Část 1: Renovaskulární účinky anorganických nitrátů po ischemii-reperfuzi ledvin

Pro více informací Kontakttina.xiang@wecistanche.com

ABSTRAKTNÍ

Pozadí: Renální ischemicko-reperfuzní (IR) poškozeníje častou příčinouakutní poškození ledvin(AKI), která je spojena s oxidačním stresem a sníženou bioaktivitou oxidu dusnatého (NO) a zvýšeným rizikem vznikuchronické onemocnění ledvin(CKD) a kardiovaskulární onemocnění (CVD). Nové strategie, které obnovují redoxní rovnováhu, mohou mít terapeutické důsledky během AKI a souvisejících komplikací.

Cíl: Prozkoumat terapeutickou hodnotu posílení dráhy dusičnan-dusitan-NO během rozvoje renální a kardiovaskulární dysfunkce vyvolané IR.

Metody: Samcům myší C57BL/6 J byl podán dusičnan sodný (10 mg/kg, ip) nebo vehikulum 2 hodiny před teplou ischémií levé ledviny (45 minut) s následnou suplementací dusičnanu sodného v pitné vodě (1 mmol/kg/ den) po dobu následujících 2 týdnů. Byl měřen krevní tlak a rychlost glomerulární filtrace a byla odebrána krev a ledviny a použity pro biochemické a histologické analýzy, stejně jako pro studie reaktivity renálních cév. Glomerulární endoteliální buňky vystavené hypoxii-reoxygenaci, s nebo bez angiotensinu Ⅱ, byly použity pro mechanistické studie.

Výsledek: IR byla spojena se sníženou funkcí ledvin a mírně zvýšeným krevním tlakem v kombinaci s poškozením ledvin, zánětem, endoteliální dysfunkcí, zvýšenými hladinami AngⅡ a vazoreaktivitou zprostředkovanou Ang II, které byly všechny zlepšeny dusičnany. Kromě toho léčba dusičnany (in vivo) a dusitany (in vitro) obnovila biologickou aktivitu NO a snížila mitochondriální oxidační stres a poškození.

Závěry: Akutní léčba anorganickými nitráty před renální ischemií může sloužit jako nový terapeutický přístup k prevenci AKI a CKD a souvisejícího rizika rozvojekardiovaskulární dysfunkce.

Kliknutím se dostanete k dodavateli pro cistanche zkušenosti

1. Úvod

Ischemicko-reperfuzní (IR) poškození ledviny spojené s transplantací, operací srdečního bypassu a šokem je hlavním rizikem rozvoje akutního poškození ledvin (AKI) a následného chronického onemocnění ledvin (CKD) [1]. Základní mechanismy jsou složité a zahrnují oxidační stres spojený s reperfuzí, deficit oxidu dusnatého a aktivaci imunitních buněk, které společně vedou k endoteliální dysfunkci [2, 3]. Probíhající výzkum se zaměřuje na nalezení nových a účinných terapií pro prevenci a léčbu AKI a její progrese do CKD, jako je vzdálená ischemická preconditioning, dočasná lokální hypotermie a také nové farmakologické intervence [3,4].

Plynná signální molekula oxid dusnatý (NO) významně přispívá k regulaci kardiovaskulární a renální homeostázy a bylo prokázáno, že hraje protektivní roli při poranění IR [5,6]. Během ischemické příhody však nedostatek kyslíku ohrožuje funkci endoteliální NO syntázy (eNOS), což může přispívat k „fenoménu no-reflow“ v ischemické tkáni během reperfuzní fáze. To následně propaguje poranění endoteliálních a tubulárních epiteliálních buněk [7], které přispívají k rozvoji snížené funkce ledvin. Kromě hypoxie během ischemického období vychytává NO nadměrná produkce reaktivních forem kyslíku (ROS) generovaných v nadbytku nikotinamidadenindinukleotid fosfát (NADPH) oxidasou a mitochondriemi během reperfuzní fáze [8]. Nové přístupy, které snižují oxidační stres a udržují biologickou aktivitu NO, mohou mít terapeutickou hodnotu v boji proti IR-indukovanému selhání ledvin.

Anorganický dusičnan (NO3) a dusitan (NOZ) byly dříve považovány za relativně inertní produkty odvozené z metabolismu NO. Výzkum prováděný více než dvě desetiletí však ukázal, že tyto anionty mohou projít biokonverzí prostřednictvím sériových redukcí a znovu vytvořit NO a další bioaktivní druhy oxidů dusíku [9]. Aktivita této alternativní dráhy dusičnan-dusitan-NO je zvýšena za podmínek s hypoxií a nízkým pH, kdy se klasický systém NOS může stát dysfunkční [10].

Strava je vedle NOS systému důležitým zdrojem cirkulujících dusičnanů a dusitanů, a to díky vysokému obsahu dusičnanů například v zelené listové zelenině. Suplementace anorganickými nitráty a dusitany byla v experimentálních i klinických studiích spojována s příznivými kardiovaskulárními účinky, včetně snížení krevního tlaku [11]. Orgánové ochranné účinky byly také prokázány v experimentálních modelech IR poškození jater [12], mozku [13], plic [14] a srdce [12,15]. Potenciální terapeutická hodnota anorganických nitrátů a dusitanů při IR poškození ledvin však zůstává kontroverzní. Jak bylo nedávno přezkoumáno [5], proměnlivé výsledky v modelech IR využívajících dusitanovou terapii mohou být způsobeny rozdíly v použitém dávkování, způsobu podání, délce léčby a také v samotném experimentálním modelu [16,17]. Několik experimentálních studií prokázalo ochranné účinky suplementace dusičnanů ve stravě na modelech kardiorenálních onemocnění prostřednictvím mechanismů, které zahrnují tlumení oxidačního stresu a zlepšení bioaktivity NO a také modulacizánětlivé reakce[5]. K dnešnímu dni existují omezené znalosti o účincích terapie anorganickými nitráty na poškození ledvin IR. Již dříve jsme prokázali, že chronická dietní předléčba nitráty zmírnila následné poškození ledvin vyvolané IR [18]. Existuje však méně znalostí o potenciální hodnotě posílení dráhy dusičnan-dusitan-NO na začátku IR, aby se snížilo riziko rozvoje AKI a CKD. Pokud je ochranný, mohl by mít široké klinické využití u pacientů s rizikem rozvoje AKI, například u těch, kteří podstupují velký chirurgický zákrok.

V této studii jsme použili myší model poškození ledvin IR ke zkoumání potenciálních přínosů akutní léčby dusičnany bezprostředně před ischemickou příhodou. To bylo kombinováno s mechanistickými ex vivo studiemi nádob a experimenty in vitro na buněčných kulturách s ošetřením dusitany. Předpokládali jsme, že posílení dráhy dusičnan-dusitan-NO by podpořilo ochranu ledvin před poškozením IR prostřednictvím modulace oxidačního stresu a bioaktivity NO, stejně jako mitochondriální funkce.

2. Metody

2.1. Činidla

Pokud není uvedeno jinak, všechna činidla byla získána od Sigma-Aldrich, Švédsko.

2.2. Zvířata a model ischemie-reperfuze ledvin

Myši C57BL/6 J (samci, 10 týdnů) byly získány z laboratoří Janvier Lab-oratories (Francie) a umístěny v našich zvířecích zařízeních v Karolinska Institutet za klimaticky kontrolovaných podmínek s 12-hodinovým cyklem světlo/tma a poskytnuty se standardním krmivem pro hlodavce a vodou z vodovodu. Všechny postupy na zvířatech byly schváleny Regionální etickou komisí pro pokusy na zvířatech (ID protokolu: N139/15) a byly prováděny v souladu s pokyny Národního zdravotního ústavu (NIH) a se směrnicí EU 2010/63/EU pro provádění pokusy na zvířatech.

Po 1 týdnu aklimatizace bylo myším podáno placebo (NaCl) nebo dusičnan sodný (NaNO3) intraperitoneálně (10 mg/kg) 2 h před jednostrannou ischemií levé ledviny. Pravá ledvina byla vyšetřena, ale jinak zůstala intaktní. Falešné operace byly provedeny stejným způsobem, ale bez sevření levé ledviny. Myši byly anestetizovány isofluranem a tělesná teplota byla udržována na 37 ± 0,5 stupně za použití vyhřívací lampy a sebemonitorované vyhřívací podložky během operace. Po operaci byly myši léčeny buď dusičnanem sodným (1 mmol/kg/den) nebo placebem po dobu 2 týdnů až do ukončení.

2.3. Měření krevního tlaku

Krevní tlak byl měřen u myší pomocí neinvazivní metody manžety na ocasu před ukončením léčby. Myši byly kondicionovány na teplé desce při 35 °C po dobu 10 minut a poté umístěny do plastových omezovačů. Manžeta s pneumatickým snímačem tepu byla připojena k ocasu a hodnoty krevního tlaku byly zaznamenávány systémem CODA (Kent Scientific, Torrington, CT, USA). Zvířata byla trénována s omezovači na vyhřívací desce alespoň tři dny před záznamy krevního tlaku. Systolický, diastolický a střední arteriální tlak byly shromažďovány během 3 po sobě jdoucích dnů a pro hodnocení byly sestaveny jednotlivé mediány všech akceptovaných hodnot.

2.4.Sběr tkáně

Před ukončením byly myši umístěny do metabolických klecí pro sběr moči pro výpočet rychlosti glomerulární filtrace (GFR). Zvířata byla poté anestetizována isofluranem a vzorky krve byly odebírány přes dolní dutou žílu. Všechny vzorky byly okamžitě centrifugovány při 6000 x g, 4 °C po dobu 5 minut v přítomnosti EDTA (Sigma-Aldrich, Stockholm, Švédsko), konečná koncentrace 2 mM. Vzorky plazmy byly přeneseny do nových zkumavek a okamžitě rychle zmraženy v suchém ledu a nakonec uloženy při -80 stupni. Ledviny byly extrahovány a rozřezány na několik částí pro ex vivo experimenty s vaskulární funkcí (interlobární artérie a aferentní arterioly), histologie ( barvení HE a PAS) a kvantifikaci apoptózy a zánětu (zalití a zmrazení sloučeniny TUNEL a F4/80 s optimální teplotou řezání (OCT)).

2.5. Měření dusičnanů, dusitanů, cGMP, kreatininu, dusíku močoviny v krvi (BUN) a angiotenzinu II

Dusitany a dusičnany byly analyzovány pomocí HPLC (ENO-20), jak bylo popsáno dříve 【19】. Vzorky plazmy (10 ul bylo injikováno do systému HPLC pomocí Hamiltonovy stříkačky. Následně byly dusitany a dusičnany odděleny chromatografií na reverzní fázi/iontoměničové chromatografii s následnou redukcí dusičnanů na dusitany kadmiem a redukovanou mědí. Dusitan byl derivatizován pomocí Griessova činidla za vzniku diazosloučenin a detekován při 540 nm. Aby se zabránilo degradaci cGMP, byla plazma přenesena do zkumavek obsahujících inhibitor PDE, BMX(3-Isobutyl-1methylxanthin; Sigma-Aldrich #I5879）, aby se získala konečná koncentrace （10 μM）. poté zmrazit a uskladnit při -80 stupních před analýzou cGMP pomocí soupravy ELISA (GE Healthcare #RPN226) podle pokynů výrobce.

Hladiny kreatininu v plazmě a moči byly detekovány pomocí souprav kreatininových kolorimetrických testů (Cayman Chemical, #700460 a #500701). Vzorec clearance kreatininu (CLcr =Urinecrx Průtok moči/Plasmacr) byl použit k odhadu GFR. Plazmatické hladiny BUN byly detekovány pomocí BUN Colorimetric Detection Kit (Invitrogen,#EIA-BUN). Hladiny Ang v plazmě a tkáních ledvin byly měřeny pomocí soupravy AngⅡI ELISA (Cloud-Clone Corp., # CEA005Mu) podle pokynů výrobce. Příprava tkáňového extraktu se však mírně lišila od doporučení. Ke tkáni bylo přidáno 10 obj. 50 mM HCl v 50% EtOH a zahříváno 10 min při 100 stupních, centrifugováno 10 000×g 10 min. Poté byly vzorky zmraženy a uskladněny při-80 stupních před analýzou. Všechny hodnoty absorbance byly provedeny v SpextraMax iD3 od Molecular Devices.

2.6. Izolace a perfuze interlobárních tepen

Ledviny byly po usmrcení odebrány a uchovávány v ledově studeném fyziologickém solném roztoku (PSS) až do izolace interlobárních artérií. Renální interlobární arterie byly vypreparovány (2 mm na délku) a umístěny do a

myografická komora (Model 620 M, Danish Myo Technology, Dánsko) s PS, jak bylo popsáno dříve [20]. Izometrické napětí bylo zaznamenáváno systémem Powerlab (Powerlab 4/30, AD Instruments, Austrálie). Po montáži byly cévy ekvilibrovány po dobu 20 minut v PS probublávajícím karbogenem (95 procent O2; 5 procent CO2) při 37 stupních, pH 7,4. Poté bylo nastaveno klidové napětí tepen, jak je popsáno dříve [21], což je v souladu s Mulvanyho normalizačním postupem [22]. Po druhé ekvilibraci bylo aplikováno 0,1 mol/l KCl pro hodnocení životaschopnosti arteriálního prstence.

2.7. Izolace a mikroperfuze aferentních arteriol

Myši C57BL/6 J byly anestetizovány inhalovaným isofluranem a ledviny byly odstraněny a rychle nakrájeny, jak bylo popsáno dříve [23-25]. Řezy ledvin byly umístěny do ledově chladného Dulbeccova modifikovaného Eagleova média (DMEM). Jedna aferentní arteriola s připojeným glomerulem byla mikrodisekována pod stereomikroskopem a přenesena do

teplotně regulovaná komora na stolku inverzního mikroskopu. Glomerulus byl fixován přidržovací mikropipetou a aferentní arteriola byla kanylována a perfundována sadou mikropipet. Intraluminální tlak perfundované aferentní arteriole byl během experimentů udržován na 60 mmHg. Doba pro disekci a následující mikroperfuzi byla omezena na 120 minut po usmrcení myši, jak bylo popsáno dříve [26]. Po 30minutovém ekvilibračním období při 37 stupních byly získány křivky kumulativní dávka-odpověď na Ang II (10-12 až 10-8 mol/l). Každá koncentrace Ang II byla perfundována po dobu 2 minut, byla zaznamenána konstrikční odpověď a poté byl změřen průměr aferentní arteriole.

2.8. Histologické vyšetření

Vzorky ledvin byly odebrány a fixovány ve 4% roztoku paraformaldehydu. Fixované ledvinové tkáně byly zality v parafínu a poté nakrájeny a obarveny hematoxylinem-eosinem (H&E) nebo periodickou kyselinou Schiffovou (PAS) pro histologické hodnocení. Pro analýzu byla použita čtyři náhodně vybraná zvířata z každé experimentální skupiny. Deset náhodně vybraných polí z každé sekce bylo zachyceno při 400× zvětšení. Všechny morfometrické analýzy byly provedeny naslepo.

2.9. Barvení TUNEL

Vzorky ledvin zalité OCT byly použity pro barvení TUNEL. Řezy o tloušťce 6-μm byly inkubovány s 20 ug/ml proteinázy K po dobu 15 minut při teplotě místnosti a reakce TUNEL byly provedeny pomocí testu Click-iTTM Plus TUNEL Assay (Invitrogen C10618, USA) podle pokynů výrobce. Na konci protokolu bylo provedeno barvení DAPI. Pro kvantifikaci byla náhodně vybrána tři zvířata a tři oblasti snímku (200 ×) a vyfotografovány pomocí konfokálního mikroskopu Zeiss LSM800-Airy, pozitivní signály byly kvantifikovány pomocí softwaru ImageJ/Fiji a byly vypočteny jako poměr pozitivních signálů k DAPI.

2.10. Tkáňové imunofluorescenční barvení a konfokální mikroskopie (F4/80)

Ledviny byly zmrazeny v OCT (Tissue-Tek, Torrence, CA, USA) a řezy (6 μm) byly připraveny a dále zpracovány. Zmrazené řezy byly promyty 1× PBS a blokovány 2% BSA v PBS po dobu 30 minut a poté inkubovány s anti-F4/80 (1:50, BIO-RAD Cl: A3-1) přes noc při 4 stupních chladné místnosti a následně se sekundární protilátkou (1:200 Cell signaling Tech #4417) při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny s následným kontrastním barvením 300 nmol/L DAPI(4'6-diamidino-2-fenyl -indol, dihydrochlorid, Invitrogen) po dobu 3 min. Imunofluorescenční signály byly vizualizovány pod konfokálním mikroskopem Zeiss LSM800-Airy. náhodně byla vybrána tři zvířata a tři oblasti snímku (200×). Pozitivní signály F4/80 byly kvantifikovány pomocí softwaru ImageJ/Fiji a byly vypočteny jako poměr pozitivních signálů k DAPI.

2.11. Buněčná kultura

Potkaní glomerulární endoteliální buňky (GEC) (DSMZ ACC262, Německo) byly kultivovány v médiu RPMI1640 (Gibco 21870-076) s 10 procenty fetálního hovězího séra a 2 m ML-glutaminu (Gibco 25030-082), penicilinem a streptomy (50 mg/l, Gibco 15140-122). Buňky byly udržovány při 37 stupních ve zvlhčené atmosféře s 5 procenty CO2. V experimentech s hypoxií byly buňky inkubovány v HBSS (Gibco 14025-092) místo v médiu bez séra v komoře s 1 procentem kyslíku při 37 °C po dobu 2 hodin. Buňky byly preinkubovány s dusitanem (10 uM, s/bez inhibitoru xanthinoxidoreduktázy (XOR) febuxostatem (100 nM) po dobu 30 minut před hyp-oxií. Životaschopnost buněk byla hodnocena testem PrestoBlue⑧ (Invitrogen, A13261 a A13262) a buněčná mortalita byla hodnocena testem vylučování trypanové modři (Sigma, T8154-20 ML).

2.12. Detekce mitochondriálních ROS

Hladiny mitochondriálního superoxidu byly detekovány fluorogenním barvivem (MitoSOXTM, Invitrogen M36008). Po ošetření byly endoteliální buňky inkubovány s 2 μmol/l MitoSox v kultivačním médiu při 37 stupních po dobu 10 minut. Poté byly buňky dvakrát promyty 1x HBSS a byl měřen fluorescenční signál (SpectraMax iD3 reader, Molecular Devices, USA) a normalizován na životaschopnost buněk.

2.13. Imunoblotovací analýza

Zmrazené vzorky ledvin nebo endoteliální buňky byly lyžovány v pufru obsahujícím 10 mmol/l Tris-HCl pH 8, 150 mmol/l NaCl, 5 mmol/l EDTA, 60 mmol/l N-oktyl-glukosid, 1 procento Triton X{{9 }}, koktejl inhibitorů proteázy a inhibitory proteinové fosfatázy. Lyzáty buněk nebo tkání byly centrifugovány po dobu 5 minut při 10,000xg při 4 stupních. Supernatanty/proteiny byly přeneseny do nových zkumavek a kvantifikovány pomocí Bio-Rad

proteinový test. Proteinové extrakty obsahující ekvivalentní množství proteinů byly analyzovány pomocí {{0}} % dodecylsulfátu sodného-polyakrylamidové gelové elektroforézy (SDS-PAGE). Proteiny byly přeneseny na imobilonovou polyvinylidendifluoridovou membránu po dobu 1 hodiny při 300 mA. Membrány byly blokovány v 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl a 0,1 procenta Tween 20 (TBS-T) obsahujícím 5 procent bez tuku sušené mléko po dobu 1 hodiny a imunodetekováno protilátkami proti TFAM (1:2000, ab131607), anti-OXPHOS (1:1000, ab110413), anti-vinkulin (1:5000, ab129002) (Abcam Cambridge, UK) a anti -Cleaved caspase{30}} (1:1000,#9664)(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). Všechny sekundární protilátky pro imunoblotovou analýzu byly od Cell Signaling Technology. U Western blotů jsou v doplňkovém souboru zobrazeny neoříznuté, anotované snímky plné délky se značkami MW.

2.14. Statistická analýza

Vícenásobná srovnání mezi skupinami byla analyzována jedno- nebo dvoucestnou ANOVA následovanou doporučeným post-hoc testem. Data jsou uvedena jako průměr ± SEM. Všechny statistické výpočty byly provedeny pomocí Graphpad Prism 8.0. Statistická významnost byla definována jako p<>