Jak oddělit Acteosid od Cistanche Tubulosa
Mar 24, 2022
Helin Xu a, Xueqin Li a,⇑ , Yanyan Hao a, Xiaobin Zhao a, Yun Cheng a, Jinli Zhang a,b
škola chemie a chemického inženýrství/Klíčová laboratoř pro zelené zpracování chemického inženýrství v Xinjiang Bingtuan, Univerzita Shihezi, Shihezi 832003, Čína
b Klíčová laboratoř pro zelenou chemickou technologii ministerstva školství, škola chemického inženýrství a technologie, Tianjin University, Tianjin 300072, Čína
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Abstraktní
Pro dosažení jednoduchého a účinného odděleníakteosid(ACT), extrakce ACT ze surových extraktů zCistanchetubulosaprostřednictvím iontové kapaliny (IL) na bázi vodného dvoufázového systému (ATPS). IL-ATPS obsahující [C4mim]BF4 a (NH4)2SO4 vykazuje vynikající extrakční výkon a extrahuje téměř veškerý ACT(Acteosid)v [C4mim]BF4-bohaté fázi. Vysoká polarita [C4mim]BF4 s receptory pro více vodíkových vazeb vede k extrakci ACT(Acteosid)ve fázi bohaté na IL a (NH4)2SO4 poskytuje nejen slabě kyselé mikroprostředí pro zvýšení stability ACT ve fázi bohaté na IL, ale také snižuje rozpustnost ACT(Acteosid)ve fázi bohaté na sůl prostřednictvím efektu vysolování. Výsledky molekulární simulace navíc ukazují, že je extrahován ve fázi bohaté na [C4mim]BF4- prostřednictvím více interakcí, včetně vodíkových vazeb, van der Waalsových sil a p–p vrstvení. Očekává se, že tato studie poskytne cennou referenci pro separaci bioaktivních složek od přírodních produktů.
klíčová slova:Iontové kapaliny, Sůl, Vodný dvoufázový systém, Extrakce,Akteosid
Úvod
Cistanchetubulosa(Orobanchaceae) je parazitická rostlina, která roste na kořenech Tamarix a Salvadory a je rozšířena především v suchých zemích a pouštích severozápadní Číny [1–3]. Stonky Cistanche tubulosa, známé jako „ženšen pouští“, jsou oficiálně zaznamenány v Čínském lékopisu (vydání 2015) [4,5] a jejich hlavními složkami jsou údajně fenylethanoidové glykosidy (PhG), polysacharidy a iridoidy.
PhG sloučeniny, skupina ve vodě rozpustných bioaktivních složek vCistanchetubulosamají společnou strukturu složenou ze skořicové kyseliny a hydroxyfenylethylových skupin, které jsou připojeny k b-glukopyranózové skupině prostřednictvím esterových a glykosidických vazeb [6].Akteosid(ACT) je hlavní složkou sloučenin PhG a je indexovou složkou pro stanovení obsahuCistanchetubulosa[7]. Moderní chemické a farmakologické studie prokázaly, že ACT(Acteosid)vykazuje četné farmakologické aktivity, jako je antioxidační, antiúnavová, neuroprotektivní a hepatoprotektivní [8–10]. ACT má tedy široké uplatnění v oblasti medicíny, zdravotnictví, potravinářství atd. Nicméně separace a čištění ACT(Acteosid)jsou obtížné kvůli složitému složení sloučenin PhG, které mají podobnou strukturu, polaritu a rozpustnost. Mezi hlavní metody separace a čištění ACT v současnosti patří molekulární imprinting, separace makroporézní adsorpční pryskyřice, vysokorychlostní protiproudá chromatografie a membránová separace. Například Liu a kol. použili makroporézní pryskyřice k oddělení PhG od Cistanche deserticola a Xu a kol. použili mezoporézní uhlíkové adsorbenty k adsorbci PhG a adsorpční kapacita dosáhla 358,09 mg/g. Tyto způsoby však mají četné nevýhody, jako je časová náročnost, složitý postup a nízká selektivita. Proto je velmi žádoucí vývoj jednoduché a účinné metody pro selektivní separaci bioaktivních složek z přírodních produktů.
mikronizovaná purifikovaná flavonoidní frakce
V posledních letech se vodní dvoufázový systém (ATPS), který lze provádět v mírném prostředí a je snadno škálovatelný [11–15], objevil jako nová technika extrakce kapalina-kapalina pro separaci bioaktivních složek [16 –19]. Podle složení lze ATPS rozdělit do tří typů, tj. na dva a více polymerů, polymer a sůl nebo na dva surfaktanty [20–23]. Téměř všechny polymery tvořící fázi však mají vysokou viskozitu a úzký rozsah polarity, které nevedou k přenosu hmoty a omezují selektivitu. V této souvislosti se iontové kapaliny (IL) vyznačují zanedbatelnou těkavostí, chemickou stabilitou, komplexní rozpustností pro organické sloučeniny a většina IL je šetrná k životnímu prostředí [24–28]. Tyto vlastnosti poskytují IL-APTS lepší výkon než jiné ATPS pro separaci bioaktivních složek. Ve srovnání s tradičním ATPS shromažďuje IL-ATPS výhody IL i ATPS, jako je rychlá separace fází, vysoký extrakční výkon a biokompatibilita s životním prostředím [12,29,30]. V současné době nebyl IL-ATPS aplikován na separaci a čištění ACT(Acteosid), ale bylo zjištěno, že IL-ATPS lze použít při extrakci a separaci polysacharidů [31], vanilinu [32], polysacharidů z aloe [33], ženšenových saponinů [11] atd. Například He et al. extrahované bioaktivní ženšenové saponiny pomocí IL-ATPS, což bylo prokázáno jako jednoduchá a účinná metoda pro extrakci ginsenosidů s vysokou účinností extrakce 99,5 procenta a rozdělovacím koeficientem 651. Gao et al. extrahovaný astaxanthin ve fázi bohaté na [P4448]Br za použití IL ATPS obsahujícího [P4448]Br a K3PO4 s účinností extrakce až 93,08 procenta [34]. Tyto výsledky ukazují, že IL-ATPS má potenciální aplikační vyhlídky pro separaci bioaktivních složek od přírodních produktů a lze očekávat dosažení vysoce selektivní separace ACT odCistanchetubulosa.
V této studii jednoduchá, účinná a zelená technika založená na extrakci ATPS pro vysoce selektivní separaci ACT(Acteosid)ze surových extraktůCistanchetubulosaje prozkoumána. Různé IL ([C4mim][CF3SO3], [C4mim]Cl, [C4mim]BF4, [C2mim]Br, [C4mim]Br, [C6mim]Br a [C8mim]Br) a typy solí (NaCl, Na2SO4, Na3C6H5O7 , (NH4)2SO4 a NaH2PO4) byly zkoumány za účelem stanovení optimálního IL-ATPS pro extrakci ACT(Acteosid). Kromě toho byly extrakční podmínky upraveny tak, aby bylo dosaženo vysoce selektivní separace ACT ve fázi bohaté na IL. Podrobně je diskutován vliv různých extrakčních podmínek (např. extrakční teplota, koncentrace IL, koncentrace roztoku vzorku, koncentrace soli, pH a doba extrakce) na extrakční výkon ACT. Dále byly provedeny molekulární simulace na ACT, [C4mim]BF4 a H2O, aby se odhalil mechanismus extrakce.
cistanche tubulosa vs deserticola
2. Experimentální
2.1. Materiály
Stonky zCistanchetubulosabyly dodány Cong Rongtang Biological Technology Co., Ltd. (Xinjiang, Čína). Standardy ACT(Acteosid)(čistota - 98 procent, obr. 1a) a echinakosid (čistota - 98 procent, obr. 1b) byly dodány společností Sunny Biotech Co., Ltd. (Shanghai, Čína). 1-Butyl-3-methylimidazoliumtrifluormethansulfonát ([C4mim][CF3SO3]), 1-butyl-3-methylimidazoliumchlorid ([C4mim]Cl), 1-butyl{ {13}}methylimidazoliumtetrafluorborát ([C4mim]BF4), 1-ethyl-3-methylimidazoliumbromid ([C2mim]Br), 1-butyl-3-methylimidazoliumbromid ([C4mim] Br), 1-hexyl-3-methylimidazoliumbromid ([C6mim]Br) a 1-oktyl-3-methylimidazoliumbromid ([C8mim]Br) byly dodány společností Chengjie Chemical Co. , Ltd. (Shanghai, Čína). Síran amonný analytické čistoty ((NH4)2SO4), dihydrogenfosforečnan sodný (NaH2PO4), síran sodný (Na2SO4), hydrogenfosforečnan sodný (Na2HPO4), hydrogenfosforečnan draselný (K2HPO4), chlorid sodný (NaCl) a bezvodý citran trisodný (Na3C6H5O7 ) byly dodány společností Shengao Chemical Reagent Co., Ltd. (Tianjin, Čína). Methanol, kyselina octová a acetonitril chromatografické čistoty byly dodány společností Aladdin Chemical Co., Ltd. (Shanghai, Čína). Ethanol analytické čistoty dodal Fuyu Fine Chemical Co., Ltd. (Tianjin, Čína).
Obr. 1. Chemické struktury (a)akteosid(ACT) a (b) enchinakosid.
2.2. Příprava surových extraktů Cistanche tubulosa
Vzorek v práškuCistanchetubulosa(20 mg) bylo namočeno do 50}0 ml 50% ethanolového roztoku s ultrazvukem po dobu 2 hodin. Zbytek v roztoku byl oddělen centrifugací při rychlosti 5000 ot./min. po dobu 10 minut. Supernatant po centrifugaci byl postupně filtrován pomocí 0,45 a 0,22 um filtrů. Poté byl filtrát zahuštěn a vysušen při 323 K ve vakuové sušárně. Nakonec se vysušený produkt rozpustil ve vodě a přidal se červenohnědý extraktCistanchetubulosabylo získáno.
2.3. Extrakce ACT(Acteosid)od IL-ATPS
Schéma pro účinnou extrakci ACT(Acteosid)pomocí IL-ATPS je znázorněno na obr. 2. V souladu s tím bylo 3,75 ml [C4mim]BF4, 3,5 ml destilované vody, 11,11 % hmotn. soli a 10 ml roztoku vzorku se stejnou koncentrací ACT a echinakosidu přidán do 50 ml centrifugační zkumavky. Další IL-ATPS se stejnými složkami kromě roztoku vzorku byl připraven jako kontrastní systém. Sůl IL-ATPS byla zcela rozpuštěna ultrazvukem a tvorba dvou čirých fází byla urychlena centrifugací při 8000 ot./min. po dobu 8 minut. Spodní fáze IL-ATPS byla fáze bohatá na IL a horní fáze byla fáze bohatá na sůl. Složky obou fází byly kvantitativně analyzovány vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC).
Koncentrace ACT(Acteosid)a echinakosid ve dvou fázích byl stanoven pomocí HPLC a účinnost extrakce byla hodnocena účinností extrakce (E, procenta), rozdělovacím koeficientem (K) a selektivitou (S). Následující Eq. K výpočtu K byla použita rovnice (1).
K=Cb/Ct (1)
kde Cb a Ct (mg/ml) je ACT(Acteosid)koncentrace ve spodní a horní fázi. Eqs. (2) a (3) byly použity pro výpočet E a S, v daném pořadí.
E=Cb*Vb/Mv*100 procent (2)
S=K/Kt=Cb*Cet / Ct*Ceb (3)
kde mv (mg) je hmotnost ACT(Acteosid)v roztoku vzorku je Vb (ml) objem ve spodní fázi a koncentrace Cet a Ceb echinakosidu v horní a spodní fázi (mg/ml), v daném pořadí.
Obr. 2. Schéma účinné extrakce ACT pomocí IL-ATPS
2.4. Selektivní experimenty
AKT(Acteosid)a echinakosid jsou považovány za konkurenty pro hodnocení selektivity IL-ATPS vůči ACT(Acteosid)kvůli podobné molekulární struktuře a chemickým vlastnostem ACT(Acteosid)a echinakosid. 3,75 ml[C4mim]BF4, 3,5 ml destilované vody, 11,11 % hmotn. soli a 10 ml roztoku vzorku se stejnou koncentrací ACT a echinakosidu bylo přidáno do 50ml centrifugační zkumavky. Sůl IL-ATPS byla zcela rozpuštěna ultrazvukem a tvorba dvou čirých fází byla urychlena centrifugací při 8000 ot./min. po dobu 8 minut. Spodní fáze IL-ATPS byla fáze bohatá na IL a horní fáze byla fáze bohatá na sůl. Složky obou fází byly kvantitativně analyzovány pomocí HPLC.
2.5. HPLC analýza
Koncentrace roztoku vzorku ve dvou fázích byla analyzována pomocí HPLC (2695, Waters Co., USA) s kolonou C18 při 330 nm za použití ultrafialového detektoru. Pro separaci a detekci vzorků při teplotě kolony 303 K byla přijata metoda gradientové eluce. Mobilní fáze byly (a) acetonitril a (b) kyselina octová/voda (1:44, obj./obj.) a průtok byl nastavena na 1 ml/min. Mobilní fáze a vzorky byly před nástřikem filtrovány přes 0,22 lm filtr. Všechny experimenty byly provedeny třikrát a na všech obrázcích je uveden chybový pruh.
2.6. Charakterizace
ACT, [C4mim]BF4 a fáze bohatá na [C4mim]BF4- byly analyzovány infračervenou spektroskopií s Fourierovou transformací (FTIR) za použití Bruker Vertex 70 (Bruker Optics, Ltd., Německo). FTIR spektra ACT, [C4mim]BF4 a fáze bohaté na [C4mim]BF4- byla získána od 4000 do 500 cm1 s rozlišením 2 cm1 za použití bromidu draselného jako reference.
2.7. Molekulární simulace
Abychom získali přehled o mechanismu extrakce IL-ATPS, stejně jako o režimech interakcí mezi ACT a [C4mim]BF4 v IL ATPS, byly provedeny výpočty prvního principu založené na teorii funkce hustoty (DFT). Optimalizace a jednobodové energetické výpočty byly provedeny pomocí funkcionálu M06–2X [35,36] a k popisu atomů C, H, F, B, N a O byla použita základní sada 6–31 plus G (d). [37]. Pro přesnou simulaci slabých interakcí byla pro adekvátní popis disperzních interakcí použita metoda DFT– D3 [38]. Podle předchozích zpráv [39] byly molekulární simulace provedeny na ACT, [C4mim]BF4 a H2O. Nejprve byly optimalizovány jednotlivé konformace modelů ACT a [C4mim]BF4 a poté byla optimalizována vazebná konformace [C4mim]BF4 a ACT na základě jejich optimální individuální konfigurace.
Vazebné energie (DE) ACT(Acteosid)a [C4mim]BF4 a vazebné energie (DE) ACT a H2O byly hodnoceny pomocí Eqs. (4) a (5), v tomto pořadí.
△E = Ecom- (EAKTplus EIL)
△E = Ecom - (EH2O plus EAKT)
kde EH2O, EACT, EIL a Ecom jsou potenciální energie ACT(Acteosid)[C4mim]BF4, H2O, respektive jejich komplexy. Všechny výpočty byly provedeny pomocí programu Gaussian16 [40] a všechny molekuly byly nakresleny pomocí softwaru VMD v.1.9.3. Mezitím byl vytvořen nezávislý gradientní model (IGM) pro identifikaci a kvantifikaci čistého zeslabení gradientu elektronové hustoty v softwaru Multiwfn v.3.5.
AkteosidvCistanche tubulosa
3. Výsledky a diskuse
3.1. Optimalizace IL-ATPS
3.1.1. Screening IL
Pro vyhodnocení vlivu typu IL na extrakční výkon v IL-ATPS bylo vybráno sedm druhů IL s různými kationty a anionty jako fázotvorné složky pro extrakci ACT.(Acteosid). Jak je znázorněno na obr. 3 (a), interakce mezi anionty ACT a IL byla zkoumána zkoumáním kombinace [C4mim] plus jako kationtu s různými anionty včetně Br-, Cl-, [CF3SO3] - a BF{{7 }}. Výsledky ukázaly, že anionty IL zvýšily ACT(Acteosid)extrakční výkon v pořadí BF4- > [CF3SO3] - > Br- > Cl- . Optimální IL anion byl BF4, což lze přičíst skutečnosti, že odpovídající IL může poskytnout více receptorů vodíkových vazeb pro hydroxylové skupiny ACT(Acteosid)než jiné anionty IL [21]. To naznačuje, že vodíková vazba je hlavní interakcí mezi anionty IL a ACT.
Dále byla zkoumána kombinace Br s různými kationty včetně [C2mim] plus, [C4mim] plus, [C6mim] plus a [C8mim] plus, aby se prozkoumala optimální sterická konfigurace mezi ACT(Acteosid)a ILscations. Výsledky ukázaly, že ACT(Acteosid)extrakční výkon se zvyšoval s klesající délkou alkylového řetězce z [C8mim] plus na [C2mim] plus . Protože [C2mim] plus nevytvořil odpovídající-ATPS s BF4, byl jako optimální kationt IL vybrán [C4mim] plus
To lze přičíst vysoké polaritě krátkého alkylového řetězce [C4mim] plus, což bylo přínosné pro rozpouštění ACT(Acteosid)a jeho extrakci ve fázi bohaté na IL. Imidazolový kationt [C4mim] plus má navíc aromatický p systém, který může vytvářet interakce p–p s benzenovým kruhem ACT pro dosažení optimální stereo konfigurace. Proto byl [C4mim]BF4 zvolen jako optimální pro následující experimenty.
3.1.2. Screening solí
Vyhodnotit účinek typu soli na ACT(Acteosid)extrakční výkon, bylo vybráno pět druhů solí (NaH2PO4, (NH4)2SO4, Na2S04, NaCl a Na3C6H5O7) pro vytvoření IL-ATPS s [C4mim]BF4 a výsledky jsou ukázány na obr. 3 (b). Sůl lze rozdělit na kyselé (NaH2PO4 a (NH4)2SO4), neutrální (Na2SO4 a NaCl) a zásadité (Na3C6H5O7) soli. Z obr. 3 (b) je vidět, že (NH4)2SO4 poskytuje IL-ATPS s vynikajícím výkonem extrakce ACT. Výsledek ukazuje, že rozdíl v účinnosti extrakce, rozdělovacím koeficientu a selektivitě souvisí se stabilitou ACT(Acteosid)v různých extrakčních mikroprostředích.
Obr. 3. Screening ATPS. (a) Typy IL a (b) typy solí
Glykosidy kyselých fenolů ACT jsou stabilní ve slabě kyselých systémech. Protože (NH4)2SO4 je kyselá sůl, může poskytovat slabě kyselé mikroprostředí pro IL-ATPS. To přispívá ke zvýšení účinnosti extrakce a udržení stability ACT(Acteosid)ve fázi bohaté na IL. Kromě toho, schopnost vysolování různých typů solí byla odlišná od schopnosti (NH4)2SO4, byla silnější než schopnost NaH2PO4 [24,41]. Sůl (NH4)2SO4 soutěží s ACT(Acteosid)pro molekuly H2O ve fázi bohaté na sůl, čímž se sníží rozpustnost ACT ve fázi bohaté na sůl, a ACT může být účinně extrahován ve fázi bohaté na IL. V následujících experimentech byl tedy jako optimální sůl vybrán (NH4)2SO4.
3.2. Optimalizace extrakčních podmínek v IL–ATPS
3.2.1. Vliv teploty extrakce
Podle předchozích studií [42] má extrakční teplota významný vliv na extrakční výkon pro bioaktivní složky v IL-ATPS, nízká teplota je pro tvorbu IL-ATPS výhodnější. Obr. 4 (a) představuje vliv [C4mim] BF4-(NH4)2SO4 jako IL-ATPS s extrakční teplotou v rozmezí 278–318 K na extrakční výkon ACT(Acteosid). Obr. 4 (a) ukazuje, že účinnost extrakce, rozdělovací koeficient a selektivita klesaly se zvyšující se teplotou extrakce, což naznačuje, že vysokoteplotní podmínky nebyly vhodné pro extrakci ACT v IL-ATPS.
Důvod byl připisován především tomu, že účinek vysolování byl oslaben a byl důsledkem toho, že voda ve fázi bohaté na IL byla převedena do fáze bohaté na sůl v IL-ATPS při vysokých extrakčních teplotách [42]. Kromě toho experimentální studie ukázala, že vysoká extrakční teplota nevedla ke stabilní existenci ACT(Acteosid). Optimální extrakční teplota byla stanovena na 278 K
3.2.2. Vliv koncentrace [C4mim]BF4
Obr. 4 (b) ukazuje účinek koncentrace [C4mim]BF4 od 20 do 60 % hmotn. na extrakční výkon pro ACT.(Acteosid)v IL-ATPS. Jak je znázorněno na obr. 4 (b), výkon extrakce ACT se zjevně zvýšil, když se koncentrace [C4mim]BF4 zvýšila z 20 na 50 % hmotn. Extrakční výkon se však mírně snížil, když se koncentrace [C4mim]BF4 zvýšila z 50 na 60 % hmotn. Vysoká koncentrace [C4mim]BF4 tedy vedla k extrakci ACT ve fázi bohaté na [C4mim]BF4-, ale nadměrná koncentrace [C4mim]BF4 nad 50 % hmotn. vedla ke snížení účinnosti extrakce ACT.
To je s největší pravděpodobností způsobeno zvýšením rozpustnosti ACT ve fázi bohaté na [C4mim]BF4- při vysoké koncentraci [C4mim]BF4 díky vysoké afinitě mezi ACT a [C4mim]BF4. ACT byl tedy snadno extrahován ve fázi bohaté na [C4mim]BF4- zvýšením koncentrace [C4mim]BF4. Avšak nad koncentrací [C4mim]BF4 50 % hmotn. se viskozita IL-ATPS zvýšila, což mělo za následek špatný přenos hmoty pro extrakci. Optimální koncentrace [C4mim]BF4 pro extrakci ACT tedy byla 50 % hmotn.
3.2.3. Vliv koncentrace roztoku vzorku
Důležitou podmínkou pro ACT byla koncentrace roztoku vzorku(Acteosid)extrakce. Obr. 4 (c) ukazuje vliv koncentrace roztoku vzorku na účinnost extrakce, rozdělovací koeficient a selektivitu, což může odrážet migrační schopnost ACT mezi horní a spodní fází. Obr. 4 (c) ukazuje, že účinnost extrakce, rozdělovací koeficient a selektivita ACT(Acteosid)se zvýšil se zvyšující se koncentrací roztoku vzorku z {{0}},5 na 2,5 mg/ml. Výkon extrakce ACT se však mírně snížil s dalším zvýšením koncentrace roztoku vzorku z 2,5 na 3,0 mg/ml. Vysoká koncentrace roztoku vzorku podporovala rozpustnost ACT(Acteosid)v [C4mim]BF4-bohaté fázi díky silné afinitě mezi ACT a [C4mim]BF4.
Pokles extrakčního výkonu lze připsat následujícím důvodům: Na jedné straně nadměrné zvýšení koncentrace roztoku vzorku nezlepšilo extrakční výkon IL-ATPS, když již byla bohatá fáze [C4mim]BF4- nasycený v ACT. Na druhé straně zvýšení koncentrace roztoku vzorku způsobilo zvýšení intramolekulárních vodíkových vazeb a agregaci ACT(Acteosid)molekul, což nevedlo k přenosu hmoty. Optimální koncentrace roztoku vzorku byla tedy stanovena na 2,5 mg/ml.
3.2.4. Vliv koncentrace (NH4)2SO4
Vliv různých koncentrací (NH4)2SO4 na účinnost extrakce, rozdělovací koeficient a selektivitu ukazuje obr. 4 (d). Experimentální výsledek ukázal, že tyto tři parametry rostly se zvyšující se koncentrací (NH4)2SO4 z 2,22 na 11,11 % hmotn. Výkon extrakce ACT se však snížil s dalším zvýšením koncentrace roztoku vzorku z 11,11 na 16,66 % hmotn.
To lze přičíst efektu vysolování, což je klíčová vlastnost pro extrakci ACT(Acteosid)in the [C4mim]BF4-rich phase. The increase in (NH4)2SO4 concentration can increase the salting-out effect, resulting in a decrease in the solubility of ACT in the(NH4)2SO4–rich phase, which favors ACT extraction in the [C4mim]BF4-rich phase. However, an excessive increase in the(NH4)2SO4 concentration (>11,11 % hmotn.) vedlo ke snížení obsahu vody ve fázi bohaté na [C4mim]BF4-, což by oslabilo její afinitu k ACT. To způsobilo snížení účinnosti extrakce, rozdělovacího koeficientu a selektivity. Optimální koncentrace (NH4)2SO4 tedy byla 11,11 % hmotn.
3.2.5. Vliv pH
Vliv pH na ACT(Acteosid)účinnost extrakce, rozdělovací koeficient a selektivita v IL-ATPS byly zkoumány v rozmezí pH 2.0–7.0. Jak je vidět na obr. 4 (e), tři parametry extrakce se zvýšily se zvýšením pH z 2.0 na 6.0. Výkon extrakce se však snížil při pH 7.{11}}
Na jedné straně jsou glykosidy kyselých fenolů ACT(Acteosid)by byl stabilní v kyselém prostředí, zatímco v alkalických roztocích by byl disociován [6]. Na druhé straně ACT může podléhat ionizaci podle rovnováhy HA $ H plus plus A při různých hodnotách pH [33], přičemž jde o neionizovanou formu, která má tendenci vstupovat do fáze bohaté na IL, preferované za kyselých podmínek. Extrakce by tedy měla být prováděna ve středně kyselém prostředí při optimálním pH 6.
3.2.6. Vliv doby extrakce
Vliv doby extrakce na ACT(Acteosid) extraction efficiency, partition coefficient, and selectivity were explored in the range of 10–200 min. As can be seen from Fig. 4 (f), the ACT extraction performance increased with the extraction time, and the maximum extraction efficiency (>99%), partition coeffificient (>35), and selectivity (>225) byly získány po 130 minutách. Kromě toho ACT(Acteosid)bylo zjištěno, že je stabilní ve slabě kyselém mikroprostředí po dlouhou dobu. Proto byla jako optimální doba extrakce zvolena 130 min.
3.3. Mechanismus extrakce ACT pomocí [C4mim]BF4–(NH4)2SO4 ATPS
3.3.1. FTIR analýza
Obr. 5 ukazuje FTIR spektra ACT(Acteosid), [C4mim]BF4 a [C4mim]BF4-bohatá fáze. Jak je ukázáno na FTIR spektru [C4mim] BF4, píky při 3162 a 3122 cm1 lze připsat symetrické natahovací vibraci CAH a asymetrické natahovací vibraci CAH z imidazolu, v daném pořadí. Pás na 1012 cm 1 lze přiřadit natahovací vibraci BF4-.
V FTIR spektru [C4mim]BF4-bohaté fáze se neobjevily žádné nové píky ve srovnání s FTIR spektry ACT(Acteosid)a [C4mim]BF4. Charakteristický pík BF4- na 1012 cm- 1 se však přesunul na vyšší frekvenci v důsledku vodíkové vazby mezi ACT a atomy F. Navíc se charakteristické píky CAH na 3162 a 3122 cm 1 posunuly k nižším frekvencím. To lze přičíst dvěma důvodům: (1) vytvoření vodíkové vazby mezi ACT a atomem N v [C4mim] plus a (2) vytvoření p–p vrstvení mezi benzenovým kruhem ACT a imidazolovým kruhem z [C4mim] plus . Tento výsledek byl v souladu s výsledky molekulární simulace.
Obr. 5. FTIR spektra ACT, [C4mim]BF4 a [C4mim]BF4-bohaté fáze.
3.3.2. Molekulární simulace
Prozkoumat extrakční mechanismus, možné způsoby interakce mezi ACT(Acteosid)a [C4min] plus, BF4- a H2O byly zkoumány pomocí molekulárních simulací. Obr. 6 ukazuje optimální režimy interakce a vazebnou konformaci ACT–[C4min] plus, ACT–BF4 a ACT–H2O. Jak je znázorněno na obr. 6a–h, ACT a [C4mim] plus vykazovaly dvě optimální konformace vazby, tj. ACT–[C4mim] plus –1 a ACT–[C4mim] plus –2, ACT a BF4 měly jednu optimální konformaci vazby , ACT–BF4- a ACT a H2O měly pět optimálních vazebných konformací ACT–H2O–1, ACT–H2O–2, ACT–H2O–3, ACT–H2O–4 a ACT–H2O–5.
Dále, vazebná energie může být použita k vysvětlení interakcí mezi dvěma molekulami. Podle výsledků molekulární simulace jsou vazebné energie ACT–[C4mim] plus –1, ACT–[C4mim] plus –2, ACT–BF4, ACT–H2O–1, ACT–H2O–2, ACT–H2O–3 , ACT–H2O–4 a ACT–H2O–5 byly - 129,71, - 136,53,-130,82, - 60,78, - 53 .00, - 76,76, -66,55, respektive -53,49 kJ/mol. Tyto hodnoty naznačují, že vazebná energie s [C4mim]BF4 byla silnější než vazebná energie molekul H2O. ACT měl tedy vysokou afinitu k [C4mim]BF4 a snadno vstoupil do fáze bohaté na [C4mim]BF4.
Pro další zkoumání interakcí mezi různými molekulami byly pomocí analýzy IGM ilustrovány způsoby interakce ACT–[C4min] plus, ACT–BF4- a ACT–H2O. Jak je znázorněno na obr. 6a a b, interakce mezi ACT(Acteosid)a [C4mim] plus zahrnovaly hlavně vodíkové vazby a van der Waalsovy síly. Navíc ACT–[C4mim] plus –1 a ACT–[C4mim] plus –2 vykazovaly podobné konformační charakteristiky, přičemž benzenový kruh ACT a imidazolový kruh [C4mim] plus byly vzájemně rovnoběžné a umístěné ve vzdálenosti asi 4 Á. To naznačuje existenci interakce skládání aplikací mezi ACT(Acteosid)a [C4mim] plus [43]. Obr. 6c ukazuje přítomnost silných vodíkových vazeb a van der Waalsových interakcí mezi ACT a BF4-. Navíc, jak je znázorněno na obr. 6d–h, když byl ACT rozpuštěn v H2O, molekuly ACT a H2O byly vázány hlavně vodíkovými vazbami a van der Waalsovou. Na základě konformačních charakteristik a hodnot vazebné energie lze tedy usuzovat, že ACT byl extrahován ve fázi bohaté na [C4mim]BF4- prostřednictvím vodíkových vazeb, van der Waalsových interakcí a p-p vrstvení.
Obr. 6. Analýza IGM interakcí ACT–[C4min] plus, ACT–BF4- a ACT–H2O: (a) ACT–[C4mim] plus –1, (b) ACT–[C4mim] plus –2, (c) ACT–BF4, (d) ACT–H2O–1, (e) ACT–H2O–2, (f)ACT–H2O–3, (g) ACT–H2O–4 a (h ) ACT–H2O–5.
3.4. Extrakce surového extraktu
Za optimálních extrakčních podmínek byl IL-ATPS použit ke zkoumání extrakce surového extraktu. Jak je uvedeno v tabulce 1, IL-ATPS může účinně extrahovat ACT(Acteosid)ze surového extraktu zCistanchetubulosado fáze bohaté na IL a IL-ATPS nemá téměř žádnou změnu v extrakčním výkonu ACT(Acteosid)ze surového extraktu ve srovnání s extrakčním výkonem standardního roztoku. Proto tato metoda může účinně extrahovat ACT(Acteosid)ze surového extraktuCistanchetubulosa, který může v budoucnu poskytnout referenci pro extrakci bioaktivních složek.
3.5. Separace ACT z fáze bohaté na IL
Metody extrakce rozpouštědlem a adsorpce pro získání ACT(Acteosid)a opětovné použití IL jsou prozkoumány v této části. Nejprve byla pro zpětnou extrakci zvažována organická rozpouštědla, jako je n-butanol (NBA), ethylacetát (EA), isopentenyl (IPA) a chloroform (CR). Účinnost regenerace organických extraktantů však byla nízká, jak je znázorněno na obr. 7. Navíc bylo pro zpětnou extrakci použito velké množství těkavých organických extraktantů, což ovlivní „zelenou“ vlastnost separačního procesu.
Pro separaci ACT byla zvolena adsorpční metoda(Acteosid)z fáze bohaté na IL, jako je uspořádaný mezoporézní uhlík (CMK-3), grafen (GR) a uhlíkové nanotrubice s jednou stěnou (SWCNT). Fáze bohatá na IL po extrakci IL-ATPS byla zředěna 10krát deionizovanou vodou. Účinnosti regenerace výše uvedených tří adsorbentů byly porovnány pro ACT za stejných adsorpčních podmínek následovně: poměr pevná látka-kapalina 1:1 (mg/ml), 303 K a 12 hodin.
Jak ukazuje obr. 7, obnova SWCNT byla lepší než u CMK-3 a GR. Navíc desorpční účinnost ACT(Acteosid)může dosáhnout 95,3 procenta při použití methanolu, kyseliny octové a ultračisté vody s objemovým poměrem 1:1:8 při 318 K. Proto lze SWCNT použít pro získání ACT z fáze bohaté na IL.
Obr. 7. Vliv typu s různými extrakčními činidly a adsorbenty na separaci ACT(Acteosid)z fáze bohaté na IL.
4. závěr
V této studii jednoduchá a účinná metoda založená na IL-ATPS pro extrakci ACT(Acteosid)ze surových extraktůCistanche tubulosabyl úspěšně vyvinut. Optimální IL-ATPS byla stanovena jako [C4mim]BF4–(NH4)2SO4 a optimální extrakční podmínky byly extrakční teplota 278 K, koncentrace IL 50 % hmotn., koncentrace roztoku vzorku 2,5 mg/ml, koncentrace soli 11,11 % hmotn., pH 6,0 a doba extrakce 130 min. Za optimálních extrakčních podmínek účinnost extrakce, rozdělovací koeficient a selektivita ACT(Acteosid)bylo zjištěno, že je 99,78 procenta ± 0,84 procenta, 33,82 ± 1,82 a 230,51 ± 8,26, v tomto pořadí. Závěrem tedy lze říci, že systém [C4mim]BF4-(NH4)2SO4 nabízí jednoduchou a účinnou metodu pro vysoce selektivní separaci ACT od surových extraktůCistanchetubulosa. Kyselá sůl (NH4)2SO4 poskytuje slabě kyselé mikroprostředí pro zajištění stability ACT(Acteosid)v [C4mim]BF4-bohaté fázi. Kromě toho vysoká polarita [C4mim]BF4 s receptory pro více vodíkových vazeb vede k extrakci ACT ve fázi bohaté na [C4mim]BF4-. Nakonec se ukázalo, že interakce ACT a [C4mim]BF4 zahrnují vodíkové vazby, van der Waalsovy síly a p–p stohování. Tato studie poskytuje poznatky pro budoucí výzkum vysoce selektivní separace fenolických sloučenin z přírodních rostlin.
prohlášení o autorském příspěvku CRediT
Helin Xu: Konceptualizace, Metodologie, Vyšetřování, Správa dat, Psaní – originální návrh, Psaní – recenze a úpravy. Xue qin Li: Konceptualizace, Administrace projektu, Psaní - recenze & editace, Supervize. Yanyan Hao: Správa dat, Psaní – kontrola a úpravy. Xiaobin Zhao: Zdroje, formální analýza. YunCheng: Zdroje, formální analýza. Jinli Zhang: Správa projektu, Psaní - recenze a úpravy.
Prohlášení o konkurenčním zájmu
Autoři prohlašují, že nemají žádné známé konkurenční finanční zájmy nebo osobní vztahy, které by se mohly zdát ovlivnit práci uvedenou v tomto článku.
Poděkování
Tato práce byla podpořena Regionálním vědeckým fondem Čínské národní přírodní vědecké nadace [číslo grantu22068032]; National Natural Science Foundation for Young Scientists of China [číslo grantu 21706166]; Program pro mladé a střední věkové lídry v oblasti vědeckých a technologických inovací v Bingtuanu [číslo grantu 2019CB024]; program pro mladé inovativní talenty univerzity Shihezi [číslo grantu CXRC201802] a hlavní vědeckotechnický projekt v Xinjiang Bingtuan[číslo grantu 2017AA007/01]. Rádi bychom poděkovali Analytickému a testovacímu centru Univerzity Shihezi za mikroskopii a mikroanalýzu našich vzorků.
antokyan
Reference
[1] X. Wang, X. Wang, Y. Guo, Rychle simultánní stanovení šesti účinných složek vCistanchetubulosapomocí blízké infračervené spektroskopie, Molecules 22 (2017) 843, https://doi.org/10.3390/molecules22050843.
[2] Y. Yan, Q. Song, X. Chen, J. Li, P. Li, Y. Wang, T. Liu, Y. Song, P. Tu, Simultánní stanovení složek s širokými rozsahy polarity a obsahu vCistanchetubulosapoužitím sériově připojené chromatografie s hydrofilní interakcí s reverzní fází a tandemové hmotnostní spektrometrie, J. Chromatogr. 1501 (2017) 39–50
[3] W. Zhang, J. Huang, W. Wang, Q. Li, Y. Chen, W. Feng, D. Zheng, T. Zhao, G. Mao, L. Yang, X. Wu, Extrakce, čištění , charakterizace a antioxidační aktivity polysacharidů zCistanchetubulosa, Int. J. Biol. Macromol. 93 (2016) 448–458,
[4] Y. Song, Q. Song, J. Li, N. Zhang, Y. Zhao, X. Liu, Y. Jiang, P. Tu, Integrovaná strategie kvantitativního rozlišení chemomu mezi Cistanche deserticola a C. tubulosa pomocí vysokoúčinná kapalinová chromatografie – hybridní trojitý kvadrupól-lineární iontová past hmotnostní spektrometrie, J. Chromatogr. 1429 (2016) 238–247
[5] W. Pei, R. Guo, J. Zhang, X. Li, Extrakce fenylethanoidových glykosidů zCistanche tubulosavysokorychlostní smykovou homogenizační extrakcí, J. AOAC Int. 102 (2019) 63–68
[6] H. Xu, W. Pei, X. Li, J. Zhang, Vysoce účinná adsorpce fenylethanoidních glykosidů na mezoporézním uhlíku, Front. Chem. 7 (2019)
[7] PL Liao, CH Li, LS Tse, JJ Kang, YW Cheng, posouzení bezpečnostiCistanchetubulosamemoregain produktu zdravé výživy: genotoxicita a 28-denní test toxicity po opakovaných dávkách, Food Chem. Toxicol. 118 (2018) 581–588
[8] YJ Shiao, MH Su, HC Lin, CR Wu, Echinacoside zmírňuje poruchy paměti a cholinergní deficit vyvolané amyloid-beta peptidy prostřednictvím inhibice ukládání amyloidu a toxikologie, Food Funct. 8 (2017) 2283–2294
[9] H. Shimada, Y. Urabe, Y. Okamoto, Z. Li, A. Kawase, T. Morikawa, P. Tu, O. Muraoka, M. Iwaki, Major constituents ofCistanchetubulosa, echinakosid aakteosidinhibují sodík-dependentní kotransportér glukózy 1-zprostředkovaný vychytáváním glukózy buňkami střevního epitelu, J. Funct. Potraviny 39 (2017) 91–95
[10] W. Li, R. Deng, X. Jing, J. Chen, D. Yang, J. Shen,Akteosidzlepšuje experimentální autoimunitní encefalomyelitidu prostřednictvím inhibice aktivace mitofágie zprostředkované peroxynitritem, Free Radicals Biol. Med. 146 (2020) 79–91,
[11] A. He, B. Dong, X. Feng, S. Yao, Extrakce bioaktivních saponinů ženšenu pomocí vodných dvoufázových systémů iontových kapalin a solí, Sep. Purif. Technol. 196 (2018) 270–280
[12] E. Suarez Garcia, CA Suarez Ruiz, T. Tilaye, MHM Eppink, RH Wijffels, C. van den Berg, Frakcionace proteinů a uhlohydrátů ze surových extraktů mikrořas pomocí vodného dvoufázového systému na bázi iontové kapaliny, září Purif. Technol. 204 (2018) 56–65,
[13] L. Wang, W. Li, Y. Liu, W. Zhi, J. Han, Y. Wang, L. Ni, Zelená separace bromelainu ve vzorku potravin s vysokým zachováním enzymové aktivity pomocí recyklovatelného vodného dvou- fázový systém obsahující nový syntetizovaný termoresponzivní kopolymer a sůl, Food Chem. 282 (2019) 48–57
[14] A. Tighrine, Y. Amir, P. Alfaro, M. Mamou, C. Nerín, Simultánní extrakce a analýza konzervačních látek a umělých sladidel ve šťávách metodou vysolování kapalina-kapalina před ultravysokoúčinnou kapalinovou chromatografií , Food Chem. 277 (2019) 586–594
[15] H. Shaker Shiran, M. Baghbanbashi, F. Ghazizadeh Ahsaie, G. Pazuki, Studie rozdělování kurkuminu ve vodných dvoufázových systémech polymer-sůl, J. Mol. Liq. 303 (2020) 112629
[16] X. Wu, R. Li, Y. Zhao, Y. Liu, Separace polysacharidů ze Spirulina platensis pomocí HSCCC s ethanol-amonium sulfátem ATPS a jejich antioxidační aktivity, Carbohydr. Polym. 173 (2017) 465–472
[17] VP Priyanka, RL Gardas, vodné dvoufázové systémy na bázi mono- a dikačních iontových kapalin pro extrakci sodné soli diklofenaku, Sep. Purif. Technol. 234 (2020) 116048
[18] J. Flieger, A. Czajkowska-Zelazko, Vodný dvoufázový systém na bázi iontové kapaliny pro izolaci chininu ze vzorku lidské plazmy, Food Chem. 166 (2015) 150–157
[19] X. Zhang, G. Teng, J. Zhang, Ethanol/sůl vodný dvoufázový systém založený na ultrazvukově asistované extrakci polysacharidů z Lilium David Ivar. unicolor Salisb: fyzikálně-chemická charakterizace a antiglykační vlastnosti, J. Mol. Liq. 256 (2018) 497–506,
[20] Q. Liu, X. Chen, Y. Guo, C. Han, J. Li, L. Jia, J. Liu, X. Wei, Termodynamická studie vodných dvoufázových systémů 1- butyl-3-methylimidazoliumtetrafluorborát a dodecylbenzensulfonát sodný, J. Mol. Liq. 279 (2019) 18–22,
[21] DCV Belchior, MV Quental, MM Pereira, CMN Mendonça, IF Duarte, MG Freire, Výkon iontových kapalin na bázi tetraalkylamonia jako složek vodných dvoufázových systémů při extrakci ovalbuminu a lysozymu, Sep. Purif. Technol. 233 (2020)
[22] CA Suarez Ruiz, J. Kwaijtaal, OC Peinado, C. van den Berg, RH Wijffels, MHM Eppink, Vícestupňová frakcionace biomolekul mikrořas pomocí selektivních vodných dvoufázových systémů, ACS Sustainable, Chem. Ing. 8 (2020) 2441–2452,
[23] AW Vieira, G. Molina, AB Mageste, GD Rodrigues, LR de Lemos, Dělení kyselin salicylových a acetylsalicylových vodnými dvoufázovými systémy: aspekty mechanismů a optimalizační studie, J. Mol. Liq. 296 (2019) 111775
[24] L. Ran, C. Yang, M. Xu, Z. Yi, D. Ren, L. Yi, Vylepšená vodná dvoufázová extrakce proanthokyanidinů z hroznových semen pomocí iontových kapalin jako adjuvans, Sep. Purif. Technol. 226 (2019) 154–161
[25] LA Mejía-Manzano, BA Barba-Dávila, P. Vázquez-Villegas, SO SernaSaldívar, J. González-Valdez, Zlepšená extrakce přírodního protirakovinného pristimerinu z kořenové kůry Mortonia greggii pomocí zelených rozpouštědel a vodných dvoufázových systémů, září Purif. Technol. 211 (2019) 667–672
