Gomisin N inhibuje melanogenezi prostřednictvím regulace signálních drah PI3K/Akt a MAPK/ERK v melanocytech

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstraktní: Gomisin N, jedné z lignanových sloučenin nalezených v Schisandra Chinensis bylo v různých studiích prokázáno, že má antioxidační, protinádorové a protizánětlivé účinky. Zde poprvé uvádíme antimelanogenní účinnost Gomisinu N u savců. buňkách stejně jako v embryích zebřiček. Gomisin N významně snížil obsah melaninu bez buněčné toxicity. Ačkoli nebyl schopen modulovat katalytickou aktivitu hubtyrosinázain vitro,Gomisin Ndownreguloval hladiny exprese klíčových proteinů, které v nich fungujímelanogeneze. Gomisin N downregulovaný receptor melanokortinu 1 (MC1R), adenylylcykláza 2, transkripční faktor spojený s mikroftalmií (MITF), tyrosináza,tyrosináza-příbuzný protein-1(TRP-1) a protein související s tyrosinázou-2 (TRP-2). Kromě toho buňky Melan-A ošetřené Gomisinem N vykazovaly zvýšené hladiny p-Akt a p-ERK, což znamená, že aktivace drah PI3K/Akt a MAPK/ERK může fungovat jako inhibicemelanogeneze. Také jsme potvrdili, že Gomisin nesnížil produkci melaninu potlačením exprese MITF,tyrosináza, TRP-1 a TRP-2v myších a lidských buňkách a také ve vyvíjejících se embryích zebřičky. Společně jsme dospěli k závěru, žeGomisin Ninhibuje syntézu melaninu potlačením exprese MITF a melanogenních enzymů, pravděpodobně prostřednictvím modulace drah PI3K/Akt a MAPK/ERK.

klíčová slova:Schisandra Chinensis;Gomisin N; lignan;melanogeneze; bělení kůže

cistanche mají funkci bělení kůže

1. Úvod

Melanin je pigment nacházející se ve většině zvířecích orgánů včetně kůže, vlasů, očí, vnitřního ucha, kostí, srdce a mozku [1,2].Melanogenezeje komplexní proces, ve kterém je zapojeno více signálních drah. Receptor melanokortinu 1 (MC1R) je klíčovým regulátorem vmelanogeneze, signalizace prostřednictvím svých ligandů, jako je hormon stimulující melanocyty (MSH) a adrenokortikotropní hormon (ACTH) [3]. Kožní melanin je biosyntetizován melanocyty v epidermis a poté přenesen do keratinocytů, kde hraje důležitou roli v ochraně kůže tím, že absorbuje UV záření ze slunečního záření a zachycuje reaktivní volné radikály [4,5]. Syntéza a přenos melaninu v kůži a vlasových folikulech je regulována dostupností jeho prekurzorů [6]. L-tyrosin a L-dihydroxyfenylalanin (L-DOPA), hlavní substráty melanogenních enzymů, také fungují jako regulátory podobné hormonům v melanogenezi [7]. Na druhé straně má nadprodukce melaninu za následek nežádoucí kožní problémy, jako jsou pihy a melasma [8,9]. Melanogeneze může ovlivnit chování normálních a maligních melanocytů modulací elastických vlastností buněk [10]. Přestože receptory pro serotonin a melatonin exprimované v kožních buňkách hrají klíčovou roli při udržování buněčné homeostázy, nadměrná produkce melaninu prostřednictvím nekontrolovaných hormonálních změn může způsobit patologické stavy v kůži [11].

Existovalo tedy rozsáhlé úsilí objasnit molekulární mechanismy, které řídí melanogenezi jako primární krok pro léčbu hyperpigmentárních kožních poruch. Kromě toho různé druhybělení kůželátky, které inhibují syntézu melaninu, byly identifikovány z rostlinných a nerostlinných extraktů a komerčně používané v kosmetice [12,13]. Mezi nejpoužívanější bělící látky patří hydrochinon, mequinol, arbutin, kyselina kojová, kyselina askorbová a kyselina retinová [12,14]. Existují však různá omezení jejich použití při léčbě akutních nebo chronických symptomů hyperpigmentace u lidí. Například hydrochinon, ačkoli se k depigmentaci používá již od 60. let 20. století, může způsobit podráždění kůže a kontaktní dermatitidu [15,16]. Vede také k poškození DNA zvýšením produkce reaktivních forem kyslíku a rozvojem exogenní ochronózy v savčích buňkách [17,18]. Jiné známétyrosinázainhibitory, jako je kyselina kojová a kyselina askorbová, mají nejen špatnou penetraci kůží, stabilitu a bělící účinnost, ale mohou také způsobit cytotoxicitu, dermatitidu a erytém při dlouhodobém užívání [19,20]. V tomto ohledu existuje rostoucí potřeba vyvinout bezpečnější a účinnější bělicí činidla pro léčbu hyperpigmentace lidské kůže. Přírodní byliny používané v tradiční medicíně mohou poskytnout alternativní zdroje pro identifikaci nových bělicích činidel, která řídí klíčové krokymelanogenezes menšími nebo žádnými vedlejšími účinky [21].

Schisandra chinensis, také známá jako severská bobule jemné chuti, se přirozeně vyskytuje v severovýchodní Číně, na dalekém východě Ruska, Japonsku a Koreji [22]. Tato rostlina se již dlouho používá k léčbě šerosleposti, popálenin kůže, aseptických zánětů a onemocnění jater v tradiční orientální medicíně [23,24]. Bylo prokázáno, že extrakt z plodů S. chinensis a jeho lignanové sloučeniny mají různé farmakologické účinky v myších buněčných liniích. Například Schisandra A a C mají antioxidační účinky, zatímco Schisandra B má antifibrotické, protizánětlivé, antioxidační a antiapoptotické účinky [25]. Další lignanová sloučeninaGomisin N(Obrázek 1A) bylo popsáno, že potlačuje apoptózu vyvolanou oxidačním stresem inhibicí uvolňování cytochromu C z mitochondrií do cytoplazmy, štěpením kaspázy 3 a PARP a přechodem mitochondriální permeability indukované Ca2 plus v H9c2 potkaních kardiomyocytech [7,8]. Je zajímavé, že několik studií využívajících myší modely a buněčné linie lidské kůže odhalilo terapeutický potenciál S. chinensis pro léčbu kožních poruch. Lee a kol. uvedli, že methanolový extrakt z plodů S. chinensis zmírnil příznaky kontaktní dermatitidy snížením produkce prozánětlivých cytokinů, jako jsou TNF- a IFN-, když byl topicky aplikován [8,24]. Kang a kol. ukázaly, že vodní extrakt Schisandra Fructus inhiboval aktivaci IκB, čímž potlačil produkci TNF-, IL-6 a GM-CSF v linii lidských žírných buněk HMC-1 [26]. Tyto nálezy nás vedly k předpokladu že lignany S. chinensis by mohly ovlivňovat funkce kožních buněk v širším měřítku. V této studii jsme se snažili prozkoumat domnělou roliGomisin N, jedna z hlavních lignanových sloučenin v S. Chinensis, při regulacimelanogeneze, čímž se vyhodnotí jeho potenciální použití jako kosmetického prostředku. Tady to hlásímeGomisin Ninhibuje biosyntézu melaninu bez buněčné toxicity v lidských a myších buňkách, stejně jako v embryích zebrafish.

2. Výsledky

2.1. Účinky Gomisinu N na tvorbu melaninu a životaschopnost buněk

Pro ověření účinků přípravku Gomisin N namelanogenezeOšetřili jsme myší melanocyty s různými koncentracemiGomisin Npo dobu 72 hodin a poté byly hodnoceny změny obsahu melaninu. Léčba Gomisinem snížila obsah melaninu jak v normální melanocytové buněčné linii Melan-A, tak v B16F10 melanomových buňkách způsobem závislým na dávce bez buněčné toxicity (obrázek 1B, C). Pozorovali jsme, že Gomisin N inhiboval produkci melaninu indukovanou MSH v buňkách B16F10, což bylo srovnatelné s výsledky získanými ošetřením PTU [27] (obrázek 1C). Vyhodnotit, zda došlo ke snížení hladiny melaninuGomisin NLéčba je způsobena sníženou aktivitou tyrosinázy, provedli jsme test barvení L-DOPA v normálních lidských epidermálních melanocytových buňkách (NHEM). Jak je znázorněno na obrázku 1E, buňky NHEM ošetřené Gomisinem N vykazovaly snížené hladiny L-DOPA ve srovnání s neošetřenými buňkami. Inhibiční účinek Gomisinu N na produkci melaninu však nebyl významný u buněk lidského melanomu MNT-1 (obrázek 1D) .

2.2. Účinky Gomisinu N na aktivitu tyrosinázy

Prozkoumat zdaGomisin Nbrzdítyrosinázaaktivity in vitro jsme použili houbovou tyrosinázu a lyzáty melanomových buněk B16. Jako pozitivní kontrola byla použita kyselina kojová, dobře známý inhibitor tyrosinázy. Při ošetření houbovou tyrosinázou, zatímco kyselina kojová významně snížila enzymatickou aktivitu, Gomisin N neindukoval žádnou změnu v konverzi L-DOPA na dopachrom (obrázek 2A). Nicméně, když byl ošetřen na buňky melanomu B16, Gomisin N vedl ke snížení vtyrosinázaaktivita buněčného lyzátu způsobem závislým na dávce (obrázek 2B). Navíc při současném ošetření s buňkami -MSH inB16,Gomisin Nzvrátil nárůst tvorby dopachromu stimulovaného -MSH (obrázek 3C). Zejména se zdá, že Gomisin N je účinnější než kyselina kojová při inhibici buněčnéaktivitu tyrosinázyB16 buněk po stimulu -MSH. Tato zjištění naznačují, že inhibiční účinek GomisinN na produkci melaninu pozorovaný v myších a lidských buňkách (obrázek 1) není způsoben jeho funkcí přímo inhibovat katalytickou aktivitu tyrosinázy. Stále je však možné, že Gomisin N reguluje expresi tyrosinázy nebo jiných proteinů, které hrají klíčovou roli vmelanogeneze.

2.3. Účinky Gomisinu N na inaktivaci signální dráhy MC1R

Snažili jsme se objasnit základní mechanismus zodpovědný za inhibiční účinek GomisinN na produkci melaninu. Zdůvodnili jsme toGomisin Nmůže regulovat signální proteiny, které se účastnímelanogenezea tím inhibují syntézu melaninu. Receptor melanokortinu 1 (MC1R) je amelanocytární receptor spřažený s G proteinem, který funguje jako klíčový regulátor syntézy melaninu. Aktivace MC1R jeho ligandem -MSH nebo adrenokortikotropním hormonem (ACTH) vede ke zvýšení adenylylcyklázy, která následně upreguluje intracelulární hladiny cAMP [2,3]. V důsledku toho je transkripční hladina MITF zvýšena cestou proteinkinázy-C (PKA)/responzivního element-bindingprotein (CREB) [2,28]. Abychom vyhodnotili regulační účinek Gomisinu N na signální dráhu MC1R, zkontrolovali jsme hladiny exprese MC1R a jeho downstream signálních molekul po ošetření buněk Melan-A přípravkem Gomisin N. Zjistili jsme, že Gomisin N významně snížil hladiny proteinu jak MC1R, tak adenylylcyklázy 2 způsobem závislým na dávce (obrázek 3A–C). Jak se očekávalo,Gomisin N-ošetřené buňky také vykazovaly snížené hladiny proteinu MITF a jeho známých cílů tyrosinázy, TRP-1 a TRP{2}} (obrázek 3A, D–G). Tato zjištění naznačují, že Gomisin N inhibuje enzymy produkující melanin inaktivací MITF prostřednictvím signální dráhy MC1R.

2.4. Účinky Gomisinu N na fosforylaci Akt a ERK1/2 v buňkách Melan-A

Je známo, že dráhy PI3K/Akt a MAPK/ERK se podílejí na melanogenezi transkripčně nebo post-transkripčně regulující MITF [29,30]. Abychom vyhodnotili, zda GomisinN ovlivňuje tyto signální dráhy, hodnotili jsme stav fosforylace Akt a ERK1/2 analýzou Western blot. Jak je znázorněno na obrázku 3H–J, ošetření vysokou dávkou (30 µM).Gomisin Nvýznamně zvýšil fosforylaci jak Akt, tak ERK. Tato data ukazují, že inhibiční účinek Gomisinu N namelanogenezeje pravděpodobně spojen s dráhami P13K/Akt a MAPK/ERK.

2.5. Gomisin N inhiboval melanogenezi v embryích zebrafish

Dále jsme se zaměřili na zkoumání, zda je Gomisin N účinný při inhibicimelanogenezein vivo. Za tímto účelem jsme ošetřili embrya zebrafish Gomisinem N po dobu 72 hodin v koncentracích 1, 10, 20 a 30 uM a poté jsme měřili hladiny exprese melanogenních proteinů. Pozorovali jsme, že léčba Gomisinem N inhibovala tvorbu melaninu ve vyvíjejících se embryích zebrafish.Gomisin N- ošetřená embrya vykazovala snížení obsahu melaninu způsobem závislým na koncentraci ve srovnání s neošetřenou kontrolou (obrázek 4). Zjistili jsme také, že hladiny bílkovintyrosináza, MITF, TRP-1 a TRP-2 byly sníženy léčbou Gomisinem N (obrázek 5). Tyto výsledky ukazují, že Gomisin N inhibuje melanogenezi in vivo regulací transkripčního faktoru MITF a jeho cílů.tyrosináza, TRP-1 a TRP-2.

2.6. Gomisin N zvrátil rapamycinem indukovanou melanogenezi u lidského MNT-1

I když Gomisin N významně inhibovalmelanogenezev buňkách Melan-A a B16 a také u embryí inzebrafish jsme jeho účinek na buňky lidského melanomu MNT-1 nepozorovali. Očekávali jsme, že účinek Gomisinu N by mohl být detekovatelný v buňkách MNT-1 za podmínek, kdy je melanogeneze upregulována vhodným stimulem. Bylo prokázáno, že rapamycin indukuje melanogenezi zvýšením aktivity tyrosinázy a hladin proteinů MITF, tyrosinázy, TRP-1 a TRP-2 [31], částečně prostřednictvím aktivace autofagie [32]. Sledovali jsme hladinytyrosináza, MITF, TRP-1 a TRP-2 v buňkách MNT-1 analýzou Western blot, po společné léčbě s Gomisinem N andrapamycinem. Léčba rapamycinem významně indukovala hladiny MITF, TRP-1 a TRP-2, ale neměla žádný vliv natyrosinázaúrovně (obrázek 6). Léčba Gomisinem N však významně zvrátila účinky rapamycinu na MITF, TRP-1 a TRP-2 v závislosti na koncentraci. Opačný účinekGomisin Nproti rapamycinu byl slibnější při koncentraci 20 a 30 uM než 10 uM. Tyto výsledky naznačují, že Gomisin N inhibujemelanogenezev lidských MNT-1 melanomových buňkách regulací transkripčního faktoru MITF a jeho cílů TRP-1 a TRP-2.

3. Diskuse

Hlavní funkcí melaninu je ochrana kožních buněk před UV zářením [33–35]. Hyperpigmentace, důsledek nadprodukce melaninu v kůži, způsobuje nežádoucí kosmetické obavy a je spojována s dermatitidou a rakovinou kůže. Naznačovalo to několik zprávmelanogenezejako důležitý cíl pro léčbu metastatického melanomu [36,37]. Existuje tedy rostoucí potřeba vyvíjet antimelanogenní látky, které regulují melanogenezi bez buněčné toxicity [38]. Na melanogenezi kůže se podílí několik drah [39,40]. Po navázání ligandu MC1R zesiluje aktivitu adenylyl cyklázy, která následně zvyšuje intracelulární hladiny cAMP [41,42]. Bylo publikováno, že cAMP-dependentní aktivace PKA/CREB dráhy zvyšuje transkripční hladiny MITF, a tím zvyšuje syntézu melaninu [43]. MITF funguje jako hlavní regulátor tří hlavních melanogenních enzymů tyrosinázy, TRP-1 a TRP-2u obratlovců [3,21,44]. Tyto enzymy jsou transmembránové proteiny umístěné v melanosomální membráně melanocytů. Tyrosináza reguluje krok omezující rychlostmelanogenezepřeměnou L-tyrosinázy na L-DOPA [23]. TRP-1 a TRP-2 také hrají důležitou roli v syntéze melaninu, i když jejich funkce nejsou plně známy.

V této studii vykazoval Gomisin N, lignanová sloučenina S. chinensis, depigmentační aktivitu bez buněčné toxicity. Gomisin N inhiboval syntézu melaninu v kultivovaných savčích buněčných liniích, stejně jako v embryích zebřiček. Gomisin N se zdál být účinnější než pozitivní kontrola PTU inhibující produkci melaninu v buňkách Melan-A (obrázek 1B). Gomisin N snižoval obsah melaninu způsobem závislým na koncentraci. Ve srovnání s neošetřenou kontrolní skupinou, 10 uMGomisin Nsnížil obsah melaninu asi o 40 procent, bez buněčné toxicity. Antimelanogenní aktivita 10-uM Gomisinu N byla srovnatelná s 100-uM PTU v buňkách Melan-A. Podobně se zdálo, že Gomisin je účinnější než PTU v buňkách B16F10 aktivovaných -MSH, kde účinky 5- a10-µM Gomisinu N byly srovnatelné s účinky 10- a {{12 }}µM PTU, v tomto pořadí (obrázek 1C). Buňky NHEM ošetřené Gomisinem N vykazovaly snížené hladiny L-DOPA, což naznačuje, že GomisinN inhibujetyrosinázaaktivita v kultivovaných buňkách (obrázek 1E). Tato zjištění nás vedla k dalšímu zkoumání základního mechanismu, kterým Gomisin N inhibuje melanogenezi.

Zkoumali jsme, zdaGomisin Npřímo moduluje katalytickou aktivitutyrosinázain vitro. Na rozdíl od kyseliny kojové, Gomisin N nevykazoval inhibiční účinky na aktivitu houbové tyrosinázy (obrázek 2A). Nicméně aktivita buněčné tyrosinázy v lyzátech melanomových buněk B16 byla významně downregulována Gomisinem N jak s ošetřením -MSH, tak bez něj (obrázek 2B,C). Bylo zjištěno, že inhibice buněčné tyrosinázové aktivity Gomisinu N po stimulu -MSH je významnější než u pozitivní kontroly kyseliny kojové (obrázek 2C).

Předpokládali jsme, že antimelanogenní funkce Gomisinu N se může vyskytovat prostřednictvím transkripční nebo post-transkripční regulace tyrosinázy a proteinů příbuzných tyrosináze (TRP). Abychom to potvrdili, měřili jsme hladiny exprese signálních molekul v dráze MC1R, což je hlavní determinant pro kvantita a kvalita produkce melaninu v melanocytech. Očekávaně jsme pozorovali, že Gomisin N snižuje hladiny MC1R a adenylyl cykláz 2 v buňkách Melan-A (obrázek 3A–C). dáleGomisin Nsnížila expresi MITF a jeho cílových proteinů včetně tyrosinázy, TRP-1 a TRP-2 (obrázek 3A,D–G). Tyto výsledky naznačují, že snížené hladiny obsahu melaninu po léčbě Gomisinem N jsou výsledkem deaktivace dráhy MC1R.

Na druhé straně dráhy PI3K/Akt a MAPK/ERK mohou fosforylovat MITF, a tím mohou post-transkripčně modulovat jeho aktivitu [45]. Nicméně celkový účinek aktivace drah PI3K/Akt a MAPK/ERK vmelanogenezeje kontroverzní. Obě dráhy PI3K/Akt a MAPK/ERK jsou u lidských melanomů konstitutivně aktivovány v důsledku nahromaděných mutací [46]. Je známo, že depigmentace zprostředkovaná C2-ceramidem v Mel-Ab buňkách probíhá prostřednictvím snížení hladin p-Akt [47]. Existuje několik přírodních sloučenin, které aktivují melanogenezi zvýšením hladiny p-ERK v buňkách melanomu B16 [28]. Naproti tomu existuje také důkaz, že zvýšené hladiny p-ERK a p-Akt inhibují syntézu melaninu [28,48]. Komplexní inregulaci melanogeneze lze částečně vysvětlit skutečností, že fosforylace zvyšuje transkripční aktivitu MITF, ale současně indukuje degradaci MITF závislou na ubiquition-proteosomu [26,49–51]. Naše data ukázala, že hladiny p-Akt i p-ERK byly upregulovány v buňkách Melan-A ošetřených Gomisinem N (obrázek 3H–J). To znamená, že dráhy PI3K/Akt a MAPK/ERK mohou přispívat k inhibici produkce melaninu.

Dále jsme potvrdili antimelanogenní aktivitu Gomisinu N v modelu zebřičky in vivo. Embrya zebřičky ošetřená Gomisinem N vykázala významné snížení pigmentace melaninu (obrázek 4). Kromě toho Gomisin N výrazně snížil hladinytyrosináza, MITF, TRP-1 a TRP-2 ve vývoji embryí zebřičky. Tato zjištění to společně naznačujíGomisin Nindukuje depigmentaci snížením exprese MITF a melanogenních enzymů in vivo. Antimelanogenní aktivita Gomisinu N byla dále potvrzena v buňkách lidského melanomu MNT-1 stimulovaných rapamycinem. Ačkoli Gomisin N vedl pouze k malým změnám v obsahu melaninu v MNT-1 buňkách (obrázek 1D), byl účinný při zvrácení rapamycinem indukované upregulace MITF, TRP-1 a TRP-2 v způsobem závislým na koncentraci (obrázek 6A,C–E). Celkově vzato, regulační účinekGomisin Nna MITF a melanogenních enzymech byl reprodukovatelně nalezen v myších a lidských buňkách, stejně jako v embryích zebřičky.

Abychom to shrnuli, tato práce naznačuje, že Gomisin N může mít jako román vysoký potenciálbělení kůžečinidlo. Zdá se, že Gomisin N inhibujemelanogenezepotlačením exprese MITF cestou MC1R namísto přímé modulace katalytické aktivitytyrosinázaa TRP. Ačkoli je třeba ještě objasnit podrobné mechanismy, depigmentace vyvolaná Gomisinem N bude pravděpodobně spojena s aktivací drah PI3K/Akt a MAPK/ERK (obrázek 7).

4. Materiály a metody

4.1. Materiály

RPMI1640 byl zakoupen od Gibco-BRL (Gaithersburg, MD, USA). Dulbeccovo modifikované Eagleovo médium (DMEM), fetální bovinní sérum (FBS) a penicilin-streptomycin (PS) byly zakoupeny od Hyclone (Carlsbad, CA, USA). Médium pro růst melanocytů bylo zakoupeno od PromoCell (Heidelberg, Německo). Fenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 12-O-tetradekanoylforbol-13-acetát (TPA), kyselina kojová, 1-fenyl-2-thiomočovina (PTU), houbová tyrosináza, 3,{{ 9}}dihydroxy-l-fenylalanin (L-DOPA), -MSH, dimethylsulfoxid (DMSO) a paraformaldehyd byly zakoupeny od SigmaChemical Co. (St. Louis, MO, USA).Gomisin Nsloučenina byla poskytnuta Chul Young Kim (Hanyang University, Ansan, Korea). Rapamycin byl zakoupen od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

4.2. Buněčná kultura

Myší melanomová buněčná linie B16F10 byla poskytnuta z Korean Cell Line Bank (Soul, Korea). Myší melanocytové buňky Melan-A [52] byly štědrým darem od Dr. Byeong Gon Lee (SkinResearch Institute, Amore Pacific Co., Yongin -si, Korea). Lidské MNT-1 melanomové buňky byly velkoryse poskytnuty Aeyeong Lee (Collage of Medicine na Dongguk University, Goyang-si, Korea). Primární normální lidské epidermální melanocyty (NHEM) byly zakoupeny od PromoCell (Heidelberg, Německo). Buňky Melan-A byly pěstovány v médiu RPMI 1640 (Gibco, Carlsbad, CA, USA) doplněném 10 procenty FBS, 1 procentem PS a 200 nM TPA. DMEM doplněný o 10 procent FBS a 1 procento PS byl použit k udržení buněk Melan-A a NHEM. Všechny buňky byly inkubovány při 37 °C v inkubátoru s 5% CO2.

4.3. Měření obsahu melaninu

Buňky Melan-A byly nasazeny na 24-jamkovou destičku (1 × 105 buněk/jamku) ošetřenéGomisin Na poté inkubována po dobu 72 hodin. Po 72 hodinách byl změřen obsah melaninu, jak bylo popsáno dříve [53]. Stručně, po odstranění kultivačního média byly buňky třikrát promyty PBS. Poté byl do každé jamky přidán roztok hydroxidu sodného (1 ml, 1 N), aby se rozpustil melanin. Absorbance při 405 nm byla měřena pomocí čtečky mikrodestiček. Tento test byl opakován s buňkami B16F10 (2 x 104 buněk/jamka) a MNT-1 buňkami podle stejné metody.

4.4. Analýza Western Blot

Buňky Melan-A byly vysety do 100 mm misek (1 x 106 buněk/miska) a ošetřeny 1, 5 nebo 10 uMGomisin Npo dobu tří dnů při 37 ◦C. Buňky byly promyty PBS a poté sklizeny pomocí škrabky. Oddělené buňky byly vloženy do 1 ml PBS a centrifugovány při 7500 rpm po dobu 5 minut. Po odstranění horního roztoku byly buněčné pelety lyžovány lyzačním pufrem (50 mM Tris-HCl, pH 8.{15}}, 0,1 % SDS, 150 mM NaCl, 1 % NP-40, 0,02 % azidu sodného, ​​0,5 % deoxycholátu sodného, ​​100 ug/ml PMSF, 1 g/ml aprotininu) po dobu 24 hodin při 4 °C. Celkové proteiny byly extrahovány pomocí ultracentrifugy při 12,000 otáčkách za minutu po dobu 30 minut při 4 °C. Obsah proteinu byl měřen pomocí Bradfordova testu. Proteiny (30 ug) byly separovány pomocí gelu elektroforézy na 10% dodecylsulfátu sodného-polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) a přeneseny na anitrocelulózovou membránu. Membrána byla blokována po dobu 1 hodiny 5% odstředěným mlékem v Tris-pufrovaném fyziologickém roztoku s Tween-20 (TBST) a poté inkubována po dobu 12 hodin při teplotě 4 ◦C s primárními protilátkami zaměřenými na -tubulin (Santa Cruz, CA, USA ), MITF (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), tyrosináza (Cell Signaling), ERK (Cell Signaling), fosfo-ERK (Cell Signaling), AKT (Cell Signaling), fosfo-AKT (Cell Signaling), MC1R ( Santa Cruz), adenylylcyklázy 2 (Santa Cruz), TRP-1 (Santa Cruz) a TRP-2 (Santa Cruz). Po odstranění primárních protilátek byly membrány třikrát promyty TBST a inkubovány se sekundárním protilátky (králičí anti-kozí IgG-HRP; myší anti-králičí HRP, Santa Cruz) po dobu 1 h. Membrány byly ošetřeny zesíleným chemiluminiscenčním činidlem za použití zobrazovacího systému ChemiDoc XRS plus (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Denzitometrická analýza pásů byla provedena pomocí softwaru Image MasterTM 2D Elite (verze 3.1, GE Healthcare, Chicago, IL, USA).

4.5. Test tyrosinázové aktivity

Odhadnout inhibiční účinek Gomisinu N na houbytyrosinázaaktivity, byla tyrosináza inkubována s 1, 5 nebo 10 uMGomisin Nnebo pozitivní kontrola kyselina kojová. Každý vzorek byl rozpuštěn v methanolu. L-DOPA (8,3 mM) a houbová tyrosináza (125 U) byly zředěny v 80 mM fosfátovém pufru (pH 6,8). 40 ul každého vzorku a 120 ul L-DOPA bylo smícháno v 96-jamkové destičce, poté bylo přidáno 40 ul zředěné houbové tyrosinázy. Destičky byly poté inkubovány po dobu 15 minut a absorbance byla měřena při 490 nm pomocí čtečky mikrodestiček.

tyrosinázaaktivita v lyzátech melanomových buněk B16 byla měřena s nebo bez ošetření -MSH, jak dříve popsal Ohguchi et al. [54], s drobnými úpravami. Buněčný lyzát byl připraven tak, jak je popsáno výše v části analýzy Western Blot. Celkové proteiny v supernatantu byly měřeny Bradfordovým testem za použití bovinního sérového albuminu jako standardu [55]. Stejné množství proteinů bylo zředěno a použito pro test tyrosinázové aktivity.

inhibují aktivitu tyrosinázy

4.6. Barvení L-DOPA v buňkách NHEM

Buňky NHEM byly nasazeny na {{0}}jamkovou destičku a inkubovány po dobu 72 hodin s Gomisinem N. Buňky byly fixovány 4% paraformaldehydem po dobu 40 min, poté následovalo ošetření 0,1% Tritonem X{ {6}} po dobu 2 minut. Do každé jamky byla přidána L-DOPA (0,1 procenta) a následovala inkubace po dobu 2 hodin. Po odstranění roztoku byly buňky dvakrát promyty PBS. Snímky byly vyfotografovány mikroskopem.

4.7. Experimenty se zebrafish

Embrya zebrafish byla získána od Zebrafish Resource Bank (Daegu, Korea). Embrya byla ošetřena Gomisinem N po dobu 72 hodin. Depigmentační účinekGomisin Nna embryích zebrafish byla pozorována pod stereomikroskopem. Pro analýzu Western blot byla embrya ošetřená Gomisinem N lyžována pomocí lyzačního pufru, ze kterého byly připraveny celkové proteiny, jak je uvedeno výše.

5. Závěry

Náš výsledek podporuje názor, že Gomisin N má vysoký potenciál pro použití jako funkční potravinabělení kůžečinidlo.Gomisin Nje jednou z hlavních lignanových sloučenin v S. Chinensis. Ve faktech. Chinensis je bylinný lék používaný k léčbě mnoha lidských nemocí. K prokázání bezpečnosti přípravku Gomisin N na kůži jsou však nutné další epidemiologické studie. V důsledku toho budou in vivo studie a klinické studie schopny jasněji prokázat účinnost GomisinN. Závěrem, tato studie to naznačujeGomisin Nmůže být potenciálním hypopigmentačním agens a přírodníbělení kůžekandidát pro kosmetický průmysl.

cistanche zlepšit bělení

Reference

1. Alaluf, S.; Atkins, D.; Barrett, K.; Blount, M.; Carter, N.; Heath, A. Vliv epidermálního melaninu na objektivní měření barvy lidské kůže. Pigment Cell Res. 2002, 15, 119–126. [CrossRef] [PubMed]

2. D'Mello, SA; Finlay, GJ; Baguley, BC; Askarian-Amiri, ME signální cesty v melanogenezi. Int. J.Mol. Sci. 2016, 17, 1144. [CrossRef] [PubMed]

3. Slominski, A.; Tobin, DJ; Shibahara, S.; Wortsman, J. Pigmentace melaninu v kůži savců a její hormonální regulace. Physiol. Rev. 2004, 84, 1155–1228. [CrossRef] [PubMed]

4. Herrling, T.; Jung, K.; Fuchs, J. Úloha melaninu jako ochránce před volnými radikály v kůži a jeho role jako indikátoru volných radikálů ve vlasech. Spectrochim Acta A Mol. Biomol. Spectrosc. 2008, 69, 1429–1435. [CrossRef] [PubMed]

5. Brozyna, AA; Jozwicki, W.; Roszkowski, K.; Filipiak, J.; Slominski, AT Obsah melaninu v melanomametastázách ovlivňuje výsledek radioterapie. Oncotarget 2016, 7, 17844–17853. [CrossRef] [PubMed]

6. Slominski, A.; Wortsman, J.; Plonka, PM; Schallreuter, KU; Paus, R.; Tobin, DJ Pigmentace vlasových folikulů.J. Vyšetřování. Dermatol. 2005, 124, 13–21. [CrossRef] [PubMed]

7. Slominski, A.; Zmijewski, MA; Pawelek, J. L-tyrosin a L-dihydroxyfenylalanin jako hormonálně podobné regulátory funkcí melanocytů. Pigment Cell Melanoma Res. 2012, 25, 14–27. [CrossRef] [PubMed]

8. Lee, AY Nedávný pokrok v patogenezi melasmatu. Pigment Cell Melanoma Res. 2015, 28, 648–660. [CrossRef][PubMed]9. Speckaert, R.; van Gele, M.; Speckaert, MM; Lambert, J.; van Geel, N. Biologie hyperpigmentačních syndromů. Pigment Cell Melanoma Res. 2014, 27, 512–524. [CrossRef] [PubMed]

10. Slominski, RM; Zmijewski, MA; Slominski, AT Role melaninového pigmentu u melanomu. Exp. Dermatol.2015, 24, 258–259. [CrossRef] [PubMed]11. Slominski, A.; Wortsman, J.; Tobin, DJ Kožní serotoninergní/melatoninergní systém: Zajištění místa pod sluncem. FASEB J. 2005, 19, 176–194. [CrossRef] [PubMed]

12. Sarkar, R.; Arora, P.; Garg, KV Cosmeceuticals pro hyperpigmentaci: Co je k dispozici? J. CutaneousAesthet. Surg. 2013, 6, 4–11. [CrossRef] [PubMed]

13. Miyamura, Y.; Coelho, SG; Wolber, R.; Miller, SA; Wakamatsu, K.; Zmudzka, BZ; Ito, S.; Smuda, C.; Passeron, T.; Choi, W.; a kol. Regulace pigmentace lidské kůže a reakce na ultrafialové záření. Pigment Cell Res. 2007, 20, 2–13. [CrossRef] [PubMed]

14. Davis, EC; Callender, VD Pozánětlivá hyperpigmentace: Přehled epidemiologie, klinických vlastností a možností léčby u barvy pleti. J. Clin. Estét. Dermatol. 2010, 3, 20–31. [PubMed]

15. Sales-Campos, H.; Souza, PR; Peghini, BC; da Silva, JS; Cardoso, ČR Přehled modulačních účinků kyseliny olejové na zdraví a nemoci. Mini. Med. Chem. 2013, 13, 201–210. [CrossRef] [PubMed]

16. Parvez, S.; Kang, M.; Chung, HS; Cho, C.; Hong, MC; Shin, MK; Bae, H. Přehled a mechanismus depigmentačních a zesvětlujících činidel. Phytother. Res. 2006, 20, 921–934. [CrossRef] [PubMed]

17. Luo, L.; Jiang, L.; Geng, C.; Cao, J.; Zhong, L. Hydrochinonem indukovaná genotoxicita a oxidativní poškození DNA v buňkách HepG2. Chem. Biol. Komunikujte. 2008, 173, 1–8. [CrossRef] [PubMed]

18. Enguita, FJ; Leitao, AL Hydrochinon: Znečištění životního prostředí, toxicita a mikrobiální odpovědi. BioMed Res. Int. 2013, 2013, 542168. [CrossRef] [PubMed]

19. Draelos, ZD Přípravky pro zesvětlení pleti a kontroverze hydrochinonu. Dermatol. Ther. 2007, 20 308–313. [CrossRef] [PubMed]

20. Koo, JH; Lee, I.; Yun, SK; Kim, HU; Park, BH; Park, JW Zmýdelněný pupalkový olej snižuje melanogenezi v buňkách melanomu B16 a snižuje pigmentaci kůže způsobenou UV zářením u lidí. Lipidy 2010,45, 401–407. [CrossRef] [PubMed]

21. Cordell, GA; Colvard, MD Přírodní produkty a tradiční medicína: Zapnutí paradigmatu. J. Nat. Prod.2012, 75, 514–525. [CrossRef] [PubMed]

22. Panossian, A.; Wikman, G. Farmakologie Schisandry Chinensis Bail: Přehled ruského výzkumu a použití v medicíně. J. Ethnopharmacol. 2008, 118, 183–212. [CrossRef] [PubMed]

23. Chen, P.; Pang, S.; Yang, N.; Meng, H.; Liu, J.; Zhou, N.; Zhang, M.; Xu, Z.; Gao, W.; Chen, B.; a kol. Příznivé účinky Schisandrinu B na srdeční funkci u myšího modelu infarktu myokardu. PLoS ONE 2013, 8,e79418. [CrossRef] [PubMed]

24. Lee, HJ; Jo, S.; Ryu, J.; Jeong, HS; Lee, G.; Ryu, MH; Jung, MH; Kim, H.; Kim, BJ Účinky SchisandraChinensis Turcz. ovoce při kontaktní dermatitidě vyvolané dinitrofluorbenzenem u myší. Mol. Med. Zpráva 2015,12, 2135–2139. [CrossRef] [PubMed]

25. Chun, JN; Cho, M.; Takže, I.; Jeon, JH Ochranné účinky extraktu z ovoce Schisandra Chinensis a jeho lignanů proti kardiovaskulárním onemocněním: Přehled molekulárních mechanismů. Fitoterapia 2014, 97, 224–233.[CrossRef] [PubMed]

26. Kang, OH; Chae, HS; Choi, JH; Choi, HJ; Park, PS; Cho, SH; Lee, GH; Takže, HY; Choo, YK; Kweon, OH; a kol. Účinky vodního extraktu Schisandra Fructus na uvolňování cytokinů z buněčné linie lidského masti. J. Med. Jídlo 2006, 9, 480–486. [CrossRef] [PubMed]

27. Poma, A.; Bianchini, S.; Miranda, M. Inhibice L-tyrosinem indukované produkce mikrojader fenylthiomočovinou v lidských melanomových buňkách. Mutat. Res. 1999, 446, 143–148. [CrossRef]

28. Kim, HJ; Kim, IS; Dong, Y.; Lee, IS; Kim, JS; Kim, JS; Woo, JT; Cha, Efekt cirsimaritinu indukující melanogenezi prostřednictvím zvýšení transkripčního faktoru spojeného s mikroftalmií a exprese tyrosinázy. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 8772–8788. [CrossRef] [PubMed]

29. Busca, R.; Abbe, P.; Mantoux, F.; Aberdam, E.; Peyssonnaux, C.; Eychene, A.; Ortonne, JP; Ballotti, R. Ras zprostředkovává cAMP-dependentní aktivaci extracelulárních signálem regulovaných kináz (ERK) v melanocytech. EMBO J. 2000, 19, 2900–2910. [CrossRef] [PubMed]

30. Busca, R.; Ballotti, R. Cyklický AMP klíčový posel v regulaci kožní pigmentace. Pigment Cell Res. 2000, 13, 60–69. [CrossRef] [PubMed]

31. Hah, YS; Cho, HY; Lim, TY; Park, DH; Kim, HM; Yoon, J.; Kim, JG; Kim, CY; Yoon, TJ Indukce melanogeneze rapamycinem v lidských MNT-1 melanomových buňkách. Ann. Dermatol. 2012, 24, 151–157. [CrossRef][PubMed]

32. Yun, WJ; Kim, EY; Park, JE; Jo, SY; Bang, SH; Chang, EJ; Chang, SE Proteinový lehký řetězec 3 spojený s mikrotubuly se účastní melanogeneze prostřednictvím regulace exprese MITF v melanocytech. Sci. Zpráva. 2016, 6, 19914. [CrossRef] [PubMed]

33. Spritz, RA; Sluch, VJ, Jr. Genetické poruchy pigmentace. Adv. Hučení. Genet. 1994, 22, 1–45. [PubMed]

34. Kadekaro, AL; Chen, J.; Yang, J.; Chen, S.; Jameson, J.; Swope, VB; Cheng, T.; Kadakia, M.; Abdel-Malek, Z. -hormon stimulující melanocyty potlačuje oxidační stres prostřednictvím a53-zprostředkované signální dráhy v lidských melanocytech. Mol. Cancer Res. 2012, 10, 778–786. [CrossRef] [PubMed]

35. Wasmeier, C.; Hume, AN; Bolasco, G.; Seabra, MC Melanosomes na první pohled. J. Cell Sci. 2008, 121,3995–3999. [CrossRef] [PubMed]

36. Brozyna, AA; Jozwicki, W.; Carlson, JA; Slominski, AT Melanogeneze ovlivňuje celkové přežití a přežití bez onemocnění u pacientů s melanomem stadia III a IV. Hučení. Pathol. 2013, 44, 2071–2074. [CrossRef] [PubMed]

37. Slominski, A.; Kim, TK; Brozyna, AA; Janjetovič, Z.; Brooks, DL; Schwab, LP; Skobowiat, C.; Jozwicki, W.;Seagroves, TN Úloha melanogeneze v regulaci chování melanomu: Melanogeneze vede ke stimulaci exprese HIF-1 a doprovodných drah závislých na HIF. Oblouk. Biochem. Biophys. 2014, 563,79–93. [CrossRef] [PubMed]

38. Kim, HJ; Lee, JH; Shin, MK; Hyun Leem, K.; Kim, YJ; Lee, MH Inhibiční účinek extraktu Gastrodia elata na melanogenezi v buňkách melanomu HM3KO. J. Cosmet. Sci. 2013, 64, 89–98. [PubMed]

39. Hemesath, TJ; Cena, ER; Takemoto, C.; Badalian, T.; Fisher, DE MAP kináza spojuje transkripční faktorMikroftalmii se signalizací c-Kit v melanocytech. Příroda 1998, 391, 298–301. [PubMed]

40. Cena, ER; Ding, HF; Badalian, T.; Bhattacharya, S.; Takemoto, C.; Yao, TP; Hemesath, TJ; Fisher, DELlineage-specifická signalizace v melanocytech. Stimulace C-kit rekrutuje p300/CBP k mikroftalmii.J. Biol. Chem. 1998, 273, 17983–17986. [CrossRef] [PubMed]

41. Bertolotto, C.; Abbe, P.; Hemesath, TJ; Bille, K.; Fisher, DE; Ortonne, JP; Ballotti, R. Produkt Microphthalmiagene jako signální převodník v cAMP-indukované diferenciaci melanocytů. J. Cell Biol. 1998, 142,827-835. [CrossRef] [PubMed]

42. Pogenberg, V.; Ogmundsdottir, MH; Bergsteinsdottir, K.; Schepsky, A.; Phung, B.; Deineko, V.; Milewski, M.;Steingrimsson, E.; Wilmanns, M. Omezená dimerizace leucinového zipu a specificita rozpoznávání DNA hlavního regulátoru melanocytů MITF. Genes Dev. 2012, 26, 2647–2658. [CrossRef] [PubMed]

43. Flaherty, KT; Hodi, FS; Fisher, DE Od genů k lékům: Cílené strategie pro melanom. Nat. Rev. Rak2012, 12, 349–361. [CrossRef] [PubMed]

44. Lee, TH; Seo, JO; Baek, SH; Kim, SY Inhibiční účinky resveratrolu na syntézu melaninu v ultrafialové B-indukované pigmentaci v kůži morčete. Biomol. Ther. 2014, 22, 35–40. [CrossRef] [PubMed]

45. Su, TR; Lin, JJ; Tsai, CC; Huang, TK; Yang, ZY; Wu, MO; Zheng, YQ; Su, CC; Wu, YJ Inhibice melanogeneze kyselinou galovou: Možné zapojení signálních drah PI3K/Akt, MEK/ERK a Wnt/-catenin v buňkách B16F10. Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 20443–20458. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Yajima, I.; Kumasaka, MY; Thang, ND; Goto, Y.; Takeda, K.; Yamashita, O.; Iida, M.; Ohgami, N.; Tamura, H.; Kawamoto, Y.; a kol. Signalizace RAS/RAF/MEK/ERK a PI3K/PTEN/AKT v progresi a terapii maligního melanomu. Dermatol. Res. Praxe. 2012, 2012, 354191. [CrossRef] [PubMed]

47. Kim, DS; Kim, SY; Měsíc, SJ; Chung, JH; Kim, KH; Cho, KH; Park, KC Ceramid inhibuje proliferaci buněk prostřednictvím inaktivace AKT/PKB a snižuje syntézu melaninu v buňkách Mel-Ab. Pigment Cell Res. 2001, 14, 110–115. [CrossRef] [PubMed]

48. Kim, JH; Baek, SH; Kim, DH; Choi, TY; Yoon, TJ; Hwang, JS; Kim, MR; Kwon, HJ; Lee, CHDdownregulace syntézy melaninu pomocí A a její aplikace na in vivo model blesku. J.Investig. Dermatol. 2008, 128, 1227–1235. [CrossRef] [PubMed]

49. Hartman, ML; Czyz, M. MITF u melanomu: Mechanismy za jeho projevem a aktivitou. Cell Mol.Life Sci. 2015, 72, 1249–1260. [CrossRef] [PubMed]

50. Kim, DS; Hwang, ES; Lee, JE; Kim, SY; Kwon, SB; Park, KC sfingosin-1-fosfát snižuje syntézu melaninu prostřednictvím trvalé aktivace ERK a následné degradace MITF. J. Cell Sci. 2003, 116,1699–1706. [CrossRef] [PubMed]

51. Xu, W.; Gong, L.; Haddád, MM; Bischof, O.; Campisi, J.; Yeh, ET; Medrano, EE Regulace hladin proteinu MITF transkripčního faktoru asociovaného s mikroftalmií asociací s enzymem konjugujícím ubikvitin hUBC9. Exp. Cell Res. 2000, 255, 135–143. [CrossRef] [PubMed]

52. Bennett, DC; Cooper, PJ; Hart, IR Linie netumorogenních myších melanocytů, syngenních s melanomem B16 a vyžadujících pro růst nádorový promotor. Int. J. Cancer 1987, 39, 414–418. [CrossRef][PubMed]

53. Meira, WV; Heinrich, TA; Cadena, SM; Martinez, GR Melanogeneze inhibuje dýchání v buňkách melanomu B16-F10, zatímco zvyšuje obsah mitochondriálních buněk. Exp. Cell Res. 2017, 350, 62–72. [CrossRef][PubMed]

54. Ohguchi, K.; Tanaka, T.; Iliya, I.; Ito, T.; Iinuma, M.; Matsumoto, K.; Akao, Y.; Nozawa, Y. Gnetol jako inhibitor potenctyrozinázy z rodu Gnetum. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003, 67, 663–665. [CrossRef] [PubMed]

55. Uchida, R.; Ishikawa, S.; Tomoda, H. Inhibice aktivity tyrosinázy a melaninové pigmentace pomocí2-hydroxytyrosolu. Acta Pharm. Sinica B 2014, 4, 141–145. [CrossRef] [PubMed]