Fytochemická analýza, In-vitro Antiproliferativní, Antioxidační Část 2
Apr 21, 2022
Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací
inhibiční test a-glukosidázy
Byla vytvořena série ředění frakcí, aby se získaly koncentrace 100,200, 300,400 a 500 mg/ml. Reakční směsi obsahovaly 0,1 ml 1U/ml roztoku glukosidázy smíchaného s 0,2 ml zředěného extraktu a 0,5 ml 100 mM fosfátového pufru, pH 6,8. Směsi byly inkubovány při 37 stupních po dobu 15 minut. Potom 0,2 ml 5 mM p-nitrofenylu-D-galaktopyranosidK reakční směsi byl přidán PNPG a inkubace byla prodloužena o další 20 min při 37 stupních. Reakce byla ukončena přidáním 0,1 M NazC03. Absorbance byla zaznamenána při vlnové délce 405 nm pro všechny vzorky. Akarbóza byla použita jako pozitivní kontrola ve stejných koncentracích jako rostlinné extrakty. Výsledky byly vyjádřeny jako procento inhibice podle následující rovnice:
kde Ag je absorbance bez enzymového inhibitoru a As je absorbance v přítomnosti enzymového inhibitoru [26].
Buněčné linie a MTS test
HeLa a MCF7 rakovinné buněčné linie byly získány z ATCC, buňky byly kultivovány v RPMI-1640 médiu doplněném 10 procentem fetálního hovězího séra, 1 procenta antibiotik penicilin/streptomycin a 1 procenta L-glutaminu. Buňky byly pěstovány ve zvlhčené atmosféře s 5 procenty CO2 při 37 stupních. Buňky byly nasazeny v množství 2,6 x 10* buněk/jamka na 96-jamkovou destičku. Po 48 hodinách byly buňky konfluentní, médium bylo vyměněno. Buňky byly poté inkubovány s různými koncentracemi listových frakcí v rozmezí od 0,0 25-10 mg/ml R. rothschildianus po dobu 24 hodin. Byla hodnocena životaschopnost buněk
pomocí testu CellTilter 96° Aqueous One Solution Cell Proliferation (MTS) podle pokynů výrobce (Promega Corporation, Madison, WI). Stručně řečeno, na konci ošetření bylo do každé jamky přidáno 20 ul MTS roztoku na 100 ul média a inkubováno při 37 stupních po dobu 2 hodin. Absorbance byly měřeny při 490 nm [27,28].
Statistická analýza
Všechny získané výsledky čtyř studovaných rostlinných frakcí (antioxidant, antilipáza,anti-amyláza, anti-glykosidáza, acytotoxicitaaktivity) byly vyjádřeny jako průměr ± SD standardní odchylka; výsledek byl považován za významný, když byla p-hodnota<0.05. data="" were="" compared="" using="" unpaired="">
Výsledek
Fytochemický screening
Výsledky předběžných fytochemických testů na vodných frakcích R. rothschildianus prokázaly přítomnost saponinu, fenolů, bílkovin, škrobu a flavonoidů. Metanolový extrakt vykazoval přítomnost komplexních polysacharidů, fenolů, proteinů a flavonoidů, zatímco v acetonové frakci byly pozorovány fenoly, taniny a flavonoidy a v hexanové frakci byly identifikovány fenoly, taniny a flavonoidy, glykosidy, terpenoidy a steroidy. jak je uvedeno v tabulce 1. Avšak pro proces extrakce methanol vykazoval nejvyšší procentuální výtěžek 29,4 procenta, následovaný acetonovou frakcí 16,5 procenta. Vodná extrakce poskytla 10,6 procenta, zatímco nejnižší výtěžek (7,3 procenta) byl v hexanové frakci (tabulka 2).
Kvantitativní analýza TPC, TFC a TTC Pro vyhodnocení TPC, TFC a TTC byly získány hodnoty absorpce (Abs) několika koncentrací kyseliny gallové, kyseliny rutinu a standardů katechinů (STD). byly získány tři rovnice pro každou STD versus její koncentrace pro výpočet celkového obsahu fenolu, flavonoidů a taninu v hexanu, acetonu, methanolu a vodném R. Frakce s Rothschildovou diagnózou jsou uvedeny v tabulce 3.
Cistanche může zlepšit imunitu
Antioxidační aktivita
Výsledky hodnocení aktivity vychytávání volných radikálů čtyř frakcí z listů R. rothschildianus za použití Troloxu jako účinné antioxidační standardní reference byly vyjádřeny jako procento inhibice DPPH (obr. 1 a tabulka 4). Listy R. rothschildianus by proto mohly být považovány za rostlinný zdroj antioxidantů a acetonové frakce, která vykazovala hodnotu ICso 6,3±0,4 ug/ml. Podobné výsledky byly také získány pro hexanovou frakci, která měla hodnotu IC50 7,9±1,3 ug/ml (tabulka 4). Výsledky byly porovnány s Troloxem, silnou antioxidační sloučeninou, s hodnotou rovnající se také 3,1±0,9 ug/ml. Naproti tomu vodná frakce vykazovala pouze mírnou antioxidační aktivitu s vyšší hodnotou IC50 19,9±0},7ug/ml, zatímco methanolový extrakt byl v tomto testu neaktivní.
Inhibiční aktivita lipázy
V tomto testu byla antiobezitní aktivita frakcí extraktu z listů R. rothschildianus porovnána s aktivitou
orlistat, silné činidlo inhibující lipázu (obr. 2 a tabulka 4). R. Listy rothschildianus byly vynikajícím alternativním přírodním zdrojem látek inhibujících lipázu. Acetonová frakce vykazovala hodnotu ICso 26,3±0,6ug/ml, což bylo velmi blízké hodnotě referenční sloučeniny orlistat （12,3±0,3ug/ml）. Hexanové a methanolové frakce zaznamenaly pouze střední hodnoty IC50, rovné 39,8±0,3ug/ml a 60,3±0,4ug/ml, v daném pořadí; zatímco vodná frakce byla neaktivní.
inhibiční aktivita a-amylázy
V tomto testu byla anti-amylázová aktivita frakcí extraktu z listů R. rothschildianus srovnávána s aktivitou akarbózy, silného inhibičního činidla a-amylázy (obr. 3). Acetonová frakce byla nejúčinnějším inhibitorem -amylázy s IC50 19.0±0,7 ug/ml, ve srovnání s 28,8 ± 1,2 ug/ml pro akarbózu, referenční sloučeninu. To naznačuje, že R. rothschildianus by mohl být účinným bylinným lékem na cukrovku. Vodná frakce v tomto testu vykazovala pouze mírnou aktivitu s hodnotou IC50 45,7 ±0,3 ug/ml, zatímco hexan měl hodnotu IC50 354,8±1,2 ug/ml. Methanolová frakce byla neaktivní proti enzymu -amyláze. také byly vypočteny hodnoty pro čtyři frakce (tabulka 4).
inhibiční aktivita a-glukosidázy
Výsledky pro a-glukosidázu byly porovnány s výsledky pro akarbózu, silné činidlo inhibující enzymy, a také byly vypočteny hodnoty pro čtyři frakce (tabulka 4 a obr. 4). Acetonová frakce vykazovala největší inhibiční účinek na -glukosidázu s IC50 54,9±0},3 ug/ml ve srovnání s akarbózou, referenční sloučeninou, při 37,1±{{10} },3 ug/ml. Naproti tomu frakce methanolového extraktu vykazovala pouze mírnou inhibici -glukosidázy s IC50 251,2 ± 0,4 ug/ml, zatímco hexanové a vodné frakce byly v tomto testu neaktivní.
Antiproliferační aktivita
Výsledky léčby rakovinných buněk HeLa a MCF7 pěti různými koncentracemi v mg/ml pro různé extrakty ukázaly, že aktivita proti rakovinné buněčné linii HeLa byla lepší než proti rakovinné buněčné linii MCF7. Hexanový extrakt byl však nejúčinnější
extrakt v koncentraci 4 mg/ml s procenty inhibice 98,9 a 97,4 procent proti HeLa a MCF7 rakovinným buněčným liniím, v daném pořadí, zatímco methanolový extrakt ve stejné koncentraci vykazoval silnou aktivitu proti HeLa a MCF7 rakovinným buněčným liniím s 97,2 a 95,6 procenty inhibice. Procentuální inhibice buněk HeLa při expozici frakcím z listů R. rothschildianus byla dokumentována ve srovnání s pozitivní kontrolou doxorubicinem (obr. 5a). Procento inhibice buněk MCF7 bylo podobně stanoveno pro čtyři frakce z listů R. rothschildianus ve srovnání s kontrolou (obr. 5b).
Diskuse
Test vychytávání radikálů DPPH je dobře známý jako jednoduchá metoda pro detekci antioxidační kapacity ve sloučeninách. DPPH je stabilní volný radikál, který dává fialovou barvu v alkoholových roztocích a po redukci v přítomnosti antioxidantů poskytujících vodík změní roztok na bezbarvý [29]. Listy R. rothschildianus by proto mohly být považovány za přirozený zdroj antioxidantů, zejména pro acetonovou frakci, která vykazovala hodnotu ICso 6,3±0,4ug/ml. Podobné výsledky byly také získány pro hexanovou frakci, která měla hodnotu IC50 7,9±1,3 ug/ml (tabulka 4). Výsledky byly porovnány s Troloxem, silnou antioxidační sloučeninou, s hodnotou rovnající se také 3,1±0,9 ug/ml. Naproti tomu vodná frakce vykazovala pouze mírnou antioxidační aktivitu, s vyšší hodnotou IC50 19,9±0,7 ug/ml, zatímco methanolový extrakt byl v tomto testu neaktivní. Tyto výsledky byly v souladu s přítomností fenolů a flavonoidů v rostlině, což je silný zdroj lapačů volných radikálů, jak je ukázáno u DPPH v této studii. Tyto výsledky byly v souladu s rozmanitostí fenolických sloučenin v rostlinách, jednoduchých fenolů, jako je kyselina gallová, a sofistikovanějších fenolových kyselin, jako jsou antokyany, deriváty hydroxylové kyseliny skořicové a flavonoidy. Všem těmto třídám sloučenin byla věnována značná pozornost kvůli jejich četným fyziologickým funkcím, zejména pohlcování volných radikálů, antimutagenním, protizánětlivým a antikarcinogenním aktivitám [30]. Jak je uvedeno v tabulce 3, acetonový extrakt zaznamenal nejvyšší obsah jak fenolických sloučenin, tak flavonoidů, 28,2 ± 0,8 mg GAE/ga 107,3 ± 4,6 mg RU/g, v daném pořadí. Předchozí zpráva o některých druzích Rumex nalezla fenolické sloučeniny v ethanolovém extraktu z listů Rumex vicarious L., které se pravděpodobně podílely na reakcích volných radikálů, redukujících stabilní použitý radikál DPPH na žlutavě zbarvený difenylpikrylhydrazinový derivát z jeho původní fialové barva [31].
R. rothschildianus leaves were an excellent alternative natural source of lipase inhibitory agents. The acetone fraction showed an ICso value of 26.3±0.6μg/ml, which was very close to that of the reference compound orlistat （12.3±0.3μg/ml）. Hexane and methanol fractions only re-corded moderate ICso values, equal to 39.8±0.3 μg/ml and 60.3±0.4μg/ml, respectively; while the aqueous fraction was inactive. Pancreatic lipase is a major enzyme involved in enterocyte triglyceride absorption. Therefore, its inhibition represents an important strategy in the management of obesity [32]. Plants rich in phenolic compounds have been screened in several reports for anti-lipase activity. Lipase inhibitory activity ranging from 40 to >70 procent bylo zjištěno in vitro testy u mnoha různých čeledí, včetně Solanaceae (Solanum tuberosum), Brassicaceae (Brassica nigra a Raphanus sativus), Rosaceae (Malus Domestica Borkh. a Filipendula ulmaria (L.) Maxim.),
(Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. a Ericaceae Vaccinium myrtillus L.) a Fabaceae (Pisum sativum L. a Phaseolus vulgaris L.)[33].
Acetonová frakce byla nejúčinnějším inhibitorem -amylázy s IC50 19.0±0,7 ug/ml, ve srovnání s 28,8 ± 1,2 ug/ml pro akarbózu, referenční sloučeninu. To naznačuje, že R. rothschildianus by mohl být účinným bylinným lékem na cukrovku. Vodná frakce v tomto testu vykazovala pouze mírnou aktivitu s hodnotou IC50 45,7 ±0},3 ug/ml, zatímco hexan měl hodnotu ICso 354,8 ± 1,2 ug/ml. Methanolová frakce byla neaktivní vůči -amyláze. Možným vysvětlením toho, že vodná frakce je dobrým inhibitorem enzymů, byla přítomnost saponinů. Dřívější vědecké výzkumy zjistily, že saponiny jsou bioaktivní proti cukrovce [34]. Silný účinek frakce acetonového extraktu proti amyláze může být způsoben vysokým obsahem jak fenolických sloučenin, tak flavonoidů. Odborníci na Corchorus olitorius -inhibiční účinky na amylázu a -glukosidázu díky složkám, zejména fenolickým sloučeninám, jako je kyselina kávová [35].
Acetonová frakce vykazovala největší inhibiční účinek na a-glukosidázu s IC50 54,9±0,3ug/ml ve srovnání s akarbózou, referenční sloučeninou, při 37,1±0,3ug/ml . Naproti tomu frakce methanolového extraktu vykazovala pouze mírnou inhibici a-glukosidázy s IC50 251,2±0,4ug/ml, zatímco hexanové a vodné frakce byly v tomto testu neaktivní. Třetí kategorie perorálních hypoglykemických činidel zahrnuje inhibitory -glukosidázy. Existuje celá řada inhibitorů -glukosidázy, jako je akarbóza a voglibóza, které se obvykle nacházejí v rostlinných zdrojích. Vykazují cennou stabilizaci hladiny glukózy v krvi po jídle a byly klinicky používány při léčbě diabetes mellitus [36, 37].
Výsledky léčby obou rakovinných buněk (HeLa a MCF7) různými koncentracemi v mg/ml pro různé extrakty ukázaly, že obecná aktivita proti rakovinné buněčné linii HeLa byla lepší než proti rakovinné buněčné linii MCF7. Hexanový extrakt vykázal silnou protirakovinnou aktivitu při koncentraci 4 mg/ml s procenty inhibice 98,9 a 97,4 procent proti rakovinným buněčným liniím HeLa a MCF7, zatímco methanolový extrakt ve stejné koncentraci vykazoval silnou aktivitu proti rakovinným buněčným liniím HeLa a MCF7 s 97,2 a 95,6 procenta inhibice. Z předchozích výsledků vykazovala hexanová frakce významný cytotoxický účinek na buňky HeLa i MCF7, přičemž procenta inhibice dosahovala 99 a 92,4 procent při koncentraci 4 mg/ml hexanové frakce. To bylo v souladu s cytotoxickými účinky terpenoidů i steroidů, které byly nalezeny v hexanové frakci. Bylo prokázáno, že diosgenin, přirozeně se vyskytující steroid a triterpenoid nacházející se v některých rostlinách, inhibuje rakovinu prsu [38, 39].
Závěr
Výsledky této studie na listech R. rothschildianus ukázaly, že frakce acetonového extraktu měla významný potenciál při poskytování fytoterapie diabetu a obezity na základě své silné inhibice lipázy, a-amylázy a a-glukosidázy. Navíc acetonová frakce také vykazovala významnou aktivitu pohlcování volných radikálů. Na druhou stranu hexanová frakce vykazovala významnou inhibici buněčných linií HeLa i MCF7, což by mohlo souviset s jejím vysokým obsahem terpenů a steroidů. Tato pozorování v této studii by mohla vést k dalším studiím in vivo k vývoji nových přírodních farmaceutických formulací účinných při léčbě obezity, diabetes mellitus a některých druhů rakoviny.
Tento článek je převzat z Jaradat et al. BMC Complementary Medicine and Therapes (2021) 21:107
