Část 2: Nedostatek DHHC21 zmírňuje renální dysfunkci během septického poranění

Kontakttina.xiang@wecistanche.com

Diskuse

V této práci uvádíme DHHC21 jako nový regulátor renální perfuze a funkce během septického poškození. Naše nová zjištění naznačují: (1) Zdhhc21devde? myši vykazují lepší renální funkci a menší poškození ledvin po septickém poranění ve srovnání s WT myšmi;(2)funkční deficit DHHC21 zachovává perfuzi ledvinové tkáně, saturaci kyslíkem a RBF při septickém poškození;(3) DHHC21-katalyzovaná alAR palmitoylace je potřebné pro aktivaci signální dráhy alAR a konstrikci renálních arterií indukovanou alAR. Tato studie poskytuje nový mechanistický pohled na regulaci renální perfuze a funkce během septického poškození. Navrhujeme, že funkční nedostatek DHHC21 propůjčuje ochranné účinkyfunkce ledvinpři septickém poškození a že inhibice DHHC21 může sloužit jako terapeutická strategie k bojirenální dysfunkcepři septickém poranění.

Kliknutím sem zjistíte výhody extraktu z cistanche tubulosa

Hypoperfuze/hypoxie renální tkáně je jednou z hlavních příčin renální dysfunkce během septického poškození3-5. Zjistili jsme renální hypoperfuzi u myší po CLP, o čemž svědčí oslabená intenzita signálu MSOT celkového hemoglobinu, snížená saturace kyslíkem v renální tkáni a snížená RBF po septickém poranění. V souladu s našimi zjištěními bylo snížení RBF pozorováno u pacientů se sepsí s poškozením ledvin, stejně jako u modelů septického poškození na velkých zvířatech7,1011. Stojí za zmínku, že několik studií uvádí, že dysfunkce ledvin se může vyvinout u zvířat se sepsí s nezměněnou nebo dokonce zvýšené RBF334. Tyto rozporné nálezy lze přičíst různým zvířecím modelům a metodám používaným k měření průtoku krve. Například zatímco se běžně používá polymikrobiální septické poškození vyvolané CLP, některé studie používají intravenózní injekci Escherichia coli35.

Palmitoylace proteinu byla nedávno popsána jako nový regulátor funkce proteinu, který se podílí na patogenezi a progresi mnoha onemocnění. Poprvé byl identifikován jako nový typ posttranslační modifikace Schmidtem et al.3637. Objev rodiny DHHC od té doby podpořil rychlou expanzi tohoto pole38,39. Úloha palmitoylace a PAT byla popsána v mnoha fyziologických a patologických stavech, včetně metabolismu lipidů,rakovina, kardiovaskulární chorobya neurologické poruchy23,0,4. Přestože účast palmitoylace na polycystickém onemocnění ledvin a rakovině ledvin byla již dříve hlášena23, existují velmi omezené studie zkoumající funkční roli PAT vonemocnění ledvin, konkrétně při renální dysfunkci při septickém poranění. Podle našich nejlepších znalostí jsme první, kdo zkoumal roli DHHC2l při renální dysfunkci při septickém poškození. Naše zjištění naznačují, že inhibice DHHC21 výrazně zachraňuje funkci ledvin a zachovává strukturu ledvin při septickém poškození.

Naše studie využívající Zdhhc21dp/d4? myši demonstrují, že příznivé účinky funkčního deficitu DHHC21 na funkci ledvin jsou připisovány jeho schopnosti zlepšit perfuzi ledvinové tkáně během septického poškození. Za bazálních podmínek nevykazují myši Zdhhc21ewaeP žádné známky nerovnováhy soli/vody nebo renálního strukturálního/funkčního poškození5. Ztráta funkce DHHC21 však potlačuje snížení RBF vyvolané septickým poškozením, renální perfuzi a renální saturaci kyslíkem. Zvýšená renální vaskulární rezistence způsobená nadměrnou renální vazokonstrikcí je považována za hlavní důvod zhoršené perfuze renální tkáně u septického poškození6.9. Naše výsledky naznačují zapojení alAR do zprostředkování hypoperfuze renální tkáně vyvolané septickým poškozením, jak dokazuje zvýšení palmitoylace alAR a aktivace signální dráhy alAR u septického poškození. Funkční deficit DHHC21 však inhibuje alARpalmitoylaci a vede k otupené schopnosti alAR aktivovat jeho downstream efektor a zprostředkovat fenylefrinem indukovanou vazokonstrikci v renálních artériích.

"Molekulární mechanismus, který je základem regulace funkce alAR pomocí DHHC21, stále zůstává plně objasněn. Defekt ve funkci alAR způsobený ztrátou funkce DHHC21 lze připsat konformační změně alAR. Mnoho GPCR se spoléhá na palmitoylaci pro jejich vhodnou intracelulární konformace, připojený palmitát v C-terminálních ocasech GPCR se vkládá do plazmatické membrány a vytváří čtvrtou intracelulární smyčku, která je nezbytná pro interakci GPCR s jejich partnerskými proteiny a propagaci signálů GPCR17,4. naznačil, že k palmitoylaci Albar také dochází v jeho C-terminální oblasti44. Nedostatek palmitoylace lAR zprostředkované DHHC21- proto může změnit intracelulární konformaci alAR, a tak blokovat šíření signálů lAR. To lze podpořit naše výsledky ukazují, že aktivace ERK, následná signalizační událost aktivace alAR, je inhibována u myší Zdhhc21devider vystavených sept. ic zranění. Nicméně DHHC21-regulovaná topologie alAR karboxylového konce musí být dále potvrzena pomocí rentgenové krystalografie.

Dalším novým aspektem naší studie je využití MSOT k hodnocení perfuze ledvin a funkce během septického poškození. MSOT byla hlášena jako metoda bez označení pro měření perfuze různých orgánů a spolehlivá zobrazovací technika k určení funkce ledvin2832,45. Ve srovnání s Dopplerovým průtokoměrem, který neumožňuje vizualizaci mikrovaskulatury45, MSOT generuje snímky s vysokým prostorovým rozlišením při 150 um a zároveň poskytuje kvantitativní hodnocení stavu perfuze v mikrovaskulatuře ledvin. Ve vodě rozpustný IRDye800CW je bezpečný indikátor pro měření renální clearance a nezpůsobuje toxicitu v dávce až 20 mg/kg. Dvoufázový pohyb IRDye800CW, který jsme pozorovali, je v souladu s dříve publikovanými studiemi. Naše záznamy MSOT naznačují větší zpoždění Tmax u sepse ledvin, což naznačuje zhoršenou renální clearance. Studie nefropatie ukazuje, že zhoršená funkce ledvin detekovaná pomocí MSOT významně koreluje s glomerulárním histologickým poškozením30. Naše data, v souladu s předchozími publikacemi, naznačují, že MSOT je minimálně invazivní a spolehlivá technika pro monitorování renální perfuze a funkce.

V současné době nejsou k dispozici žádné 21-specifické inhibitory DHHC. Nejběžněji používaným inhibitorem PAT je 2-BP, který má široký účinek na mnohočetné DHHC a také zasahuje do metabolismu mastných kyselin47. Slibným směrem by tedy byl vývoj inhibitorů s malou molekulou, které by se specificky zaměřovaly na DHHC21. Za zmínku také stojí, že alAR není jediným substrátem DHHC21. Nedávno bylo identifikováno několik dalších substrátů DHHC21, včetně adhezivní molekuly destičkových endoteliálních buněk (PFCA M-1), kaveolinu estrogenového receptoru-1, endoteliální syntázy oxidu dusnatého (eNOS), Fyn, superoxiddismutázy (SOD{{{101} 8}}) a PLCB122,41,4s,49, I když je mimo rámec této studie, nemůžeme vyloučit možnost, že tyto substráty mohou také ovlivnit funkci ledvin během septického poškození.

Na závěr tato studie poprvé prokazuje, že DHHC21 hraje kritickou roli při regulaci renální perfuze během septického poškození prostřednictvím mechanismů zahrnujících alAR palmitoylaci a alAR zprostředkovanou vazokonstrikci. Kromě toho inhibice DHHC21 má ochranné účinky na renální funkci během septického poškození.

Materiály a metody

Reagencie. Všechna činidla jsou uvedena v doplňkové tabulce S1.

Zvířata. Myši Zdhhc21depher a jejich kontrolní myši divokého typu (B6C3Fe) byly zakoupeny od Jackson Laboratory. Genotyp Zdhhc21dephe? myši byly potvrzeny sekvenováním (Genewiz, Inc., NJ, USA). Primery použité pro sekvenování byly: AGCTGACTGAAGGGCACC (vpřed) a AAAACCTGTAACGCATTTCCA (reverzní)23. Zvířata byla chována v 12/12-hodinovém cyklu světlo/tma s volným přístupem k potravě a vodě. Pro tuto studii byly použity myši (16-20 týdnů) obou pohlaví. Všechny pokusy na zvířatech jsou schváleny Institucionálním výborem pro péči o zvířata a použití na University of South Florida a jsou v souladu s NIH Guide for the Care and Use of Laboratory

Podvázání slepého střeva a punkce Myši byly anestetizovány isofluranem (3 procenta indukce a 1 procento udržování). V oholené oblasti břicha byla provedena incize ve střední linii a slepé střevo bylo vyjmuto, těsně podvázáno 5 mm pod ileocekální chlopní a dvakrát perforováno 20- jehlou distálně k bodu podvázání. Z každého punkčního otvoru byl vytlačen jeden mm výkalů. Slepé střevo bylo poté přemístěno a břicho bylo uzavřeno ve dvou vrstvách. Lokálně byl aplikován 37C laktátový Ringerův roztok, aby se zabránilo vysychání slepého střeva. Myším pak byl subkutánně podán 37° 0,9% fyziologický roztok pro tekutinovou resuscitaci. Předoperační 0.5-1 0,5 mg/kg dávka buprenorfinu s postupným uvolňováním byla podána jako analgezie. Falešné myši byly podrobeny stejnému chirurgickému zákroku, ale bez podvázání slepého střeva a punkce50,51.

Multispektrální optoakustická tomografie. Hodnocení renální exkrece IRDye800CW. Myši byly anestetizovány pomocí isofluranu a depilovány kolem oblasti trupu. Myši byly zobrazeny pomocí Altera Medical MSOT Imaging System (Mnichov, Německo) na více vlnových délkách: 700,730,760,775,785, 800,850 nm při rychlosti 10 snímků/s. Myši byly umístěny v poloze na zádech v držáku a pohybovaly se podél horizontální lineární plošiny, aby se ledviny umístily na vršek pevně umístěného konkávního snímače. Po základním záznamu bylo intravenózně injikováno 60 nmol RDve800CW rozpuštěného ve 100 ul 0,9% fyziologického roztoku po dobu 10 s. Snímky byly rekonstruovány pomocí vzorce zpětné projekce a zpracovány multispektrální analýzou. Oblasti zájmu (ROI) byly nakresleny kolem renální kůry a oblasti dřeně/pánve a byly znázorněny časové změny signálu MSOT v oblastech zájmu.

Measurement of renal perfusion. Mice were prepared for MSOT imaging utilizing the same procedures mentioned above. Mouse respiration was closely monitored throughout the entire procedure. Images were reconstructed and spectral unmixing was performed. ROIs were drawn around the entire right kidney region. Mean pixel intensities of oxygenated hemoglobin (HbO,) and deoxygenated hemoglobin (Hb) were acquired. Total hemoglobin (HbT=HbO,+ Hb) and oxygen saturation (So=HbO, /HbT) were then calculated>2.

Histopatologie ledvin. Ledviny byly fixovány, řezány podél sagitální roviny a zpracovány pro zalití parafínem. Řezy (5 μm) byly deparafinizovány, rehydratovány a oxidovány kyselinou jodistou po dobu 8 minut při teplotě místnosti (RT), poté následovala inkubace se Schiffovým roztokem po dobu 25 minut. Řezy byly poté kontrastně obarveny hematoxylinem. Obrázky byly pořízeny pomocí Keyence BZ-X710 (Itasca, IL, USA). Strukturální poškození ledvin bylo hodnoceno na základě následujících znaků: glomerulární abnormalita, ztráta kartáčkového lemu proximálního tubulu, vakuolizace, dilatace epitelu tubulů, odchlípení/nekróza tubulárních buněk a infiltrace neutrofilů. Každý prvek byl hodnocen na stupnici 0-5 na základě závažnosti.

Měření kreatininu a dusíku močoviny v krvi. Krev myší byla odebrána srdeční punkcí 24 hodin po septickém poranění. Plazma byla vytvořena centrifugací krve při 2500 g po dobu 15 minut při teplotě místnosti. Měření kreatininu: plazma byla deproteinována pomocí 10-kDa Spin Column; hladiny kreatininu ve filtrátu byly poté měřeny pomocí soupravy pro stanovení kreatininu. Hladina dusíku močoviny v krvi (BUN) byla stanovena pomocí kolorimetrické detekční soupravy Urea Nitrogen Colorimetric Detection Kit podle pokynů výrobce.

Měření RBF a MAP. Myši byly anestetizovány pomocí isofluranu. Snímač krevního tlaku byl kanylován do krční tepny. Střední řez byl proveden v oblasti břicha a následně levý příčný řez, aby se obnažila renální tepna. RBF byla měřena pomocí ultrazvukového průtokoměru doby průchodu (TS-420; Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA). Po umístění průtokové sondy kolem exponované renální tepny se myši nechaly stabilizovat po dobu alespoň 30 minut. RBF a MAP byly zaznamenány současně pomocí PowerLab (AD Instruments, Colorado Springs, CO, USA). Data byla analyzována pomocí softwaru LabChart Pro verze 74,55

Zachycování pomocí pryskyřice. Renální artérie byly odebrány a lyžovány v lyzačním pufru (100 mM HEPES.25 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 μM palmostatin B, inhibitory proteázy, pH 7,4）22, 56. Tkáňové lyzáty byly inkubovány s blokovacím pufrem (100 mM HEPES, 1 mM EDTA, 2,5 procenta SDS, 6 ul/ml MMTS, pH 7,4) při 50 °C po dobu 30 minut za konstantního vortexování. Po vysrážení studeným acetonem byly proteiny peletovány centrifugací při 5000 g po dobu 30 minut a pětkrát promyty 70% studeným acetonem. Proteinové pelety byly resuspendovány ve vazebném pufru (100 mM HEPES, 1,0 procent SDS, 1 mM EDTA, pH 7,4).Koncentrace proteinu byla stanovena a normalizována mezi skupinami Každý vzorek proteinu byl rozdělen na dvě stejné části, do každé bylo přidáno stejné množství kuliček isopropylsepharose 6B, do každé části byl přidán hydroxvlamin (0,2 M, pH 7,4) a NaCl (0,2 M). Po 4 hodinách inkubace při teplotě místnosti s konstantní rotací byly palmitoylované proteiny eluovány 50 mM DTT v lxvzorkovém pufru a shromážděny pro SDS-PAGE.

Western blotting. Měření palmitoylovaného lAR. Vzorky odebrané z RAC byly naneseny na 4-20procentní Tris-glycinový gel a po elektroforéze přeneseny na nitrocelulózovou membránu. Po blokování po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti byl alAR sondován králičí anti-lAR primární protilátkou (1:500) přes noc při 4 stupních. Po trojím promytí TBST byla membrána inkubována s IRDye800CW oslí anti-králičí sekundární protilátkou (1:20,000) po dobu 45 minut při teplotě místnosti.

Měření fosforylace ERK. Renální artérie byly lyžovány v 1xRIPA obsahujícím inhibitory proteázy a fosfatázy. Membrána byla sondována králičí anti-ERK (1:1000) a myší anti-fosforylovanou ERK (1:1000) protilátkou. IRDye800CW oslí anti-myší a IRDye680RD oslí anti-králičí protilátky byly použity pro sekundární inkubaci (1:20 000). Membrány byly zobrazeny a analyzovány pomocí Li-COR Odyssey CLx.

Hodnocení vazoreaktivity pomocí drátového myografu. Myší ledvinové tepny. Renální tepny (o průměru {{0}} μm) byly izolovány z myší WTand Zdhhc21dp/de a ponořeny do ledově chladného okysličeného (95 procent O,/5 procent CO.) fyziologického fyziologického roztoku (PSS,13{ {47}} mM NaCl, 4,7 mM KCI, 1,18 mM KH,PO, 1,17 mM MgS0.7H,0, 14,9 mM NaHCO, 5,5 mM glukóza, 0,026 mM EDTA a 1,6 mM CaCl, segmenty pH 7,4). 2 mm dlouhé) byly namontovány na drátěnou myografickou komoru (Living Systems Instrumentation, VT, USA) mezi dva wolframové dráty (30 um v průměru). Izometrické napětí bylo zaznamenáno pomocí kondicionéru signálu Living Systems (MYO-SC-1) ve spojení se softwarem LabScribe v4 iWorks. Po 30minutové ekvilibraci při 37 stupních Cin PSS byla provedena normalizační procedura ke stanovení optimálního vnitřního obvodu L,=0,9×L(Lo=vnitřní obvod, který odpovídá transmurálnímu tlaku 100 mmHg) . Dále byla testována životaschopnost cév pomocí 60 mMKPSS (74,7 mM NaCl, 60 mM KCl, 1,18 mM KH, P0.1,17 mM MgS0.7H,O, 14,9 mM NaHCO, 5,5 mM glukóza, 0,026 mM CaClpM EDHTA 7.4). Tepny, které nereagovaly na KPSS, byly vyřazeny. Tepny byly ošetřeny zvyšujícími se koncentracemi fenylefrinu (10 nM-30 μM）). Endoteliální integrita byla poté hodnocena pomocí acetylcholinu (10 μM). Byly sestrojeny křivky koncentrace-odezva.

Malé tepny z lidských ledvin. Malé tepny (~1000 um v průměru) byly vypreparovány z neporušených životaschopných lidských ledvin, které byly odmítnuty pro transplantační operaci. Cévní segmenty (~2 mm dlouhé) byly namontovány na I-tyče (250 um v průměru) drátěné myografické komory. Podobné ekvilibrační a normalizační postupy byly provedeny na lidských tepnách. Dále byly tepny inkubovány s kontrolním vehikulem (0,02 procenta DMSO v PSS) po dobu 1 hodiny. Cévy byly poté testovány na životaschopnost pomocí 60 mM KPSS a ošetřeny zvyšujícími se koncentracemi fenylefrinu (10 nM -30 uM). Po promytí byly nádoby inkubovány s 2-BP (100 uM) po dobu 1 hodiny; životaschopnost cév byla poté znovu testována pomocí 60 mM KPSS se 100 uM 2-BP. Malé tepny s žádnou nebo sníženou odpovědí na KPSS byly vyřazeny. Tepny byly poté stimulovány stejnými koncentracemi fenylefrinu a následně acetylcholinem (10 uM). Křivky koncentrace-odezva kontrolních tepen nebo 2-BP ošetřených tepen byly sestrojeny a porovnány.

Imunofluorescence. Lidské renální tepny byly fixovány v 10procentním formalínu po dobu 48 hodin, zality v parafínu a nařezány. Sklíčka byla poté zbavena parafinu, rehydratována a permeabilizována PBS obsahujícím 0,05 procenta Tritonu X-1002. Po zablokování byla sklíčka označena králičí anti-DHHC21 a kozí anti-lAR protilátkou (1:100) přes noc při 4 °C. Po promytí byla provedena sekundární inkubace protilátek s oslí anti-králičí Alexa Fluor 488 a oslí anti-kozí Alexa Fluor 568 (1:500). Po montáži pomocí montážního média ProLong Diamond s DAPI byla sklíčka zobrazena spektrálním inverzním laserovým skenovacím konfokálním mikroskopem Leica SP8.

Statistická analýza. Podrobné informace (např. název testu, post-hoc test, hodnota n, hladina alfa, hodnota p) pro každý statistický test jsou uvedeny v doplňkové tabulce S2. Všechna data splňují předpoklad normálního rozdělení. Test normality byl proveden pomocí Shapiro-Wilkova testu s hladinou alfa nastavenou na 0,05. Srovnání mezi dvěma skupinami byla analyzována pomocí Studentova t-testu (dvoustranný) a tři nebo více skupin byly porovnány pomocí jednocestné ANOVA s Tukey post-hoc analýzou. Porovnání křivek drátového myografu bylo provedeno pomocí Two-way ANOVA.p<0.05 was="" used="" for="" statistical="" significance.="" all="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" graphpad="" prism="" 7.0d="" (san="" diego,="" ca,="" usa).="" the="" actual="" values="" for="" all="" quantification="" results="" are="" listed="" in="" supplementary="" table="">