Část 2: Renovaskulární účinky anorganických nitrátů po ischemii-reperfuzi ledvin

Pro více informací Kontakttina.xiang@wecistanche.com

3. Výsledky

3.1. Suplementace nitrátů zvyšuje markery biologické aktivity NO a zmírňuje renální dysfunkci po IR

Hladiny dusičnanů a dusitanů byly zvýšeny a cGMP měl tendenci se zvyšovat u myší po léčbě dusičnany (obr. 1A-C). Renální dysfunkce, jak se odráží ve změnách BUN a GFR, byla také zlepšena nitráty (obr. 1D a E).

3.2. Dusičnany zeslabují odezvu krevního tlaku a renální hladiny Ang II po IR

Po dvou týdnech reperfuze byl krevní tlak mírně zvýšený ve skupině IR ve srovnání s kontrolními skupinami s falešnou operací. Léčba nitráty tomuto zvýšení krevního tlaku zabránila (obr. 2A-C). Abychom prozkoumali souvislost se změnami v systému renin-angiotensin, měřili jsme hladiny Ang II v plazmě aledvinové tkáně. Naše data ukazují, že Ang II v plazmě byl mezi skupinami podobný, zvýšený v ischemické ledvině, ale významně se nezměnil v neischemické ledvině (obr. 2D-F). Dusičnan zabránil zvýšení AngⅡ v renálních tkáních po IR, což může přispívat k jeho účinkům na krevní tlak.

Kliknutím získáte další informace. o cistanche výhodách

3.3. Dusičnany zlepšují renální histopatologické změny, zánět a apoptózu po IR

Dále jsme analyzovali renální histopatologické změny po IR pomocí H&E a PAS barvení. IR skupina vykazovala hluboké glomerulární poškození kombinované s tubulární nekrózou ve srovnání s falešně operovanými kontrolami (obr. 3A-F a tabulka 1). IR myši léčené nitráty měly významně méně histopatologických změn, jak je patrné z menší tvorby odlitků, nekrózy a ruptury ektázie tubulární bazální membrány a více tubulární regenerace a nekrotické tubuly v regeneraci (obr. 3A-F a tabulka 1). Navíc imunobarvení F4/80 ukázalo podstatnou infiltraci makrofágů v ischemické ledvině po IR, které bylo zabráněno ošetřením dusičnany (obr. 4A a B). Barvení TUNEL k detekci apoptózy bylo významně zvýšené po IR poškození, které bylo opět významně sníženo nitrátem (obr. 4C a D)[6].

3.4 Dusičnan zlepšuje poškození mitochondrií po renálním IR prostřednictvím mechanismů, které oživují obnovu hladin proteinu TFAM

Renální mitochondriální abnormality a dysfunkce spojené s nadměrnou produkcí ROS se podílejí na patogenezi renálního dávkování. včetně AN [27.28]. Naše data ukazují, že mitochondriální transkripční faktor A (TFAM), který je klíčovým regulátorem exprese mitochondriálních genů [29], byl v IR ledvině významně snížen (Hg.5A-C). Léčba dusičnany nebyla spojena s žádnými významnými změnami v TFAM v IR ledvině, ale zvýšila jeho expresi v neischemické ledvině po IR (obr. 5A-C).

3.5. Léčba dusičnany zmírňuje kontraktilitu interlobárních arterií a aferentních arterií po renálním R indukovanou Ang II

Dále jsme použili myografickou techniku ​​k posouzení účinků IR na vaskulární funkci ve velkých intrarenálních cévách levé ledviny po reperfuzi. Kontraktilita na fenylefrin se mezi experimentálními skupinami významně nelišila (obr. 6A). Nicméně kontraktilita indukovaná Ang I byla významně zvýšena v IR ledvině (Hg.6B), čemuž bylo zabráněno ošetřením nitráty. V izolovaných a perfundovaných aferentních arteriolách (obr. 6C) byla citlivost a maximální kontraktilní reakce na Ang II také zvýšeny v IR ledvině, čemuž bylo do značné míry zabráněno léčbou dusičnany (1, 6D).

3.6.Fypoxie-treoxygenace zajištěná buněčná apoptóza a mi chandndl abnormality v glomerulárních endoteliálních buňkách jsou zmírněny nitie

V dalších studiích cévního mechanismu. zaměřené na napodobování in vivo IR modelu jsme použili GEC. V této buněčné studii jsme k bypassu použili dusitany místo dusičnanů, což je první krok v cestě dusičnan-dusitan-NO, která vyžaduje komenzální bakterie in vivo. Hypoxie následovaná reoxygenací v GEC snížila životaschopnost buněk/zvýšila mortalitu (obr. 7A a B).

To bylo spojeno se zvýšenými hladinami štěpené kaspázy-3, sníženou expresí mitochondriálního komplexu IⅡ a TFAM (obr. 7C-G) a mitochondriální produkcí ROS, jak ukazuje MitoSox (obr. 7H). Všechny tyto abnormality spojené s hypoxií a reoxygenací byly zlepšeny současnou léčbou dusitany.

Naše in vivo data ukázala, že IR-indukovaná vaskulární poškození a dysfunkce byly spojeny se zvýšenými renálními hladinami Ang II a citlivostí (obr. 2E a 6B a D). V přítomnosti Ang I hypoxia-reoxygenace snížila životaschopnost buněk a dále zvýšila mitochondriální Produkce ROS (obr. S1 a obr. 8), která byla opět snížena úpravou dusitany.

3.7. Ochranné účinky dusitanů po hypoxii-reoxygenaci v glomerulárních endoteliálních buňkách jsou odstraněny inhibicí xanthinoxidoreduktázy

XOR je považován za jeden z klíčových enzymů podílejících se na redukci dusitanů na NO a další bioaktivní druhy oxidů dusíku. Zde ukazujeme, že v přítomnosti selektivního inhibitoru XOR febuxostatu byly zrušeny příznivé účinky dusitanů na životaschopnost buněk, expresi TFAM a mitochondriální ROS (obr. 9A-D) po hypoxii-reoxygenaci kombinované s Ang I v GEC. Údaje o životaschopnosti buněk v nepřítomnosti Ang II ve skupině s vehikulem jsou ukázány na obr. S2.

4. Diskuze

V této studii prokazujeme, že ošetření anorganickými dusičnany bezprostředně předrenální ischemievýznamně snižuje glomerulární a tubulární poškození, stejně jako ztrátu renálních funkcí po 2 týdnech reperfuze. Tyto příznivé účinky nitrátů jsou spojeny s tlumenými zánětlivými reakcemi a reakcemi angiotenzinu II, spojenými s modulací mitochondriálních funkcí.oxidační stresa životaschopnost buněk.

Toto je první popis toho, jak posílení dráhy dusičnan-dusitan-NO před ischemickou příhodou může chránit ledvinu proti následné renální a endoteliální dysfunkci a poraněním souvisejícím s reperfuzí.

Generace NO odvozená od NO je životně důležitá pro mnoho kardiovaskulárních arenální funkcevčetně modulace krevního tlaku a autoregulace ledvin a také manipulace s tubulárním elektrolytem [30-32]. V podmínkách s nízkou tenzí kyslíku a nízkým pH je však tento enzymatický systém narušen, což vede k nedostatku NO nebo dokonce k odpojení NOS, což zvyšuje produkci reaktivních forem kyslíku [6,30]. Alternativní cesta dusičnan-dusitan-NO je nezávislá na systému NOS a může být podpořena naší každodenní stravou. Důležité je, že účinnost cesty dusičnan-dusitan-NO je výrazně zvýšena u stavů s ischemií nebo hypoxií, kdy je narušen systém NOS [9,33]. Experimentální a klinické studie prokázaly příznivé kardiovaskulární účinky suplementace nitrátů, včetně zlepšení endoteliální funkce a snížení krevního tlaku u normotenzních a hypertenzních jedinců [1]. Již dříve jsme ukázali, že renální mikrovaskulatura skvěle reaguje na vazodilataci zprostředkovanou dusitany [23], zejména během kyselých podmínek a podmínek s nízkým obsahem kyslíku napodobujících in vivo ischemické prostředí [20]. Celkově tato zjištění naznačují, že léčba dusičnany může být spojena s ochranou orgánů po IR.

Předchozí studie využívající dusitanové intervence přinesly poněkud rozporuplné výsledky, pokud jde o jeho terapeutickou hodnotu v modelech poranění IR na hlodavcích [16,17,34,35]. Triptatara a kol. ukázaly, že akutní renální topické podání dusitanů (30 nmol) chránilo ledviny potkana před 60minutovou bilaterální ischemií a 6hodinovým reperfuzním poraněním a dysfunkcí in vivo, alespoň částečně, prostřednictvím XOR- závislá produkce NO [16]. S použitím myšího transgenního přístupu, zjištění Milsom et al. navrhl, že eNOS je zásadní hráč, protože přispívá ke snížení dusitanů během IR, a tím zprostředkovává ochranu [35]. Ve shodě, Cantor a kolegové ukázali, že akutní systémové podání dusitanů (0.172 následované 0,057 mg/h/kg) významně zlepšilo renální reoxygenaci a reperfuzi po jednostranné ischemii (45 min) a 60 min reperfuzi u potkanů ​​[ 34]. Naproti tomu Basireddy et al. nepozorovali žádné ochranné účinky akutního systémového podávání dusitanů (0,{19}} nmol/g/kg) u potkanů ​​podrobených jednostranné nefrektomii s následnou 45minutovou ischemií zbývající ledviny a 24-48 h reperfuze [17]. Možnými vysvětleními těchto rozdílů mohou být různé experimentální přístupy (tj. IR model, trvání IR period), dávkový režim, způsob podávání a druhové rozdíly. V současné době je méně znalostí o terapeutické hodnotě použití anorganických dusičnanů místo dusitanů. Dusičnany lze bezpečně podávat ve vyšších dávkách než dusitany a mají mnohem delší poločas rozpadu (6 h vs. 30 min), což umožňuje kontinuální tvorbu dusitanů, NO a dalších bioaktivních oxidů dusíku po mnohem delší dobu. V tomto kontextu lze dusičnany považovat za proléčivo pro kontinuálnější tvorbu dusitanů.

V předchozí studii na myších jsme ukázali, že dusičnany ve stravě po dobu 2 týdnů chránily ledviny před poškozením IR prostřednictvím mechanismů, které zahrnují modulaci fenotypu imunitních buněk a antioxidační vlastnosti [18]. Namísto napodobování scénáře chronického vysokého příjmu dusičnanů současná studie testovala účinky akutního podání před ischemickým poškozením. Tento přístup je atraktivnější z klinického a terapeutického hlediska, protože by mohl připomínat akutní intervenci před ischemií u pacienta s rizikem rozvoje AKI. Naše současná studie ukázala, že akutní léčba dusičnany následovaná trvalou suplementací dusičnanů po dobu 2 týdnů významně zvýšila hladiny dusičnanů, dusitanů a cGMP v oběhu. Morfologická analýza ukázala, že léčba dusičnany zlepšila poranění vyvolaná IR ve srovnání s neléčenými kontrolami IR. Spolu se snížením renálního strukturálního poškození léčba nitráty zachovala funkci ledvin po IR poranění. Protože se plazmatický kreatinin obvykle vrací k normálním hladinám jeden týden po reperfuzi [36,37, měřili jsme BUN a GFR, abychom vyhodnotili renální funkce po 2 týdnech reperfuze. GFR a BUN nebyly významně změněny po IR ve srovnání s kontrolními kontrolami s falešnou operací, což je pravděpodobně vysvětleno kontralaterální kompenzující ledvinou. Naše data však ukazují, že oba tyto parametry byly významně zlepšeny dusičnany ve srovnání s neléčenou IR skupinou.

Zánětlivé reakcea buněčná apoptóza jsou klíčové biologické procesy během IR poškození, které přispívají k odstranění buněčného odpadu a adekvátní opravě tkáně [18,24]. Dlouhodobý a neřešený zánět však může dále zhoršit poškození tkáně [7,38,39].Renální zánět, jak bylo detekováno F4/80 barvením infiltrace makrofágů, bylo významně sníženo dusičnany po IR. To je v souladu s nedávno publikovanými studiemi Yang et al. [18] a Khambata et al. [40] Kromě toho test TUNEL na apoptózu objasnil, že IR poškození zvýšilo buněčnou apoptózu v myších ischemických ledvinách, které bylo částečně zabráněno léčbou nitráty. Dohromady tyto výsledky jasně naznačují, že léčba dusičnany může inhibovat zánět ledvin a buněčnou apoptózu, ke kterým dochází po IR.

Hromadné důkazy ukazují, že mitochondriální dysfunkce významně přispívá k rozvoji AKI po IR, a nové přístupy, které modulují mitochondriální funkci, proto mohou mít terapeutickou hodnotu [41-45]. Například v ischemické ledvině jsou mitochondrie v endoteliálních buňkách významně změněny jak funkčně, tak morfologicky a stávají se extrémně reaktivními a poškozují sebe i okolní mitochondrie [44]. Již dříve jsme ukázali, že dusičnany ve stravě zlepšují mitochondriální účinnost u lidí [46]. Stimulace dráhy dusičnan-dusitan-NO byla v několika nedávných experimentálních studiích spojena s příznivými účinky na mitochondriální funkce během metabolických poruch, včetně diabetu 2. typu, prostřednictvím mechanismů, které zahrnují tlumení oxidačního stresu [47]. Shiva a kolegové navíc prokázali, že jak před, tak akutní léčba anorganickými dusitany má cytoprotektivní účinky a potenciálně omezuje srdeční a jaterní reperfuzní poškození prostřednictvím modulace řetězce transportu elektronů mitochondrií a snížení ROS [48]. V našem in vivo IR modelu byl TFAM zvýšen v neischemické ledvině, ale významně se nezměnil v ischemické ledvině. Vzhledem k tomu, že dusitan obnovil expresi TFAM in vitro po hypoxii-reoxygenaci, spekulujeme, že by to mohlo souviset s časově závislými rozdíly v expresi. V modelu in vivo byla analýza TFAM provedena až po 2 týdnech a je možné, že by tomu bylo jinak v dřívějším časovém bodě po reperfuzi.

Je všeobecně známo, že zvýšená signalizace Ang I stimuluje NADPH oxidázu a produkci ROS odvozenou z mitochondrií, což vede k oxidativnímu stresu [49-51]. Cao a kolegové prokázali, že renocerebrální reflex aktivoval renin-angiotensinový systém po IR, což podporovalo oxidační stres a progresi poškození ledvin [52]. Již dříve jsme prokázali, že léčba dusičnany tlumí Ang I zprostředkovanou kontraktilitu v renálních aferentních arteriolách a hypertenzi prostřednictvím mechanismů, které zahrnují snížení hyperaktivity sympatiku a tlumení oxidačního stresu, stejně jako sníženou expresi receptoru Ang typu 1 [{{7} }]. V souladu s předchozími zjištěními naše data ukazují, že léčba dusičnany snižuje krevní tlak, který byl spojen s nižšími hladinami Ang II v ledvinách po IR a tlumil Ang IⅡ-zprostředkovanou kontraktilitu v interlobárních arteriích i aferentních arteriolách.

Protože abnormality endoteliálních buněk po IRis jsou úzce spojeny s poškozením ledvin a zhoršenou funkcí ledvin, použili jsme dále glomerulární endoteliální buňky (GEC) pro mechanistické studie. K napodobení scénáře IR in vivo byl použit in vitro model hypoxie-reoxygenace se současným ošetřením dusičnany a bez něj. Naše výsledky in vitro ukazují, že hypoxia-reoxygenace zvýšila buněčnou mortalitu, mitochondriální produkci ROS a štěpenou kaspázu-3, snížila životaschopnost buněk a proteinovou expresi komplexu OXPHOS I a TFAM. Všechny tyto abnormální změny byly významně zlepšeny dusitany.

Protože naše data in vivo ukázala, že hladiny Ang I byly zvýšeny v ledvinách po IR, studovali jsme také účinky ošetření dusitany v GEC po hypoxii-reoxygenaci v přítomnosti Ang. Naše data ukazují, že hypoxia-reoxygenace v kombinaci s Ang I dále snížila životaschopnost buněk a zvýšila mitochondriální produkci ROS, čemuž opět zabránila současná léčba dusičnany.

Během normoxie a normálního pH se NO odvozený od NOS oxiduje na dusitany a dusičnany, ale během hypoxie a kyselých podmínek mohou být dusitany redukovány zpět na NO působením nitritreduktázy XOR. Společná inkubace se selektivním inhibitorem XOR febuxostatem zrušila ochranné účinky dusitanů po hypoxii-reoxygenaci v GEC. Tato data naznačují, že XOR katalyzuje redukci dusitanů na NO, což zase zprostředkovává ochranu buněk před poškozením vyvolaným hypoxií-reoxygenací.

Některá omezení současné studie zahrnují to, že nebyla zahrnuta skupina s pouze dusičnanovou léčbou u falešně operovaných zvířat. Hlavním důvodem bylo to, že předchozí studie na normálních potkanech a myších nepozorovaly žádné výrazné účinky při použití podobných dávek dusičnanů na krevní tlak, funkci ledvin nebo vaskulární reaktivitu. Dalším omezením je, že všechny in vivo charakterizace byly provedeny pouze po dvou týdnech reperfuze. Další časové body mohly potenciálně vygenerovat mechanističtější náhled.

Závěrem lze říci, že akutní léčba anorganickými nitráty před příhodou renální ischemie, následovaná trvalou dietní léčbou dusičnany během dvou týdnů reperfuze, chráněná proti renální dysfunkci a poranění prostřednictvím mechanismů, které zahrnují snížení infiltrujících zánětlivých buněk a hladiny angiotenzinu I v ischemickém ledvin a také modulace mitochondriální funkce. Budoucí klinické studie mohou objasnit, zda intervence s anorganickými nitráty mohou poskytnout příznivé účinky u pacientů s vysokým rizikem získání renálního IR poškození.