zvýšením
úmrtnost při sepsi. Šok 2009, 31, 348–353.
33. Scherpereel, A.; Depontieu, F.; Grigoriu, B.; Cavestri, B.; Tsicopoulos, A.; Gentile, T.; Jourdain, M.; Pugin, J.; Tonnel, AB; Lassalle, P. Endocan, nový endoteliální marker u lidské sepse. Crit Care Med. 2006, 34, 532–537.
34. Valerio-Rojas, JC; Jaffer, IJ; Kor, DJ; Gajić, O.; Cartin-Ceba, R. Výsledky pacientů s těžkou sepsí a septickým šokem na chronické protidestičkové léčbě: historická kohortová studie. Crit. Care Res. Praxe. 2013, 2013, 782573.
35. Pill, J.; Issaeva, O.; Wonderer, S.; Sadick, M.; Kranzlin, B.; Fiedler, F.; Klotzer, HM; Kramer, U.; Gretz, N. Farmakologický profil a toxicita fluoresceinem značeného sinistrinu, nového markeru pro měření GFR. Naunyn-Schmiedebergův oblouk. Pharmacol. 2006, 373, 204–211.
36. Pill, J.; Kraenzlin, B.; Jander, J.; Sattelkau, T.; Sadick, M.; Kloetzer, HM; Deus, C.; Kraemer, U.; Gretz, N. Fluoresceinem značený sinistrin jako marker rychlosti glomerulární filtrace. Eur. J. Med. Chem. 2005, 40, 1056–1061.