Obsah fenolických sloučenin a genetická diverzita na úrovni populace napříč přirozeným rozsahem rozšíření medvědice (Arctostaphylos Uva-ursi, Ericaceae) na Pyrenejském poloostrově

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Abstraktní:Medvědice lékařská (Arctostaphylos uva-ursi) je léčivá rostlina tradičně používaná k léčbě infekcí močových cest díky vysokému obsahuarbutin(hydrochinon-D-glukosid), který se nyní používá hlavně jako přírodní prostředek na bělení pokožky v kosmetice. Medvědice byla také navržena jako přírodníantioxidantaditivum kvůli vysokému obsahu fenolických sloučenin v listech. Studovali jsme variace na fenolických sloučeninách u 42 divokých populací medvědice lékařské, s cílem objasnit, zda přirozené biologické, klimatické a/nebo geografické faktory ovlivňují obsah fenolů napříč jeho přirozenou distribucí na Pyrenejském poloostrově. Listy medvědice byly sbírány na podzim během tříletého období (2014–2016) v populacích napříč gradientem zeměpisné šířky a nadmořské výšky. Methanolické extrakty vykazovaly širokou škálu variací v obsahu celkových fenolů a různé fenolické profily, pokud jde oarbutin(hladiny této hlavní složky se pohybovaly od 87 do 232 mg/g drwt), ale také obsahy katechinů a myricetinu, které byly ovlivněny geografickými a klimatickými faktory. Mezi populacemi byly také detekovány střední úrovně variací velikosti genomu – hodnocené průtokovou cytometrií – a dvou oblastí plastidové DNA. Genetická a cytogenetická diferenciace populací byla slabá, ale významně spojená s fytochemickou diverzitou. Elitní genotypy medvědice s vyššímiantioxidantkapacita byla následně identifikována.

klíčová slova: arbutin; genetická a fytochemická variabilita; velikost genomu; haplotypy;přirozenýantioxidanty

cistanche jsou přírodní antioxidanty

1. Úvod

Syntéza rostlinných specializovaných metabolitů se liší v čase (tj. ontogeneze, fenologii a indukované obraně) a prostoru, protože hraje klíčovou roli v adaptaci rostlin na podmínky prostředí, zatímco také genetická variace odpovídá za chemodiverzitu [1]. Mezi těmito sloučeninami mají fenoly rozmanitou řadu mono- a polymerních struktur, které plní širokou škálu fyziologických rolí [2]. Biosyntéza specializovaných metabolitů je značně ovlivněna faktory prostředí, jako je teplota, srážky nebo sluneční záření, které jsou zase často vystaveny šířkovým, podélným nebo výškovým gradientům. Zejména akumulace fenolických sloučenin je obecnou reakcí na zvýšené hladiny UV-B (280–315 nm) záření. Specifické variace sloučenin byly hlášeny u rostlin rostoucích v oblasti Středomoří během léta a ve vysokých nadmořských výškách, kde se vyskytuje vyšší výskyt UV-B a kyseliny skořicové a flavonoidy vykazovaly nejvyšší míru absorpce UV záření [3].

Arbutin(hydrochinon-D-glukosid) je jednoduchá fenolová sloučenina s omezeným výskytem v listech některých druhů patřících do rodů jako Arbutus, Arctostaphylos, Pyrus nebo Vaccinium. Hlavním přírodním zdrojem arbutinu je medvědice lékařská (Arctostaphylos uva-ursi ( L.) Spreng.) se po staletí používá k léčbě infekcí močových cest a jiných onemocnění ledvin [4] a bylinné přípravky se připravují dodnes [5]. V posledních letech se spektrum aplikacíarbutinse rozšířil, většinou jako přírodní prostředek pro bělení kůže v kosmetickém průmyslu [6] a v klinických terapiích kvůli jehoantioxidantantibiotické, protizánětlivé a protinádorové vlastnosti [7]. V důsledku toho roste zájem o hledání dalších přírodních zdrojůarbutin, stejně jako biotechnologické procesy, které mohou nahradit chemickou syntézu [8,9]. V této souvislosti dosáhla produkce arbutinu in vitro pomocí buněčných kultur Datura inoxia pilotního měřítka [10].

NavícarbutinK aktivním vlastnostem A. uva-ursi přispívají další fenolické sloučeniny, jako jsou flavonoidy a taniny [11,12], z nichž jsou nejvýznamnějšími katechin a corilagin [13]. V potravinářském průmyslu přírodní sloučeniny jako rostlinné fenoly nahrazují syntetickéantioxidantkonzervační látky [14]. A. uva-ursi se používá jako aditivum zejména v masných výrobcích [15–19], ale také v aktivních obalech [20]. Konečně byl nedávno navržen potenciál A. uva-ursi jako zdroje tříslovin pro kožedělný průmysl [21].

Monografie „bearberry leaf“ Evropské lékové agentury [5] navrhla minimálně 7 procentarbutinobsah v sušených listech jako požadavek na bylinné přípravky. Studie provedené v posledních desetiletích popsaly obsah arbutinu v listech medvědice v rozmezí od 0 procent do 18 procent, což bylo vysvětleno analytickými postupy, přirozenou variabilitou, podmínkami růstu a datem sklizně [4]. Obsah arbutinu se obvykle stanovuje pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie [4,12,22–24] a předchozí studie zjistily vyššíarbutinobsahy v rostlinách medvědice sbírané na podzim než v rostlinách sbíraných na jaře [4]. Byly popsány různé chemotypy medvědice, spojené s geografickou distribucí a vnitrodruhovou diferenciací v poddruhu A. uva-ursi. Nejvýraznější hlášenou fytochemickou variací je nepřítomnost arbutinu u A. uva-ursi subsp. stipitata Packer a Denford, ale také byly zmíněny rozdíly v obsahu methyl-arbutinu, kyseliny ellagové nebo myricetinu. Quercetin je také přítomen v listech medvědice, ve kterých jsou jak aglykony, tak jejich 3-O-glykosidy běžnějšími flavonoidy [4]. Většina těchto studií však byla provedena před několika desítkami let a dnes se vnitrodruhová variace medvědice lékařské považuje za kontinuální. 14 popsaných poddruhů, včetně jednoho ze Španělska (A. uva-ursi subsp. crassifolius (Braun-Blanq.) Rivas Mart. ex Torre, Alcaraz a MB Crespo), jsou v současnosti neakceptovaná jména a jsou synonymem pro A. uva-ursi [ Je proto zapotřebí nových výzkumů, abychom zlepšili naše znalosti o sloučeninách skutečně přítomných v surovině sklizené z různých míst pro průmyslové účely, protože bylo popsáno, že chemický profil listů A. uva-ursi zahrnuje rozmanitou škálu fenolů, taninů, a flavonoidy v novějších studiích provedených ke zkoumání rozdílů na mezidruhové úrovni [23,26,27].

Genetická (včetně cytogenetické) diverzita na úrovni populace podporuje adaptaci na různé podmínky prostředí [28]. Nedávno byly přezkoumány účinky polyploidizace na produkci specializovaných metabolitů v léčivých a aromatických rostlinách [29]. V této souvislosti je velikost genomu široce používaným parametrem při hodnocení variability rostlin, protože je často detekována vnitrodruhová variace ([30] a odkazy v nich uvedené), koreluje s mnoha dalšími biologickými znaky a hraje relevantní roli v evolučních procesech [31–35 ]. Studie zabývající se souvislostí mezi množstvím jaderné DNA (tj. velikostí genomu) a fytochemickou diverzitou jsou však velmi vzácné [36,37]. Vztah mezi fytochemickou a genetickou diverzitou byl hodnocen pomocí jaderných, ale zejména plastidových DNA markerů [38], zejména u léčivých [39] a kulturních [40] druhů rostlin.

Medvědice je široce rozšířena po celé cirkumborální oblasti, ale většina shromážděných divokých populací v Evropě se nachází ve východních zemích, Rakousku, Švýcarsku, Itálii a Španělsku. Arctostaphylos uva-ursi roste ve východní střední části Španělska, v horách, v nadmořských výškách od 550 do 2350 m nad mořem (n. m.). Je častější na severu, protože populace nacházející se v nižších zeměpisných šířkách jsou méně časté a obvykle mají méně jedinců. Stávající studie týkající se variability obsahu arbutinu ve Španělsku odkazovaly na hodnoty v rozmezí od 8 procent u severovýchodních populací [41] a 19 procent u španělského rostlinného materiálu hodnocené ve studii provedené v Německu [42]. Naše studie se zaměřuje na objasnění faktorů, včetně velikosti genomu a genetické diverzity, vysvětlujících fytochemické variace v přirozené distribuci medvědice ve Španělsku. Naše výsledky by mohly přispět k výběru rostlinného materiálu pro farmaceutický, kosmetický a potravinářský průmysl.

potraviny na bělení pokožky: CISATNCHE

2. Výsledky a diskuse

2.1. Analýza chemické diverzity

Listy medvědice odebrané z celkem 249 rostlin rostoucích ve 42 španělských lokalitách a během tříletého období, 20}14–2016 (obrázek 1, tabulka S1), vykazovaly různá procenta sušiny (dr wt) v rozmezí od 46,7 (LO) až 55,1 procenta (CP), s průměrem 50,1 ± 2,7 procenta (data neuvedena). Methanolické extrakty připravené ze vzorků odebraných v letech 2014 a 2015 byly použity pro stanovení obsahu celkových fenolů a arbutinu. Pozorovali jsme širokou škálu kontinuálních variací pro oba parametry s významnými rozdíly (p < 0,001)="" mezi="" rostlinami.="" extrakty="" listů="" 80="" rostlin="" odebraných="" na="" podzim="" 2014="" (obrázek="" 2a)="" vykazovaly="" celkový="" obsah="" fenolů="" v="" rozmezí="" od="" 103,3="" ±="" 4,8="" mg="" gae/g="" drwt="" (vzorek="" li-4)="" do="" 206,4="" ±="" 6,5="" mg="" gae/g="" dr="" wt="" (sr="" -2),="">arbutinobsah kolísal od 92.0 ± 3.0 mg/g dr.wt (AN-6) do 194,2 ± 5.6 mg/g drwt (SE-8). Analýza extraktů připravených z listů odebraných ve 20}15 z 94 rostlin (obrázek 2b) také ukázala širokou fytochemickou variaci, od 110,5 ± 3,6 mg GAE/g drwt(PI-4) do 200,9 ± 9,8 mg GAE/g drwt (LO-4) v celkovém obsahu fenolů, zatímco obsah arbutinu se pohyboval mezi 87,1 ± 0,4 mg/g drwt (ET-2) a 211,5 ± 5,9 mg/g dr wt (LI -2). Kromě toho, bez ohledu na rok sběru, významné rozdíly v celkových fenolech aarbutinobsahy byly zjištěny mezi rostlinami medvědice rostoucími na stejném místě pro většinu populací (data neuvedena). Hladiny arbutinu významně korelovaly s celkovým obsahem fenolů v extraktech z listů medvědice, protože jsme odhadli významné Pearsonovy koeficienty {{0}} 0,332 (p=0,003) pro rok 2014 a 0,289 pro data za rok 2015 (p=0,005). Obsah arbutinu u 48 rostlin odebraných v obou letech se významně neměnil (p=0,380).

Navzdory variabilitě zjištěné v rámci populací a bez ohledu na rok sklizně analýza rozptylu ukázala, že obsah arbutinu v extraktech z listů medvědice také závisel (p < {{0}}.00="" 1)="" populační="" umístění="" (obrázek="" 3a,b),="" jak="" se="" vyskytlo="" pro="" celkový="" obsah="" fenolů="" v="" listech="" medvědice="" analyzované="" 2015="" (p="">< 0.001,="" obrázek="" 3b).="" naproti="" tomu="" významné="" rozdíly="" v="" obsahu="" celkových="" fenolů="" nebyly="" pozorovány="" (p="0,080)" mezi="" 10="" populacemi="" odebranými="" v="" roce="" 2014,="" které="" se="" nacházely="" v="" relativně="" malé="" oblasti,="" ale="" byly="" rozmístěny="" v="" širokém="" rozmezí="" nadmořské="" výšky,="" od="" 424="" (ba="" obyvatel)="" do="" 1410="" m="" n.="" m.="" (obyvatelstvo="" pa).="" tato="" změna="" nadmořské="" výšky="" byla="" spojena="" s="" rozdíly="" v="" klimatických="" podmínkách="" (tabulka="" s1),="" protože="" polohy="" ve="" vyšších="" nadmořských="" výškách="" byly="" charakterizovány="" nižšími="" středními="" teplotami="" (pearsonův="" koeficient="" korelace,="" r="−0,666," p="">< 0,001)="" a="" vyššími="" ročními="" srážkami="" (="" r="0,485," p="">< 0,001),="" což="" zase="" vedlo="" k="" nižším="" úrovním="" globální="" radiace="" (r="−0,390," p="">< 0,001).="" navíc="" z="" tohoto="" souboru="" dat="" byla="" odhadnuta="" nízká,="" ale="" významná="" pozitivní="" korelace="" mezi="" ročními="" srážkami="" a="" celkovým="" obsahem="" fenolů="" v="" rostlinách="" medvědice="" (spearmanův="" koeficient="" rho="0,256," p="0,022)," zatímco="" ze="" souboru="" dat="" z="" roku="" 2015="" když="" jsme="" vzorkovali="" populace="" ve="" větší="" oblasti,="" zjistili="" jsme="" významnou="" pozitivní="" korelaci="" mezi="" ročními="" srážkami="" a="" obsahem="" arbutinu="" (rho="0.246," p="0.017)." tato="" významná="" korelace="" ukazuje,="" že="" rostliny="" medvědice="" rostoucí="" v="" severních="" polohách="" a="" v="" relativně="" vyšších="" nadmořských="" výškách="" vykazovaly="" často="" vyšší="">arbutinobsah (rho=0.217, p=0.035 a rho=0.269, p=0.009, v tomto pořadí). Jak již bylo zmíněno, tyto vyšší obsahy arbutinu významně korelovaly s vyššími celkovými obsahy fenolů v listech medvědice, které byly podobné (v průměru 154,4 ± 19,6 mg GAE/g drwt) jako ve vodných extraktech z jiných rostlinných druhů používaných jakoantioxidantaditiva v potravinářském průmyslu [43], jako je rozmarýn (185.0 mg GAE/g drhh), čaj (149,3 mg GAE/g drhh) nebo guava (154,4 mg GAE/g drhh). Tyto výsledky jsou v souladu s předchozími odkazy a byly potvrzeny ve studii Wrona et al. [20] pomocí některých vzorků listů španělské medvědice sesbíraných v roce 2015, u kterých je vyššíantioxidantkapacita byla spojena s vyššíarbutinobsah. Pro tento účel lze také identifikovat elitní genotypy medvědice, jako jsou jedinci 1, 4, 7 a 8 z populace LO, kteří během dvou let studie nashromáždili v průměru 183,3 ± 16,4 mg GAE/g drwt.

Abychom dále objasnili klimatické a geografické faktory ovlivňující vzorce fenolické variace, provedli jsme na podzim 2016:140 rostlin medvědice rostoucí na 29 místech podrobnější sběr vzorků a kvantifikovali jsme pět fenolických sloučenin (obrázek S1a), které byly identifikovány koelucí se standardy v gradientu acetonitril/voda (obrázek S1b). Analýza ukázala široký rozsah kontinuálních variací pro obsah arbutinu, kyseliny kávové, katechinu, myricetinu a glukosidu kvercetinu s významnými rozdíly mezi rostlinami, které byly také obecně pozorovány v rámci populací (data neuvedena). U hlavních fenolických složek jsme zjistili, že obsah arbutinu se pohyboval od 91,1 ± 5.0 (LB{{10}}) do 232,4 ± 2,8 mg/g dr.hmot. (PT{{15 }}), zatímco obsah katechinu se pohyboval od 4,1 ± 0,1 (AF{{20}}) do 45,5 ± 1,4 mg/g dr. hmotnosti (LB-5). Pokud jde o dva další stanovené flavonoidy, myricetin nebyl detekován v některých rostlinách z několika populací, zatímco dosahoval 21,2 ± 1,2 mg/g drwt v PO{{30}} a kvercetin glukosid se pohyboval od 3,8 ± 0,1 (CO -3) na 22,8 ± 0,8 mg/g dr. hmotnosti (BT-3). Nižší obsahy kyseliny kávové byly stanoveny v extraktech z listů medvědice lékařské, které se pohybovaly od 1,8 ± 0,0 (IZ-1) do 7,1 ± 0,3 mgRostliny /g dr wt (SI-4).

Navzdory odchylkám pozorovaným mezi jednotlivci byly pro těchto pět sloučenin odhadnuty také významné rozdíly mezi populacemi (Kruskal-Wallisovy testy, p < {{0}}.001="" a="" p="0." 009="" obsah="" kyseliny="" forkafeové).="" vyšší="" obsahy="" arbutinu="" byly="" v="" průměru="" stanoveny="" u="" rostlin="" z="" přirozených="" populací="" ab,="" gu,="" ln="" a="" lo="" (obrázek="" 4a),="" které="" se="" významně="" lišily="" (po="" bonferronkorekci)="" od="" nízkých="" obsahů="" zjištěných="" v="" rostlinách="" z="" populace="" lb="" (186,7="" ±="" 22,3,="" 193,9="" ±="" 12,1,="" 169,5="" ±="" 10,0="" a="" 169,2="" ±="" 5,2="" mg/g="" drwt="" front="" až="" 111,8="" ±="" 16,0="" mg/g="" drwt,="" v="" tomto="" pořadí).="">arbutinobsahy rostlin, které byly odebrány také v 2015, se mezi roky významně nelišily (p=0,821). Populace LB naopak vykazovala vyšší průměrnou hladinu katechinu (obrázek 4b), která se významně lišila od nízkého průměrného obsahu tohoto flavonoidu detekovaného v populacích AF a LC (32,8 ± 9,8 vpředu až 5,7 ± 1,9 a 5,3 ± {{2{{62}) }}},5 mg/g dr.hmot. Průměrné obsahy myricetinu a glukosidu kvercetinu jsou znázorněny na obrázku 4c s významnými rozdíly mezi populacemi AB, CG, LB a PO s vyšším obsahem myricetinu (15,1 ± 4.0, 14,6 ± 5,7, 10 0,7 ± 2,8 a 17,2 ± 3,9 mg/g drwt, v tomto pořadí), ve srovnání s nízkými hladinami, které se akumulovaly u průměrných rostlin z populací CO a OD (1,2 ± 1,5 a 2,4 ± 3,6 mg/g drw, v tomto pořadí) a také znamená obsah glukosidu kvercetinu stanovené v populacích AA, BT, CP, IZ a LB (15,2 ± 3,7, 15,9 ± 4,6, 11,8 ± 2,3, 15,7 ± 3,4 a 13,1 ± 4,6 mg/g) významně se liší z toho v populaci CO (4{79}} ± 0,1 mg/g dr. hmotnosti). Naproti tomu průměrné obsahy kyseliny kávové se pohybovaly od 2,1 ± 0,2 mg/g drwt v populacích AB, CE, PT a SA do 3,5 ± 1,2 mg/g drwt v populaci AF nebo 3,4 ± 2,2 mg/g drwt v populace SI; proto nebyly pozorovány významné rozdíly v důsledku intrapopulačních variací (průměrný obsah 2,7 ± 0,8 mg/g drwt). Tyto výsledky doplňují variaci fenolických metabolitů pozorovanou Wrona et al. [20] pro osm lokalit medvědice vzorkovaných v roce 2015, které byly analyzovány pomocí technologie UPLC®-ESI-Q-TOF s MSE.

Na rozdíl od výsledků získaných v analýze provedené se vzorky medvědice z let 2014 a 2015,arbutinobsahy stanovené ve 2{{1{15}}}}16 vzorcích vykazovaly nízkou, ale významnou pozitivní korelaci se zářením (rho=0.256, p=0.002) a maximálními středními teplotami (rho{ {5}}.183, p=0.030), a proto byly nepřímo korelovány s hodnotami ročních srážek (rho=−0,265, p=0,002). Tyto rozdíly byly také spojeny se změnou nadmořské výšky (rho=−0,192, p=0,023), ale tato negativní korelace byla vysvětlena zmíněným nízkýmarbutinobsah rostlin z populace LB, které se nacházejí ve výšce 1720m. Podobný vzorec variace byl pozorován u obsahu myricetinu, protože vyšší hladiny této sloučeniny byly významně spojeny s rostlinami medvědice rostoucími v lokalitách s vyšší úrovní radiace (rho=0.226, p=0.{{1{{ 12}}}}07). U katechinu byl pozorován opačný vzorec než u arbutinu, protože mezi tímto flavonoidem a ročními srážkami byla odhadnuta pozitivní korelace (rho=0.398,p < 0.0{{23="" }}1)="" a="" negativní="" korelace="" byly="" podle="" toho="" detekovány="" s="" radiací="" a="" s="" maximální="" střední="" teplotou="" (rho="−0,307," p="">< 0,001="" a="" rho="−0,470," p="">< 0,001,="" respektive).="" tato="" změna="" klimatických="" faktorů="" vysvětlila,="" že="" jak="" nadmořská="" výška,="" tak="" zeměpisná="" šířka="" ovlivnily="" obsah="" katechinu="" v="" listech="" medvědice="" (rho="0,410" a="" 0,490,="" v="" tomto="" pořadí,="" p="">< 0,001).="" analýza="" hlavních="" složek="" provedená="" s="" fytochemickými,="" klimatickými="" a="" geografickými="" daty="" odpovídajícími="" 29="" lokalitám="" odebraným="" v="" roce="" 2016,="" kde="" první="" dvě="" složky="" vysvětlily="" 60="" procent="" pozorované="" variace,="" tyto="" výsledky="" potvrdila="" (obrázek="" 5).="" nezjistili="" jsme="" žádnou="" významnou="" korelaci="" mezi="" obsahem="" kyseliny="" kávové="" nebo="" glukosidu="" kvercetinu="" v="" rostlinách="" medvědice="" lékařské="" a="" klimatickými="" ani="" geografickými="" faktory,="" ačkoli="" jsme="" odhadli="" mírné,="" ale="" významné="" korelace="" mezi="" obsahy="" myricetinu="" a="" glukosidu="" kvercetinu="" (rho="0.184," s="" {{31}="" },030)="" a="" mezi="" obsahem="" myricetinu="" a="" kyseliny="" kávové="" (rho="−0,176," p="0,037)" rostlin="">

Pozorované kontrastní změny klimatu varbutinObsah medvědicovitých rostlin naznačuje, že ačkoliv biosyntéza tohoto metabolitu je pravděpodobně zvýšena za podmínek vyšší radiace a teploty, pravděpodobně je nedostatek vody limitujícím faktorem pro A. uva-ursi ve Středomoří a jižních oblastech. Del Valle a kol. [44] popsali šířkový vzor akumulace flavonoidů Silene littorea (Caryophyllaceae) ve Španělsku, kde byly vyšší obsahy flavonoidů stanoveny u jižních populací, protože zeměpisná šířka korelovala negativně s UV-B zářením a teplotou a pozitivně se srážkami. Globální záření vykazuje jasný šířkový gradient s vyšším výskytem na jihu a východě Pyrenejského poloostrova a je zde také významný orografický efekt, protože perzistence oblačnosti moduluje výskyt tohoto záření ve vyšších nadmořských výškách. Mapa UV záření Španělska [45] odkazovala na vysokou korelaci (r > 0.9) mezi údaji o UV-B a globálním záření. Podle tohoto odkazu populace medvědice, které vykazovaly vyšší průměrarbutinobsahy v naší studii se většinou nacházejí v oblastech pod úrovní UV-B záření 2403–2451 J/m2.

Naše výsledky pro variaci katechinu u medvědice lékařské ukázaly geografický vzorec (obrázek 5) a souhlasí se studiemi provedenými u jiných rostlinných druhů ze severních zemí Evropy. Vyšší obsahy specializovaných metabolitů, jako jsou flavonoidy a antokyany, byly hlášeny u rostlin rostoucích ve vyšších zeměpisných šířkách, pravděpodobně v důsledku delších období denního světla a nižších nočních teplot [46]. Tím se obsah rozpustných fenolů v jehlicích Juniperus communis zvyšoval se zeměpisnou šířkou a nadmořskou výškou ve finských populacích [47] a také o 10–19 procent vyšší obsah fenolů byl zjištěn ve vyšší zeměpisné šířce v plodech tří Ribes spp. kultivary analyzované ve dvou finských lokalitách [48]. Tito autoři spojovali nižší obsah fenolů s vyšší úrovní záření a teploty. Obsah flavonoidů v plodech dvou druhů Vaccinium (také z čeledi Ericaceae) vykazoval geografický gradient, s vyšším množstvím flavonoidů v severních zeměpisných šířkách [49,50].

Ve vztahu k výškové variabilitě byly vyšší hladiny flavonoidů stanoveny v populacích jiných druhů Ericaceae, Calluna vulgaris, rostoucích ve vyšších nadmořských výškách [51]. Výškové gradienty také ovlivnily specializovaný metabolismus španělských populací Arnica montana [52] a Quercus robur[53]. Posledně uvedená práce poukazovala na významnou pozitivní souvislost mezi koncentrací celkových listových fenolických látek a nadmořskou výškou, přičemž gradient závisí pouze na flavonoidech, což naznačuje, že tyto sloučeniny řídily vztah pro celkové fenoly. Tyto výsledky souhlasí s našimi odhady pro obsah katechinu. A konečně, gradient srážek byl spojen s významnými rozdíly ve složení polyfenolů v africkém léčivém keři (Myrothamnus flabellifolia), u kterého byly metabolomické rozdíly v souladu s genetickou strukturou populací [54].

CISTANCHE MŮŽE ANTI-AGING

2.2. Analýza dat velikosti genomu a sekvencí

Hodnoty velikosti genomu 2C u rostlin medvědice se pohybovaly od 2,50 do 3,15 pg (tabulka 1). Mezi populacemi byly nalezeny nepatrné rozdíly v množství jaderné DNA (Kruskal–Wallis χ2=87.639, df=36,p=3.39 × 10−6). Dunnův test s Bonferroniho korekcí odhalil statisticky významné rozdíly mezi: populacemi AL a SI (Z=−3,972, p=0,024), LE a SI (Z=−4,196, p {{ 21}},009) a SE a SI (Z=−4,236, p=0,008). Populace Pontils (PO) je typovou lokalitou A. uva-ursi var.crassifolius, která byla následně kombinována jako A. uva-ursi subsp. crassifolius, a v současnosti taxonomicky neuvažovaný (viz úvod), má střední hodnotu (2,88 pg), v rozsahu hodnot získaných v jiných populacích druhu. Toto je první rozsáhlá populační studie množství jaderné DNA u druhu a celého rodu, protože jediná dostupná informace pochází z jedné balkánské populace stejného taxonu [55]. Uváděná hodnota 2C, 2,49 pg, je umístěna těsně na spodní hranici rozsahu variace zde zkoumaného souboru dat. Nebyla nalezena žádná korelace mezi hodnotami velikosti genomu a nadmořskou výškou populace. Množství DNA jedinců vykazovalo slabou pozitivní významnou korelaci sarbutinobsah, když byla porovnána data ze 158 rostlin medvědice (rho=0.187, p=0.018), zatímco nebyla nalezena žádná další významná korelace mezi velikostí genomu a jinými proměnnými. Tento výsledek je v souladu s hlášeným zvýšením produkce specializovaných metabolitů, které jsou obecně pozorovány u léčivých a aromatických rostlin po polyploidizaci [29].

Nově vytvořené sekvence pro intergenové spacery rpl{{0}}trnL a psbE-petN byly zarovnány do dvou matric (obsahujících 566 a 874 bp), které byly zřetězeny do jediné matrice 1440 bp. Střední byly detekovány hladiny variací v těchto plastidových oblastech (šest nukleotidových substitucí a čtyři indely). Bylo nalezeno deset různých haplotypů s celkovou diverzitou haplotypů (Hd)0.468 (tabulka 1). Většina populací (21) obsahovala pouze jeden haplotyp, zatímco pět z nich vykazovalo mezi jednotlivci určitou diverzitu. Nejhojnější haplotyp 1 vykazoval nejvyšší frekvenci (71,4 procenta), následovaný haplotypem 2 (15,2 procenta), zatímco zbytek z nich vykazoval mnohem nižší frekvence (0,04–0,01 procenta). Geografické rozložení haplotypů je znázorněno na obrázku 6. Haplotyp 1 byl nalezen u 32 populací – byl fixován u 18 z nich – distribuovaných ve všech vzorkovaných oblastech kromě nejjižnějších lokalit. Haplotyp 2 byl nalezen v deseti populacích a byl výhradním haplotypem ve dvou nejjižnějších populacích (HU a LV), stejně jako v PR. Haplotyp 4 byl soukromý ze tří populací z Pyrenejí, zatímco haplotyp 8 se objevil ve dvou populacích z východního Iberského poloostrova. Pokud jde o evoluční vztahy znázorněné v síti šetrnosti (obrázek 6), většina haplotypů je spojena jedním nebo dvěma mutačními kroky. Haplotyp 1 zaujímá centrální pozici a je k němu připojeno sedm haplotypů.

Mantelův test mezi pDNA genetickými a chemickými párovými vzdálenostními matricemi ukázal slabou, ale významnou korelaci (r=0.301; p=0.048) mezi genetickou diferenciací a koncentrací pěti chemických složek naměřených pro datový soubor 2016. Mantelův test neodhalil žádnou významnou korelaci mezi genetickou a geografickou vzdáleností mezi 25 populacemi odebranými v roce 2016 (r=0.103, p=0.207) ani mezi chemickými a geografickými párovými vzdálenostmi mezi těmito 25 populací (r=0,191, p=0,050). Fytochemická variabilita zde uváděná u divokých populací medvědice po celém Španělsku je proto doplněna středními úrovněmi variace haplotypu pDNA, což je severojižní genetická diferenciace nalezená v populacích medvědice srovnatelná s fylogeografickými vzory nalezenými u jiných rostlin (např. [56–58]. Celá tato homogenita se očekává u rostlin s nízkou reprodukční schopností [59], jako je A. uva-ursi, která vykazuje nízkou klíčivost a vysokou mortalitu mladých semenáčků [4]. párové vzdálenosti odhadnuté z profilů pěti fenolických látek Obrázek 6. Geografické rozložení haplotypů pDNA na iberských populacích Arctostaphylos uva-ursi. Kódy populací odpovídají kódům v tabulce S1 a koláčové grafy představují procento jedinců vykazujících každý haplotyp v každé populaci. obdélník, statistická úsporná síť ukazující evoluční vztahy te zastoupeno n plastidových haplotypů nalezených v populaci A. uva-ursi. Každý proužek podél linií spojujících haplotypy označuje jeden mutační krok v oblastech pDNA sekvenovaných v této studii. Mantelův test mezi pDNA genetickými a chemickými párovými vzdálenostními matricemi ukázal slabou, ale významnou korelaci (r=0.301; p{{28 }}.048) mezi genetickou diferenciací a koncentrací pěti chemických složek naměřených pro soubor dat z roku 2016. Mantelův test neodhalil žádnou významnou korelaci mezi genetickou a geografickou vzdáleností mezi 25 populacemi vzorku v roce 2016 (r=0.103, p=0.207) nebo mezi chemickými a geografickými párovými vzdálenostmi mezi těmito 25 populacemi ( r=0.191, p=0.050). Fytochemická variabilita zde uváděná u populací medvědice obecné v celém Španělsku je proto doplněna středními úrovněmi haplotypové variace pDNA, což je severojižní genetická diferenciace nalezená v populacích medvědice srovnatelná s fylogeografickými vzory nalezenými u jiných rostlin (např. [56–58]. Celá tato homogenita se očekává rostlina s nízkou reprodukční schopností [59], jako je A. uva-ursi, která vykazuje nízkou klíčivost a vysokou úmrtnost mladých semenáčků [4]. Tento vzorec genetických a fytochemických variací (který, jak bylo zmíněno, nebyl spojen s geografickými vzdálenostmi), stejně jako slabá, ale významná korelace mezi velikostí genomu a obsahem arbutinu, může naznačovat, že přirozená variabilita genomu ovlivňuje výtěžnost fenolických sloučenin v Hypervariabilní molekulární m. A. uva-ursi Pro potvrzení těchto fylogeografických vzorců a souvislostí mezi genetickou a biochemickou variabilitou jsou nezbytné arkery v rozsáhlejším vzorkování populace.

CISTANCHE MÁ ANTIOXIDAČNÍ ÚČINKY

3. Materiály a metody

3.1. Přírodní materiál

Pro fytochemickou analýzu bylo na podzim 2014, 2015 a 2016 odebráno celkem 249 rostlin medvědice rostoucích ve 42 populacích, které reprezentují přirozené rozšíření tohoto rostlinného druhu na Pyrenejském poloostrově (obrázek 1 a tabulka S1). Nejprve jsme na podzim 2014 shromáždili terminální výhonky z 80 rostlin v deseti španělských populacích (AG, AN, BA, LI, LO, PE, PÁ, SR, SC a SE) na relativně malé ploše (přibližně 80 × 50 km) v severním Španělsku, ale v širokém rozmezí nadmořských výšek (424–1410 m nm). Za druhé, na podzim 2015 jsme shromáždili 48 rostlin ze šesti z těchto populací (AG, LI, LO, PA, SE a SR) a 46 rostlin medvědice ze šesti populací umístěných v nižších zeměpisných šířkách (AL, CH, ET, HU, LV a PI). Pro každou populaci jsme odebrali osm rostlin od sebe vzdálených alespoň 5 m, s výjimkou HU, kde jsme našli pouze šest jedinců. Za třetí, na podzim 2016 bylo odebráno celkem 140 rostlin na 29 různých místech (1–6 jedinců z každé), včetně 26 nových španělských lokalit (IZ, CE, BT, MO, AA, GU, SI, AF, SA, PT, AB, CG, OD, PS, LB, CO, LE, MA, CP, PO, MZ, AV, LC, AY, LN a ZU). Náš odběr vzorků pokrývá rozsah nadmořské výšky od 534 do 1750 m. Celkem 42 populací představuje široký rozsah klimatických podmínek (tabulka S1): maximální průměrná teplota vykazovala 2-násobné kolísání (13–26 ◦C) a roční srážky oscilovaly od 399 (ZU) do 1589 mm (PT). Globální záření se pohybovalo od 4,2 do 5,1 kWh/m2d. Z každé rostliny bylo odebráno šest až deset terminálních výhonků (15–20 cm dlouhých), aby se získalo 6–15 g zdravých listů, které byly následně vyříznuty a vysušeny při 60 ◦C do konstantní hmotnosti (3–4 dny). Po stanovení suché hmotnosti byly listy ručně homogenizovány v hmoždíři a skladovány při 4 °C až do analýzy. Tento rostlinný materiál byl použit pro stanovení celkových fenolů a HPLC.

Listové materiály pro hodnocení průtokovou cytometrií byly získány z čerstvých listů 178 jedinců patřících do celkem 37 populací (tabulka 1). Vzorky byly získány od 33 výše uvedených populací a ze čtyř nových populací (BE, JO a PR ve Španělsku a EN v Andoře), kde byly listy sbírány na jaře 2017, a proto nebyly zahrnuty do fytochemické analýzy (obrázek 1 a Tabulka S1). Od jednoho do šesti jedinců na populaci bylo měřeno dvakrát. Listové materiály pro extrakci DNA byly vysušeny na silikagelu a skladovány při pokojové teplotě. Analýza diverzity DNA byla provedena u celkem 105 rostlin z 35 lokalit (tabulka 1).

Rostlinné poukázky 46 studovaných populací medvědice jsou uloženy v herbáři BC, Botànic de Barcelona, ​​v herbáři BCN, Centre de Documentació de BiodiversitatVegetal, Universitat de Barcelona nebo v herbáři JACA, Instituto Pirenaico de Ecología( CSIC).

3.2. Příprava listových extraktů a stanovení celkových fenolů

Byly připraveny tři replikáty extraktů z listů medvědice s použitím 50 mg sušeného vzorku a 10 ml 80procentního methanolu. Zkumavky byly inkubovány po dobu 30 min v ultrazvukové lázni a poté byly extrakty zfiltrovány (0,45 mm) a skladovány při 4 °C až do analýzy. Celkový obsah fenolů byl stanoven v extraktech připravených ze vzorků odebraných v letech 2014 a 2015. Postupovali jsme podle Folin–Ciocalteumetody [60,61] s mírnými úpravami: na 0,1 ml extraktu, 0,4 ml metanolu (80 procent), 0,5 ml Folin– Bylo přidáno Ciocalteuovo činidlo a 8 ml ultračisté vody. Po 5 minutách v ultrazvukové lázni byl přidán 1 ml Na2CO3 20 procent (w/v). Vzorky byly ponechány ve tmě po dobu 30 minut před měřením absorbance při 760 nm pomocí UV-viditelného spektrofotometru (CARY 50 BIO, Varian, AgilentTechnologies). Výsledky byly vyjádřeny v ekvivalentech kyseliny gallové (GAE); tj. mg kyseliny gallové/g dr. hm., za použití standardní křivky kyseliny gallové (40–340 µg/g).

3.3. Stanovení arbutinu a dalších fenolických metabolitů

Fenolický obsah methanolických extraktů z listů medvědice byl kvantifikován pomocí RP-HPLC za použití systému HPLC-UV/Vis (LaChrom Merck Hitachi L-7400) s Kinetex 5 µm-EVO C18 (250 mm × 4,6 mm ) kolona a absorbance stanovena při 280 nm. Extrakty ze vzorků odebraných v letech 2014 a 2015 byly naředěny 1:10 (obj./obj.) a injektovány mobilní fází methanolu a acetonitrilu. Gradientový program sestával z 0–5 min, 25 % methanolu; 5–6 min, 100 procent ; 6–10 minut, 100 procent; a 10–20 minut, znovu 25 procent metanolu. Průtok byl 1 ml/min a injekční objem byl 20 ul. Za těchto podmínek je retenční časarbutinbyla 2,6 min, což nám umožnilo určit koncentraci této sloučeniny pomocí kalibrační křivky vytvořené se 6 ředěními standardu, od 40 do 340 µg/g, s korelačním koeficientem r=0. 9997. Extrakty ze vzorků odebraných v roce 2016 byly analyzovány pomocí mobilní fáze methanolu a vody s následujícím gradientovým programem: 0–5 min, 10 procent methanolu; 5–6 min, 20 procent ; 6–10 min, 20 procent ; 10–11 min, 30 procent ; 11–15 min, 30 procent ;15–16 min, 40 procent ; 16–20 min, 40 procent ; 20–21 min, 50 procent ; 21–25 min, 50 procent ; 25–26 min, 60 procent ; 26–30 min, 60 procent ;30–31 min, 10 procent ; a 31–36 min, opět 10 procent metanolu. Za těchto podmínek jsme určiliarbutin adalší 4 fenolické sloučeniny: kyselina kávová, katechin, myricetin a kvercetin-3-O-glukopyranosid pomocí odpovídajících kalibračních křivek vytvořených s 5 ředěními standardů (25–500 µg/ml) ,který ukázal korelační koeficienty {{10}},9992 pro katechin (doba retence 12.{20}} min), 0,9924 pro kyselinu kofeikovou (doba zdržení 13,4 min), 0,9981 pro quercetin{{16} } O-glukosid (retenční čas 23,4 min) a 0,9997 pro myricetin (retenční čas 25,1 min).

Methanol a acetonitril byly v čistotě pro HPLC a zakoupeny od společnosti Panreac (Barcelona, ​​Španělsko). Standardy (čistota větší nebo rovna 98 procentůmarbutin, kyselina kávová a kyselina gallová, jakož i činidlo Folin–Ciocalteu byly zakoupeny od společnosti Sigma-Aldrich (Barcelona, ​​Španělsko). Katechinové a kvercetin-3-o-glukopyranosidové standardy byly zakoupeny od společnosti Extrasynthese (Genay Cedex, Francie), zatímco myricetin byl zakoupen od společnosti Alfa Aesar (Karlsruhe, Německo).

Výsledky chemických stanovení byly analyzovány pomocí softwaru SPSS v. 25 a R 3.5.2. Po testování dat na normalitu a homoskedasticitu jsme provedli analýzu rozptylu různých souborů dat a středních separačních testů (Tukey a Tamhane) nebo neparametrických testů jako Kruskal–Wallisův a Dunnův vícenásobný srovnávací test s Bonferroniho korekcí. Také jsme odhadli korelační koeficienty (Pearson nebo Spearman v závislosti na tom, zda data sledovala normální distribuci) mezi proměnnými, včetně velikosti genomu.

CISTANCHE MÁ ANTIOXIDAČNÍ ÚČINKY

3.4. Odhady velikosti genomu a sekvenování DNA

Velikost genomu rostlin medvědice byla odhadnuta průtokovou cytometrií v Centres Científicsi Tecnològics, Universitat de Barcelona (CCiTUB) podle postupů vysvětlených v Pellicer et al. [62].Petunia hybrida Vilm. 'PxPc6' (2C=2,85 pg) byl použit jako vnitřní standard. Semena standardu poskytla Plateforme de cytométrie d'Imagerie-Gif, CNRS-I2BC (Gif-sur-Yvette, Francie). Obsah jaderné DNA (2C) byl vypočten vynásobením známého obsahu DNA standardu kvocientem mezi polohy píku (režim) cílového druhu a standardu v histogramu intenzit fluorescence, za předpokladu lineární korelace mezi fluorescenčními signály z obarvených jader neznámého vzorku, známým vnitřním standardem a množstvím DNA [63].

Přibližně 20 mg tkáně listů vysušené oxidem křemičitým byly použity pro extrakci DNA pomocí CTABprotocol [64] s drobnými úpravami. Kvalita celkové DNA byla kontrolována spektrofotometrem NanoDrop 1000 (ThermoScientific, Wilmington, DE, USA). Plastidové intergenové oblasti rpl32-trnLand psbE-petN, stejně jako oblast jaderné ribozomální DNA ITS, byly amplifikovány a sekvenovány u tří jedinců na populaci. Sekvence ITS nevykazovaly žádnou variabilitu u 105 analyzovaných jedinců, s výjimkou několika pozic vykazujících intragenomové nukleotidové polymorfismy. Proto byla tato oblast jaderné ribozomální DNA vyloučena z další analýzy. Jiné oblasti plastidové DNA (tj. ndhF; ndhF-rpl32; psbA-trnH; psbD-trnT; rps16; a trnL-trnF) byly také testovány, ale byly vyřazeny kvůli nízké variabilitě nebo problémům se sekvenováním. Postup amplifikace byl proveden tak, jak je popsáno ve Vitales et al. [65]. Přímé sekvenování amplifikovaných segmentů DNA bylo provedeno pomocí Big Dye Terminator Cycle Sequencing v 3.1 (PE Biosystems, Foster City, Kalifornie, USA) v Unitatde Genòmica, CCiTUB, na analyzátoru DNA ABI PRISM 3700 (PE Biosystems). Sekvence rpl32-trnL a psbE-petN byly sestaveny pomocí BioEdit verze 7.1.3.0 [66], porovnány s ClustalW MultipleAlignment v1.4 [67] a upraveny ručně. Přístupová čísla GenBank jsou uvedena v tabulce S2.

3.5. Velikost genomu a genetická analýza

Pro kontrolu statisticky významných rozdílů v hodnotách 2C mezi populacemi byl proveden neparametrický Kruskal–Wallisův test. Byly také provedeny Dunnovy vícenásobné srovnávací testy, aby se určilo, které populace mezi nimi vykazovaly významné rozdíly. Bonferroniho korekce byla použita pro minimalizaci chyby typu I (falešně pozitivní).

Parametry genetické diverzity (polymorfní místa, informativní místa šetrnosti, počet haplotypů a celková diverzita haplotypů) byly odhadnuty pomocí DnaSP v6 [68]. Haplotypy plastidů byly stanoveny v kombinovaném souboru dat, který zahrnoval jak oblasti rpl32-trnL, tak psbE-petN. Indely byly kodifikovány pomocí FastGap v.1.2 [69] a považovány za události s jednou mutací. Evoluční vztahy mezi haplotypy byly odvozeny na základě úsporné sítě konstruované pomocí TCS [70], jak je implementováno v PopArt [71]. Maximální počet rozdílů vyplývajících z jednotlivých substitucí mezi haplotypy byl vypočten s 95 procenty spolehlivosti.

Pro analýzu vztahu mezi genetickými a chemickými daty byl proveden Mantelův test. Nejprve jsme odhadli fenotypovou vzdálenost mezi 25 populacemi pomocí dat z rostlin medvědice sesbíraných v roce 2016, která byla měřena pro pět fenolických složek (tj.arbutinkatechin, kyselina kávová, kvercetin a myricetin). Použili jsme R Commander ke standardizaci těchto dat [72] a následně k výpočtu chemické vzdálenosti odvozené ze standardizované matice pomocí funkce "Dist" onR na základě euklidovských vzdáleností. Za druhé, Neiova populace genetická párová vzdálenostní matice byla vypočtena mezi 25 populacemi pomocí DnaSP v6. Nakonec jsme vypočítali párové geografické vzdálenosti mezi těmito populacemi pomocí balíčku „geodist“ v R. Párové korelace mezi maticemi vzdáleností byly vypočteny pomocí Mantelova testu s 10,000 permutacemi s funkčním mantelem dostupným v balíčku R „vegan“ [ 73].

4. závěr

Všechny analyzované rostliny medvědice vykazovalyarbutinobsah vyšší než 7 procent; proto je tento rostlinný materiál vhodný pro bylinné přípravky. Naše analýza odhalila vyšší obsah arbutinu než obsah (až 9 procent), který uvádí Parejo et al. [40], kteří analyzovali čtyři populace nacházející se v severovýchodních Pyrenejích ve výšce 1580–2030 m a zjistili nízké rozdíly v obsahu arbutinu mezi populacemi. Kromě toho je většina zde stanovených hodnot v rozmezí rostlinného materiálu vybraného pro pěstování v Polsku [74] a v souladu s vysokýmarbutinobsah vzorků listů medvědice španělské udávaný Sonnenscheinem a Tegtmeierem [42] při výběru rostlin pro pěstování v Německu. Elitní genotypy A. uva-ursi bylo možné vegetativně množit, ale většina získaných klonů selhala při zakládání v terénu, což omezovalo využití těchto zdrojů. Popsali jsme také existující rozdíly v obsahu tří flavonoidů (katechinu, myricetinu a quercetinglukosidu), jakož i kyseliny kávové, mezi španělskými populacemi medvědice, a jak klimatické faktory (zejména globální záření a srážky), které korelovaly se zeměpisnou šířkou a nadmořskou výškou. gradienty, ovlivňují tuto variaci. Současně, i přes nízkou úroveň variability haplotypu a velikosti genomu determinovanou u A. uva-ursi iberského, byla genetická a cytogenetická diferenciace populací slabě, ale významně spojena s fytochemickou diverzitou. Celkově tyto výsledky zdůrazňují, že k vysvětlení vnitrodruhové fytochemické variability nalezené v rostlinách z divokých populací je třeba vzít v úvahu vliv jak genetických, tak abiotických faktorů.

CISTANCHE EFEKT

Reference

1. Moore, BD; Andrew, RL; Külheim, C.; Foley, WJ Vysvětlování vnitrodruhové diverzity v sekundárních metabolitech rostlin v ekologickém kontextu. Nový Phytol. 2014, 201, 733–750. [CrossRef] [PubMed]

2. Cheynier, V.; Comte, G.; Davies, KM; Lattanzio, V. Rostlinné fenoly: nedávné pokroky v jejich biosyntéze, genetice a ekofyziologii. Plant Physiol. Biochem. 2013, 72, 1–20. [CrossRef]

3. Bernal, M.; Llorens, L.; Julkunen-Tiitto, R.; Badosa, J.; Verdaguer, D. Výškové a sezónní změny fenolických sloučenin v listech a kutikule Buxus sempervirens. Plant Physiol. Biochem. 2013, 70, 471–482.[CrossRef] [PubMed]

4. Upton, R. (Ed.) Uva-ursi Leaf. Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. Standard analýzy, kontroly kvality a terapie; American Herbal Pharmacopoeia: Scotts Valley, CA, USA, 2008; 30p.

5. Evropská léková agentura. Zpráva o hodnocení Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. Folium. EMA/HMPC/750266/2016; Evropská léková agentura: Amsterdam, Nizozemsko, 2018.6. Kanlayavattanakul, M.; Lourith, N. Rostliny a přírodní produkty pro léčbu hyperpigmentace kůže – recenze. Planta Med. 2018, 84, 988–1006. [CrossRef]

7. Migas, P.; Krauze-Baranowska, M. Význam arbutinu a jeho derivátů v terapii a kosmetice. Fytochemie. Lett. 2015, 13, 35–40. [CrossRef]

8. Seo, DH; Jung, JH; Lee, JE; Jeon, EJ; Kim, W.; Park, CS Biotechnologická výroba arbutinu ( - a -arbutinu), látek zesvětlujících pokožku a jejich derivátů. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2012, 95, 1417–1425.[CrossRef]

9. Zhu, X.; Tian, ​​Y.; Zhang, W.; Zhang, T.; Guang, C.; Mu, W. Nedávný pokrok v biologické produkci -arbutinu. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2018, 102, 8145–8152. [CrossRef] [PubMed]

10. Davey, M. Sekundární metabolismus v kulturách rostlinných buněk. In Encyclopedia of Applied Plant Sciences, 2nd ed.;Thomas, B., Murphy, DJ, Murray, BG, Eds.; Elsevier: Londýn, Spojené království, 2017; Svazek 2, s. 462–467. [CrossRef]

11. Kurkin, VA; Rjazanova, TK; Daeva, ED; Kadentsev, VI Složky listů Arctostaphylos uva-ursi. Chem. Nat. Compd. 2018, 54, 278–280. [CrossRef]

12. Panda, A.; Petrucci, R.; Marrosu, G.; Multari, G.; Romana-Gallo, F. HPLC-PDAESI-TOF/MS metabolické profilování Arctostaphylos pungens a Arctostaphylos uva-ursi: Srovnávací studie fenolických sloučenin z listového metabolického extraktu. Fytochemie 2015, 115, 79–88. [CrossRef]

13. Olennikov, DN; Chekhirova, GV 60-Galloylpicein a další fenolické sloučeniny z Arctostaphylos uva-ursi.Chem. Nat. Compd. 2013, 49, 1–7. [CrossRef]

14. Brewer, MS Přírodní antioxidanty: zdroje, sloučeniny, mechanismy účinku a možné aplikace. Rev. Food Sci. Jídlo Saf. 2011, 10, 221–247. [CrossRef]

15. Amarowicz, R.; Pegg, RB; Rahimi-Moghaddam, P.; Bare, B.; Weil, JA Schopnost vychytávání volných radikálů a antioxidační aktivita vybraných druhů rostlin z kanadských prérií. Food Chem. 2004, 84, 551–562.[CrossRef]

16. Tesař, R.; O'Grady, MN; O'Callaghan, YC; O'Brien, NM; Kerry, JP Hodnocení antioxidačního potenciálu extraktů z hroznových jader a medvědice v syrovém a vařeném vepřovém mase. Maso Sci. 2007, 76, 604–610. [CrossRef][PubMed]

17. Mekinič, IG; Skroza, D.; Ljubenkov, I.; Katalini´c, V.; Šimat, V. Antioxidační a antimikrobiální potenciál fenolických metabolitů z tradičně používaných středomořských bylin a koření. Potraviny 2019, 8, 579. [CrossRef]

18. Mohd Azman, NA; Gallego, MG; Segovia, F.; Abdullah, S.; Shaarani, SM; Almajano, MP Studie vlastností extraktu z listů medvědice jako přírodního antioxidantu v modelových potravinách. Antioxidanty 2016, 5, 11.[CrossRef] [PubMed]

19. Pegg, RB; Amarowicz, R.; Naczk, M. Antioxidační aktivita polyfenolických látek z extraktu z listů medvědice (Arctostaphylos uva-ursi L. Sprengel) v masných systémech. ve fenolických sloučeninách v potravinách a přírodních zdravotních produktech; Shahidi, F., Ho, CT, Eds.; American Chemical Society: Washington, DC, USA, 2005; s. 67–82.[CrossRef]

20. Wrona, M.; Blasco, S.; Becerril, R.; Nerín, C.; Prodej, E.; Asensio, E. Antioxidační a antimikrobiální markery od UPLC®–ESI-Q-TOF-MSE nového vícevrstvého aktivního obalu na bázi Arctostaphylos uva-ursi. Talanta2019, 196, 498–509. [CrossRef]

21. Maier, M.; Olbermann, AL; Renner, M.; Weidner, E. Screening evropských léčivých bylin na obsah tříslovin — Nové potenciální třísloviny pro kožedělný průmysl. Ind. Crop. Prod. 2017, 99, 19–26. [CrossRef]

22. Boros, B.; Jakabová, S.; Madarász, T.; Molnár, R.; Galambos, B.; Kilár, F.; Fellinger, A.; Farkas, A. Validovaná metoda HPLC pro současnou kvantifikaci bergeninu, arbutinu a kyseliny gallové v listech různých druhů Bergenia. Chromatography 2014, 77, 1129–1135. [CrossRef]

23. Miaw-Ling, C.; Chur-Min, C. Simultánní HPLC stanovení hydrofilního bělícího činidla v kosmetickém přípravku. J. Pharm. Biomed. Anální. 2003, 33, 617–626. [CrossRef]

24. Parejo, I.; Viladomat, F.; Bastida, J.; Codina, C. Jediný extrakční krok v kvantitativní analýze listů medvědice arbutininové (Arctostaphylos uva-ursi) pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie. Phytochem. Anal.2001, 12, 336–339. [CrossRef]

25. MOC. Rostliny světa online. Dostupné online: http://www.plantsoftheworldonline.org/ (vstup 29. dubna 2020).

26. Saleem, A.; Harris, CS; Asim, M.; Cuerrier, A.; Martineau, L.; Haddad, PS; Arnason, metoda JTRP-HPLC-DAD-APCI/MSD pro charakterizaci léčivých Ericaceae používaná prvními národy Eeyou IstcheeCree. Phytochem. Anální. 2010, 21, 328–339. [CrossRef] [PubMed]

27. Stefanescu, BE; Szabo, K.; Mocan, A.; Crisan, G. Fenolické sloučeniny z pěti druhů listů Ericaceae a jejich související biologická dostupnost a zdravotní přínosy. Molekuly 2019, 24, 2046. [CrossRef] [PubMed]

28. Onda, Y.; Mochida, K. Zkoumání genetické diverzity v rostlinách pomocí vysoce výkonných sekvenačních technik. Curr. Genom. 2016, 17, 358–367. [CrossRef] [PubMed]

29. Iannicelli, J.; Guariniello, J.; Tossib, VE; Regalado, JJ; Di Ciaccioa, L.; van Barene, CM; Pitta Álvarez, SI;Escandón, AS "Polyploidní efekt" ve šlechtění aromatických a léčivých druhů. Sci. Hortic. 2020,260, 108854. [CrossRef]

30. Leitch, IJ; Leitch, AR Diverzita velikosti genomu a evoluce v suchozemských rostlinách. Diverzita genomu v rostlině, svazek 2, Fyzická struktura, chování a vývoj rostlinných genomů; Leitch, IJ, Greilhuber, J., Doležel, J., Wendel, JF, Eds.; Springer: Vídeň, Rakousko, 2013; s. 307–322. [CrossRef]

31. Bennett, MD; Leitch, IJ Množství jaderné DNA v krytosemenných rostlinách – pokrok, problémy a vyhlídky. Ann. Bot. 2005, 95, 45–90. [CrossRef]

32. Gregory, TR (Ed.) Evoluce genomu; Elsevier: San Diego, CA, USA, 2005.

33. Hoang, PN; Schubert, V.; Meister, A.; Fuchs, J.; Shubert, I. Variace velikosti genomu, objemu buněk a jádra, počtu chromozomů a lokusů rDNA u okřehků. Sci. Rep. 2019, 9, 3234. [CrossRef]

34. Rytíř, CA; Molinari, N.; Petrov, DA Hypotéza omezení velkého genomu: Evoluce, ekologie a fenotyp. Ann. Bot. 2005, 95, 177–190. [CrossRef]

35. Pellicer, J.; Hidalgo, O.; Dodsworth, S.; Leitch, IJ Diverzita velikosti genomu a její dopad na evoluci suchozemských rostlin. Geny 2018, 9, 88. [CrossRef]

36. Carev, I.; Rušći´c, M.; Skoˇcibuši´c, M.; Maravi´c, A.; Siljak-Jakovlev, S.; Politico, O. Fytochemická a cytogenetická charakteristika Centaurea solstitialis (Asteraceae) z Chorvatska. Chem. Biodivers. 2017, 14, e1600213.[CrossRef]

37. Cole, IB; Cao, J.; Alan, RA; Saxena, PK; Murch, SJ Srovnání Scutellaria baicalensis, Scutellarialateriflora a Scutellaria racemosa: Velikost genomu, antioxidační potenciál a fytochemie. Planta Med. 2008,74, 474–481. [CrossRef]

38. Carvalho, YGS; Vitorino, LC; de Souza, UJB; Bessa, LA Nedávné trendy ve výzkumu genetické rozmanitosti rostlin: Důsledky pro ochranu. Rozmanitost 2019, 11, 62. [CrossRef]

39. Wei, S.; Yang, W.; Wang, X.; Hou, Y. Vysoká genetická diverzita u ohrožené léčivé rostliny Saussureainvolucrata (Saussurea, Asteraceae), v západním pohoří Tianshan, Čína. Conserv. Genet. 2017, 18,1435–1447. [CrossRef]

40. Chang, YJ; Cao, YF; Zhang, JM; Tian, ​​LM; Dong, XG; Zhang, Y.; Qi, D.; Zhang, XS Studie o diverzitě chloroplastové DNA pěstovaných a planých hrušek (Pyrus L.) v severní Číně. Strom Genet. Genomes 2017, 13, 44.[CrossRef]

41. Parejo, I.; Viladomat, F.; Bastida, J.; Codina, C. Variace obsahu arbutinu v různých divokých populacích Arctostaphylos uva-ursi v Katalánsku, Španělsko. J. Herbs Spices Med. Rostliny 2002, 9, 329–333. [CrossRef]

42. Sonnenschein, M.; Tegtmeier, M. Pokusy o domestikaci medvědice lékařské (Arctostaphylos uva-ursi (L.)Spreng.). J. Med. Rostliny koření 2012, 17, 124–128.

43. Chen, HY; Lin, YC; Hsieh, CL Hodnocení antioxidační aktivity vodného extraktu některých vybraných nutraceutických bylin. Food Chem. 2008, 104, 1418–1424. [CrossRef]

44. Del Valle, JC; Buide, ML; Casimiro-Soriguer, I.; Whittall, JB; Narbona, E. Na akumulaci flavonoidů v různých částech rostlin: Vzorce variací mezi jednotlivci a populacemi v pobřežním kempu (Silene littorea). Přední. Plant Sci. 2015, 6, 939. [CrossRef]

45. Martínez-Cadenas, C.; López, S.; Ribas, G.; Flores, C.; García, O.; Sevilla, A.; Smith-Zubiaga, I.; Ibarrola-Villaba, M.; Pino-Yanes, MM; Gardeazabal, J.; a kol. Simultánní purifikační selekce na alelu předků MC1R a pozitivní selekce na alelu s rizikem melanomu v60l u jihoevropanů. Mol. Biol. Evol. 2013, 30, 2654–2665. [CrossRef]

46. ​​Jakaaola, L.; Hohtola, A. Vliv zeměpisné šířky na biosyntézu flavonoidů v rostlinách. Prostředí rostlinných buněk. 2010, 33,1239–1247. [CrossRef] 47. Martz, F.; Peltola, R.; Fontana, S.; Duval, RE; Julkunen-Tiitto, R.; Stark, S. Vliv zeměpisné šířky a nadmořské výšky na terpenoidní a rozpustné fenolické složení jehlic jalovce (Juniperus communis) a hodnocení jejich antibakteriální aktivity v boreální zóně. J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 9575–9584. [CrossRef]

48. Yang, B.; Zheng, J.; Laaksonen, O.; Tahvonen, R.; Kallio, H. Účinky zeměpisné šířky a povětrnostních podmínek na fenolické sloučeniny v kultivarech rybízu (Ribes spp.). J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 3517–3532. [CrossRef][PubMed]

49. Lätti, AK; Jaakola, L.; Riihinen, KR; Kainulainen, PS Variace anthokyanů a flavonolů v bobulích bogbil (Vaccinium uliginosum L.) ve Finsku. J. Agric. Food Chem. 2010, 58, 427–433. [CrossRef] [PubMed]

50. Lätti, AK; Riihinen, KR; Kainulainen, PS Analýza variace antokyanů v divokých populacích borůvky (Vaccinium myrtillus L.) ve Finsku. J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 190–196. [CrossRef]

51. Monschein, M.; Iglesias, J.; Kunert, O.; Bucar, F. Fytochemie vřesu (Calluna vulgaris (L.) Hull) a jeho výškové změny. Phytochem. Rev. 2010, 9, 205–215. [CrossRef]

52. Perry, NB; Burgess, EJ; Rodríguez Guitián, MA; Romero Franco, R.; López Mosquera, E.; Smallfield, BM; Joyce, NI; Littlejohn, RP Seskviterpenové laktony v Arnica montana: Helenin a dihydrohelenalinchemotypy ve Španělsku. Planta Med. 2009, 75, 660–666. [CrossRef] [PubMed]

53. Abdala-Roberts, L.; Assmann, S.; Berny-Mier, Y.; Terán, JC; Covelo, F.; Glauser, G.; Moreira, X. Biotické aabiotické faktory spojené s výškovými variacemi rostlinných znaků a býložravosti u dominantních dubových druhů. Am. J. Bot. 2016, 103, 2070–2078. [CrossRef] [PubMed]

54. Bentley, J.; Moore, JP; Farrant, JM Metabolomics jako doplněk fylogenetiky pro hodnocení vnitrodruhových hranic u léčivého keře tolerantního k vysychání Myrothamnus flabellifolia (Myrothamnaceae). Phytochemistry 2019, 159, 127–136. [CrossRef] [PubMed]

55. Siljak-Jakovlev, S.; Pustahija, F.; Šoli´c, EM; Boguni´c, F.; Muratovič, E.; Baši´c, N.; Catrice, O.; Brown, CSK databázi velikosti genomu a počtu chromozomů balkánské flóry: C-hodnoty u 343 taxonů s novými hodnotami pro 252. Adv. Sci. Lett. 2010, 3, 190–213. [CrossRef]

56. Garrido, JL; Alcántara, JM; Rey, PJ; Medrano, M.; Guitián, J.; Castellanos, MC; Bastida, JM; Jaime, R.;Herrera, CM Geografická genetická struktura iberských kolumbín (gen. Aquilegia). Plant Syst. Evol. 2017, 303, 1145–1160. [CrossRef

57. Listl, D.; Poschlod, P.; Reisch, C. Fylogeografie tvrdé skály, která přežila v evropských suchých pastvinách. PLoS ONE 2017, 12, e0179961. [CrossRef]

58. Olalde, M.; Herrán, A.; Espinel, S.; Goicoechea, P. Fylogeografie bílých dubů na Pyrenejském poloostrově.Ecol. Manag. 2002, 156, 89–102. [CrossRef]

59. Barrett, SCH Vliv klonality na pohlavní rozmnožování rostlin. Proč. Natl. Akad. Sci. USA 2015, 112,8859–8866. [CrossRef] [PubMed]

60. Skowyra, M.; Falguera, V.; Gallego, G.; Peiro, S.; Almajano, MP Vliv extraktů Perilla frutescens na oxidační stabilitu modelových potravinových emulzí. Antioxidanty 2014, 3, 38–54. [CrossRef] [PubMed]

61. Pascoal, A.; Quirantes-Piné, R.; Fernando, AL; Alexopoulou, E.; Segura-Carretero, A. Fenolické složení a antioxidační aktivita listů kenafu. Ind. Crop. Prod. 2015, 78, 116–123. [CrossRef]

62. Pellicer, J.; Garnatje, T.; Molero, J.; Pustahija, F.; Siljak-Jakovlev, S.; Vallès, J. Původ a evoluce jihoamerických druhů Artemisia (Asteraceae); důkazy z molekulární fylogeneze, ribozomální DNA a dat o velikosti genomu. Aust. J. Bot. 2010, 58, 605–616. [CrossRef]

63. Doležel, J. Průtoková cytometrická analýza obsahu jaderné DNA ve vyšších rostlinách. Phytochem. Anální. 1991, 2,143–154. [CrossRef]

64. Doyle, JJ; Doyle, JL Rychlý postup izolace DNA pro malá množství čerstvé listové tkáně. Phytochem. Bull.Bot. Soc. Dopoledne. 1987, 19, 11–15.

65. Vitales, D.; Feliner, GN; Vallès, J.; Garnatje, T.; Firat, M.; Álvarez, I. Nová ohraničení středomořského rodu Anacyclus (Anthemideae, Asteraceae) na základě markerů plastidové a jaderné DNA. Phytotaxa 2018, 349, 1–17. [CrossRef]

66. Hall, TA BioEdit: Uživatelsky přívětivý editor pro zarovnání biologických sekvencí a program pro analýzu pro Windows95/98/NT. Nucleic Acids Symp. Ser. 1999, 41, 95–98.

67. Thompson, JD; Higgins, DG; Gibson, TJ CLUSTAL W: Zlepšení citlivosti progresivního zarovnání více sekvencí prostřednictvím vážení sekvencí, penalizací za mezery v závislosti na poloze a výběru matice hmotnosti. Nucleic Acids Res. 1994, 22, 4673–4680. [CrossRef]

68. Rozas, J.; Ferrer-Mata, A.; Sánchez-DelBarrio, JC; Guirao-Rico, S.; Librado, P.; Ramos-Onsins, SE; Sánchez-Gracia, A. DnaSP 6: Analýza polymorfismu sekvence DNA velkých souborů dat. Mol. Biol. Evol.2017, 34, 3299–3302. [CrossRef] [PubMed]

69. Borchsenius, F. FastGap, verze 1.2; Department of Biosciences, Aarhus University: Aarhus, Dánsko, 2009;Dostupné online: http://www.aubot.dk/FastGap_home.htm (vstup 1. července 2019).

70. Clement, M.; Posada, DCKA; Crandall, KA TCS: Počítačový program pro odhad genových genealogií. Mol. Ecol. 2000, 9, 1657–1659. [CrossRef] [PubMed]

71. Leigh, JW; Bryant, D. Popart: Plně funkční software pro konstrukci sítě haplotypů. Metody Ecol. Evol.2015, 6, 1110–1116. [CrossRef]

72. Fox, J. Začínáme s velitelem R: Grafické uživatelské rozhraní se základními statistikami pro RJ Stat. Softw.2005, 14, 1–42. [CrossRef]

73. Oksanen, J.; Blanchet, FG; Kindt, R.; Legendre, P.; O'Hara, RB; Simpson, GL; Solymos, P.; Stevens, M.; Wagner, H. Vegan: Community Ecology Package. Verze balíčku R 1.17-4. 2010. Dostupné online:http://CRAN.R-project.org/package=veganské (přístup 19. září 2010).74. Malinowska, H. Selekce medvědice lékařské (Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng.) z přirozených populací v Polsku. Acta Soc. Bot. Pol. 1995, 64, 91–96. [CrossRef]