Zobrazování renální mikrocirkulace v buněčné terapii

Kontakt:ali.ma@wecistanche.com

Kateřina Apelt et

Kmen Cistanche pro onemocnění ledvin, kliknutím sem získáte vzorek

Abstraktní:

Renálnímikrovaskulární vzácnost hraje klíčovou roli v progresiledvinachoroba. Modality pro vizualizaci mikrocirkulace ledviny tedy zvýší naše chápání mechanismů onemocnění a následně mohou poskytnout nové přístupy pro hodnocení buněčné terapie. V současné době však klinická praxe postrádá neinvazivní, bezpečné a účinné zobrazovací modality pro sledování renálních mikrovaskulárních změn v průběhu času u pacientů trpících onemocněním ledvin. Abychom zdůraznili důležitost, shrnujeme současné poznatky o renální mikrocirkulaci a diskutujeme podíl na progresivním onemocnění ledvin. Kromě toho je uveden přehled dostupných zobrazovacích technik k odhalení renální mikrovaskulární morfologie, funkce a chování se souvisejícími výhodami a omezeními. V konečném důsledku může nutnost hodnotit a vyšetřovat onemocnění ledvin na základě údajů in vivo s rozlišením až na úroveň kapiláry, což může poskytnout posun paradigmatu pro diagnostiku a terapii v oblastinefrologie.

klíčová slova: ledvina; mikrocirkulace; mikrovaskulárnívzácnost; buněčná terapie; zobrazování

1. Úvod

Renální vaskulatura má anatomicky komplexní architekturu, která odráží její jedinečnou fyziologickou funkci [1]. Navzdory vysoce dynamické adaptaci mikrovaskulární sítě na hemodynamické změny může být vaskulární dysfunkce důsledkem nebo dokonce příčinouledvinavývoj a progrese onemocnění [2,3]. V souladu s tím může mikrovaskulární dysfunkce sloužit jako časný znak fibrotického poškození ledvin, což naznačuje, že neinvazivní hodnocení a validace renální mikrovaskulární architektury a funkce by bylo velkým zlepšením pro hodnocení účinnosti terapií zaměřených na snížení renální fibrózy.

V klinické praxi závažnost chronicledvinaonemocnění (CKD) je klasifikováno na základě rychlosti glomerulární filtrace (GFR), která se odráží mírně (60–89 ml/min/1,73 m2), středně (30–59 ml/min/1,73 m2) nebo těžce (15–29 ml/ min/1,73 m2 ) pokleslaledvinafunkcena základě předem definovaných kategorií [4]. Progrese onemocnění do pokročilého CKD a konečného stádia renálního onemocnění (ESRD) je definována výskytem glomerulosklerózy a tubulointersticiální fibrózy s GFR nižší než 15 ml/min/1,73 m2. Několik studií ukázalo, že fenomén ztráty renálních kapilár, tj. renální mikrovaskulární vzácnost, úzce koreluje se závažností onemocnění ledvin a je zapojen do biologie následné progrese k CKD [3,5–7]. Vznik renální fibrózy byl zdůrazněn jako centrální charakteristika takové peritubulární kapilární ztráty a následné renální epiteliální ztráty. Pokud lze mikrovaskulaturu ledviny chránit nebo dokonce obnovit, zlepšila by se integrita renální strukturální tkáně a bylo by možné zabránit progresi onemocnění [2,8]. Kromě toho může být potenciálně definováno terapeutické okno pro posouzení závažnosti poranění předtím, než bude stupeň poškození ledvin nevratný. Zejména využití buněčných terapií, jako jsou slibné aplikace mezenchymálních stromálních buněk (MSC), lze posoudit a zdokonalit pro léčbu renálních vaskulárních onemocnění. Podrobné pochopení renální mikrovaskulární vzácnosti však stále brání absence zobrazovacích modalit, které umožňují neinvazivní monitorování architektury a funkčnosti cév s vysokým rozlišením.

V tomto přehledu shrnujeme současné poznatky o renální mikrovaskulatuře a patologických mechanismech, které mohou mikrocirkulaci ovlivnit. Diskutujeme o důležitosti pericytů a poskytujeme pohled na jejich ústřední roli při způsobování progrese renálního onemocnění prostřednictvím mikrovaskulární dysfunkce a vzácnosti, stejně jako vývojledvinafibróza. Následně popisujeme nový vývoj v zobrazovacích technikách, které by mohly monitorovat takové změny v renální mikrocirkulaci.

2. Renální vaskulatura

2.1. Renální krevní oběh

Mikrovaskulatura lidského těla se skládá z arteriol, kapilár a venul a zajišťuje výměnu kyslíku, živin a metabolitů mezi krví a okolní tkání [8,9]. Je zřejmé, že vitální funkce mikrocirkulace je přísně regulována na základě metabolických potřeb orgánu. Hlavní odpovědností arteriol je regulovat průtok krve úpravou odporu, aby se zajistila vitální výměna na úrovni kapilár [10]. V tomto ohledu je kontinuální adaptace na homeostatický požadavek základní tkáně hlavně závislá na dynamické plasticitě endoteliálních buněk. Endoteliální zdraví mikrocirkulace zároveň závisí na úzké mezibuněčné komunikaci s pericyty, které fyzicky stabilizují krevní cévy, regulují angiogenezi a kontrolují průtok krve [11,12].

Ledviny jsou vysoce vaskularizovaný orgán vykazující jedinečné morfologické a funkční charakteristiky, které odrážejí pozoruhodnou heterogenitu její vaskulární sítě [1,10]. Krev se do ledviny dostává renální tepnou přes hilum (obr. 1), který se dále dichotomicky dělí v ledvinné pánvičce na segmentální tepny a větví se progresivně na úrovni malého kalichu na interlobární tepny, které se šíří mezi renálními pyramidami [1,13] ]. Na hranici mezi kortexem a dření ústí interlobární tepny do obloukových tepen a tvoří anatomickou separaci mezi oběma renálními kompartmenty [1]. V kůře interlobulární tepny, také známé jako kortikální paprsčité tepny nebo kortikální penetrující arterioly, vycházejí kolmo z obloukovitých tepen a rozbíhají se do aferentních tepen, aby zásobovaly různé větve glomerulárního stromu. V závislosti na umístění glomerulů se filtrovaná krev shromažďuje v kortikálním kapilárním plexu obklopujícím proximální a distální tubuly nebo v dřeňovém kapilárním plexu na úrovni Henleovy kličky. Nakonec krev odtéká do žilního systému, který probíhá paralelně s arteriální sítí vystupující z ledviny přes interlobulární, obloukovitou, interlobární, segmentální a případně renální žílu přímo nad močovodem. Obecně lze říci, že tento základní vaskulární vzorec je u savců zachován [14,15].

2.2. Kapilární sítě ledvin

Složitost architektury renální mikrovaskulatury se odráží v různorodé morfologii různých renálních krevních cév (obrázek 2). Strukturní a funkční heterogenita endotelu ledvin a jejich okolních perivaskulárních buněk jde těsně ruku v ruce s typem kapilární sítě [15–17]. Přítomnost různých kapilárních lůžek je ve skutečnosti pozoruhodným rysem zajišťujícím filtraci přes glomerulární kapilární síť, stejně jako sekreci a reabsorpci přes peritubulární kapilární síť a medulární kapilární síť [1,13,14]. Kortikální mikrocirkulace zajišťuje především reabsorpci glomerulárního filtrátu, zatímco vylučování soli a vody je regulováno převážně medulárním mikrovaskulárním kompartmentem [14]. Je zajímavé, že i když dřeň tvoří přibližně 30 procent celkové hmoty ledvinové tkáně, pouze 10 procent celkového průtoku krve ledvinami (RBF) zahrnuje tuto část [10]. Na základě anatomické polohy lze renální mikrocirkulaci rozdělit na (i) kortikální mikrocirkulaci; a (ii) medulární mikrocirkulace [13,14].

Kortikální mikrocirkulace je fyzicky oddělena obloukovitými tepnami, které dávají vzniknout interlobulárním tepnám, které se dále větví z obou stran do několika aferentních arteriol, které zásobují glomerulární kapilární síť [14]. K větvení dochází pod různým úhlem v závislosti na umístění glomerulů v kortexu. Přes aferentní arteriolu je glomerulární kapilární síť sestávající z 6–8 kapilárních kliček zásobována krví, která po filtraci vystupuje eferentní arteriolou [10]. Glomerulární kapiláry (obrázek 2a) jsou tvořeny tenkým, souvislým a většinou plochým fenestrovaným endotelem, který je pokrytý podocyty. Fenestrované oblasti mohou zabírat až 20–50 procent jejich celého buněčného povrchu [16]. Kortikální glomeruly tvoří 90 procent všech glomerulů přítomných v ledvině, a proto není překvapivé, že většina RBF převážně protéká [13]. Zbývajících 10 procent všech glomerulů se nachází na kortikomedulární hranici a jsou větší. Kromě rozdílů ve velikosti glomerulů lze strukturální rozdíly aferentních a eferentních arteriol zásobujících kortikální a juxtamedulární glomeruly vysvětlit významem pro zachování kapilárního tlaku.

Aby byla zajištěna správná filtrace krve, je rozdíl v průměru mezi kortikálními aferentními (obrázek 2b) a kortikálními eferentními (obrázek 2c) arteriolami 15 µm oproti 10 µm [13]. Krevní tlak je regulován na straně aferentních arteriol prostřednictvím změn odporu vysvětlujících kontinuální endotel, který je obalen buňkami hladkého svalstva (SMC) [18]. Bližší prohlídka aferentní arterioly odhalí přítomnost dvou vaskulárních segmentů spíše než jednotného endotelu po celé délce cévy, jak se běžně setkáváme. Proximální část aferentní arterioly je složena z nepropustného endotelu s těsně uspořádanými SMC, které jsou nutné pro kontrakci cévy. Na rozdíl od distální části, která je těsně u glomerulu a je tvořena propustným endotelem díky přítomnosti fenestrace. Je zajímavé, že tato fenestrace je u cév s vysokým intravaskulárním tlakem spíše neobvyklým jevem. Kromě toho pericyty produkující renin ve tvaru krychle obalují distální část aferentní arterioly, aby zprostředkovávaly regulaci lokálního krevního tlaku v glomerulu [17,19].

Filtrovaná krev vystupuje z každého z kortikálních glomerulů přes eferentní arteriolu a spojuje se v hustém kortikálním kapilárním plexu obklopujícím renální tubuly [10]. Kromě glomerulárního kapilárního systému je tento druhý kapilární kompartment známý jako peritubulární kapilární systém [16]. Peritubulární kapiláry (obrázek 2d) jsou fenestrované a tenkostěnné s průměrným průměrem přibližně 7 µm [13,15]. Tyto kapiláry poskytují kyslík a živiny tubulům umístěným v ledvinové kůře, ale ne nutně tomu, ze kterého pocházejí [10,15]. Peritubulární kapiláry vykazují kontinuálnější endotel a také menší průměr ve srovnání s medulárními kapilárami vasa recta [13,16]. U renálního onemocnění glomerulární poškození nakonec ovlivní downstream sekvenčně uspořádané peritubulární kapiláry, a tím urychlí progresi renálního onemocnění [10,20].

Juxtamedulární aferentní arteriola (obrázek 2e) má přibližný průměr 20 µm, zatímco juxtamedulární eferentní arteriola (obrázek 2f) má silnější vnitřní průměr 20–25 µm [13]. Eferentní arteriola vystupující z juxtamedulárního glomerulu je silně obklopena několika SMC. Tento znatelný rozdíl v průměru cév, stejně jako zvýšená muskularizace, vyvolává debatu o zapojení tohoto typu glomerulu do ischemie. Zdá se, že renální vaskulární architektura je organizována určitým způsobem, aby chránila dřeň před ischemickým poškozením. Existuje hypotéza, že aferentní a eferentní arterioly juxtamedulárních glomerulů nemusí být zodpovědné za regulaci medullary blood fellow (MBF), ale to by také bylo v potenciálním rozporu s jejich úlohou řídit rychlost glomerulární filtrace [21]. Místo toho se zdá, že sestupná vasa recta (DVR) cévních svazků umístěných ve vnitřním pruhu vnější dřeně je zodpovědná za řízení MBF, což může vysvětlit vysoký počet pericytů obalujících tento kompartment cévy. DVR proto hraje klíčovou roli v dlouhodobé regulaci arteriálního tlaku [13]. Eferentní arterioly napojené na juxtamedulární glomeruly protékají cévními svazky, které jsou situovány ve vnitřním pruhu zevní dřeně, přecházejí do DVR. DVR vede ke vzniku medulární kapilární sítě, která je připojena k ascendentní vasa recta (AVR) [1].

Dřeňová mikrocirkulace začíná, když eferentní arterioly pocházející z juxtamedulárních glomerulů vstupují hlouběji do tkáně, aby zásobily zbývajících 30 procent renální tkáně známé jako medulla [13,14]. Dřeň jedné ledvinové pyramidy je anatomicky rozdělena na dvě části: zevní dřeň umístěná přímo pod kůrou, za ní následuje vnitřní dřeň, která se šíří až k vrcholu parenchymu, zvanému papila. Obecně se počet dřeňových kapilár zvyšuje od špičky renální pyramidy. Bližší pozorování ukazuje, že zevní dřeň lze dále rozdělit na vnější pruh a vysoce vaskularizovaný vnitřní pruh obsahující hustý kapilární plexus a plexus inter bundle [15]. Mezisvazkové kapiláry jsou charakterizovány fenestrovaným endotelem a jsou spojeny s obloukovou žílou [14,22].

Každá juxtamedulární eferentní arteriola se rozděluje do několika svazků, známých jako vaskulární svazky, za vzniku větví DVR (obrázek 2g), které mají větší průměr ve srovnání s peritubulárními kapilárami kortexu [15,23]. Několik pericytů je připojeno k endotelu DVR cévních svazků [17]. Je zajímavé, že počet pericytů obalujících cévy klesá v DVR (obrázek 2h) vnitřní dřeně [15,17]. Toto morfologické uspořádání DVR ve vnějším a vnitřním kompartmentu dřeně odráží jeho dvojí funkci [10]. Abychom uvedli, vazokonstrikce DVR se většinou objevuje v proximální části, která se nachází ve zevní dřeni [15]. V distální části, tedy vnitřní dřeni, však probíhá především výměna elektrolytů. Tento anatomický rozdíl přímo implikuje odlišnou subpopulaci pericytů z hlediska morfologického vzhledu a funkčních vlastností [15,17].

Hluboko ve vnitřní dřeni se různé větve DVR před připojením k výrazně menšímu AVR rozdělily do komplexní kapilární sítě [10]. Endotel DVR je spojitý, na rozdíl od endotelových buněk AVR (obrázek 2i), které jsou vysoce fenestrované. Nakonec je všechna krev odebrána z AVR, stejně jako peritubulární kapiláry kortikálního kapilárního plexu do žilního systému. Renální žíly obecně vykazují extrémně tenkou cévní stěnu a interlobulární, obloukovité a interlobární žíly jsou fenestrované a obsahují bránice. Překvapivě interlobulární žíly vykazují obecně větší podobnost s peritubulárními kapilárami než s žilami díky tenkému a vysoce fenestrovanému epitelu.

Různé renální mikrovaskulární segmenty a jejich elegantní morfologický vzhled na buněčné úrovni vzbuzují podezření, že stávající složitost je převedena do ještě komplikovanějšího mechanismu onemocnění. Proto se následující část zaměřuje na základní procesy, které se podílejí na renálních mikrovaskulárních poruchách.

3. Renální mikrovaskulární poruchy

3.1. Endoteliální dysfunkce

Renální endotel je za fyziologických podmínek většinou v klidu; v reakci na změny mikroprostředí, tj. smykový stres, hypoxii, oxidační stres nebo zánět, však dochází k aktivaci endoteliálních buněk a produkci angiogenních růstových faktorů [24]. V závislosti na spouštěči může aktivace endoteliálních buněk vyvolat prozánětlivý a protrombotický fenotyp k podpoře adheze imunitních buněk a infiltrace pro tvorbu mikrotrombů. Aby však byla zachována vaskulární bariéra pro vhodnou rozsáhlou regulační funkci a propustnost pro transport rozpuštěné látky, je nezbytné přísně regulovat metabolický stav klidových i aktivovaných endoteliálních buněk.

Integrita tkáně a funkce orgánů jsou závislé především na vhodné perfuzi mikrovaskulární sítě [8]. Proto není překvapivé, že endoteliální buňky vykazují vysokou plasticitu, aby zajistily dynamickou adaptaci na změny prostředí úpravou počtu kapilár, morfologického tvaru a funkce [1,2,8]. Delší období zvýšeného krevního tlaku však způsobuje nevratné změny v mikrocirkulaci, což vede ke vzniku poškozených endoteliálních buněk vyznačujících se zhoršenými adaptačními vlastnostmi. Tato narušená homeostáza se projevuje snížením oxidu dusnatého (NO), hypoxií indukovatelného faktoru-1 (HIF{6}}) a vaskulárního endoteliálního růstového faktoru (VEGF) spolu se zvýšením dalších faktorů, jako je např. jako angiostatin, endostatin a trombospondin [1]. Pozoruhodné je, že náchylnost k endoteliální dysfunkci v ledvinách je různorodá a závisí na typu endoteliálních buněk umístěných v různých kompartmentech renální mikrocirkulace [16,24]. K objasnění heterogenních fenotypů renálních endoteliálních buněk a jejich rozdílné odpovědi na mikrovaskulární změny Dumas et al. [25] nedávno poskytli atlas endotelu ledvin s vysokým rozlišením pomocí jednobuněčného sekvenování RNA.

Endoteliální dysfunkce se často vyskytuje současně s akutním a progresivním poklesem funkce ledvin [24]. Tato porucha způsobuje zvýšenou vaskulární rezistenci, která je doprovázena snížením RBF [26]. Delší období vazokonstrikce způsobuje nedostatečnou perfuzi tkání a aktivaci stresových a růstových faktorů vedoucích k morfologickým změnám [1]. V závislosti na závažnosti a zejména délce trvání jakéhokoli daného poškození může být RBF nevratně změněna zavedením strukturálních změn v mikrocirkulaci. Tyto morfologické změny jsou způsobeny procesem známým jako mikrovaskulární remodelace. Mikrovaskulární remodelace je definována jako odpověď na funkční změny mikrovaskulatury, které následně mohou způsobit změnu mikrovaskulární architektury na strukturální úrovni v posledním pokusu o dosažení hemodynamické homeostázy [1,2,8]. A konečně, endoteliální dysfunkce může vést k fenoménu zvanému „no-reflow“, při kterém nelze obnovit perfuzi, což případně vede k poškození tubulárních epiteliálních buněk, které má za následek akutní poškození ledvin (AKI) [24].

Je velmi důležité zdůraznit, že endoteliální dysfunkce není spojena pouze s onemocněním ledvin, ale také aktivně řídí progresi onemocnění [24]. Renální mikrovaskulární porucha se projevuje endoteliální dysfunkcí vyvolanou poškozením buněk, které narušuje těsnou interakci pericytů s endoteliální vrstvou a brání buněčné komunikaci.

3.2. Postižení pericytů při selhání ledvin

Ústředním rysem CKD je progresivní ztráta peritubulární kapilární sítě, což je proces, který se označuje jako vzácnost [27]. Tubulointersticiální fibróze, stejně jako poškozenému tubulárnímu epitelu, předchází tato kapilární redukce v ledvině [27], zatímco tato mikrovaskulární redukce přímo koreluje se závažností fibrózy [28,29]. Navíc bylo zjištěno, že rozsah vzácnosti předpovídá stupeň intersticiálního poškození i změny v rychlosti glomerulární filtrace u pacientů s CKD [28]. Tyto nálezy naznačují časnou, rychlost limitující roli mikrovaskulární destabilizace/ztráty při rozvoji CKD a patogenezi fibrózy [30]. Chronická aktivace endoteliálních buněk kardiovaskulárními rizikovými faktory může způsobit ztrátu pericytů, které hrají klíčovou roli ve stabilizaci a proliferaci kapilár prostřednictvím interakcí s endoteliálními buňkami [31]. Hromadné důkazy skutečně poukazují na důležitost pericytů a jejich zapojení do renálního mikrovaskulárního zdraví [17].

Pericyty jsou perivaskulární nástěnné buňky s prodlouženými výběžky pokrývajícími endotel, které jsou uloženy v bazální membráně kapilár [32]. Jsou to buňky mezenchymálního původu a pocházejí z Forkhead box D1 (FoxD1) plus stromální progenitorové populace, které také dávají vzniknout dalším nástěnným buňkám ledvinové vaskulatury včetně SMC, rezidentních fibroblastů, reninových buněk a mezangiálních buněk [33], zatímco všechny endoteliální buňky vaskulatury ledvin pocházejí z kmenových buněk leukémie (SCL) plus progenitory [34]. Pericyty se liší od rezidentních (perivaskulárních) fibroblastů, protože jsou zabudovány do vaskulární bazální membrány, ale většina studií na ledvinách nerozlišuje mezi pericyty a perivaskulárními fibroblasty [31,35], pravděpodobně kvůli nedostatku specifických markerů. Markery, které se běžně používají k identifikaci pericytů, zahrnují destičkový receptor růstového faktoru- (PDGFR), chondroitin sulfát proteoglykan NG2, -aktin hladkého svalstva (SMA), shluk diferenciace 73 (CD73) a PDGFR, ale tyto markery identifikují různé ( překrývající se) podskupiny pericytů lokalizovaných v různých anatomických oblastech, což odráží heterogenitu této buněčné populace [17] a pravděpodobně také funkční heterogenitu. Pericyty pevně regulují vaskulární vývoj, stabilizaci, zrání a remodelaci [11] a kontrolují průtok krve vazokonstrikcí. Pericyty jsou funkčně regulovány vazokonstrikčními faktory, jako je angiotensin II a adenosintrifosfát (ATP), a také vazodilatačními faktory, jako jsou NO a prostaglandiny [17]. Zrání krevních cév závisí na náboru perivaskulárních buněk ke stabilizaci vaskulatury a kontrole krevního tlaku [12].

V ledvině pericyty obalují distální části aferentních arteriol kortikálních glomerulů a jsou přítomny především v peritubulárních kapilárách a ve vasa recta [13,19]. Kromě toho jsou mezangiální buňky (specializovanou) podskupinou ledvinových pericytů, které jsou důležité pro udržení strukturální podpory glomerulárních kapilár a regulaci glomerulární hemodynamiky. Kromě toho kontraktilní juxtaglomerulární pericyty umístěné na arteriolách zprostředkovávají lokální glomerulární krevní tlak a ovlivňují systémový krevní tlak prostřednictvím sekrece reninu [19]. Je zajímavé, že prekurzorové buňky reninu, které pocházejí ze stromálního kompartmentu, jsou časoprostorově spojeny s vývojem krevních cév, zatímco se ukázalo, že tvorbě arteriálních větví předcházel výskyt buněk exprimujících renin v místě větvení [33,36]. Kromě toho se pomocí transgenních reninových reportérových zebřiček ukázalo, že buňky exprimující renin předcházejí angiogenním výhonkům [37]. V ledvinách dospělých myší jsou buňky reninového původu také pozorovány v perivaskulárních lokalitách a barví se společně s pericytovými markery (PDGFR /NG2) [38], což naznačuje možnou důležitou roli této podskupiny při udržování cév.

3.3. Interakce signalizace endoteliálních buněk a pericytů

Pericyty interagují s endoteliálními buňkami prostřednictvím mnoha recipročních interakcí, které regulují signální dráhy potřebné pro stabilizaci a angiogenní pučení. Signál pericytu do endotelu prostřednictvím secernovaných faktorů, jako je VEGF, PDGF, transformující růstový faktor- (TGF-) a angiopoetin-1 (Ang{4}}), jakož i přímým přeslechem endotelu a pericytu [39 ]. Podobně endotel signalizuje okolním stromálním buňkám pomocí faktorů, jako je angiopoetin-2 (Ang{8}}) ​​a PDGF. Ang-2 negativně interferuje s Ang{10}}zprostředkovanou Tie{11}} signalizací, což vede k narušení interakce pericyt–endoteliální buňka a následné destabilizaci cév a abnormální mikrovaskulární remodelaci [40,41]. Kritický význam interakce mezi perivaskulárními stromálními buňkami a endoteliálními buňkami při udržování kapilární sítě dokládají také studie na myších, které prokazují, že když je bráněno investování pericytů, kapilární síť je destabilizována a dochází k vzácnosti [42]. Například hyperglykémie zvyšuje endoteliální expresi Ang{15}}, což způsobuje migraci perivaskulárních stromálních buněk pryč z kapilár [43]. Nedávné studie z naší laboratoře prokázaly, že jak u potkanů ​​[44], tak u lidských dárcovských ledvin [45] vede ischemicko-reperfuzní poškození k rychlému zvýšení rovnováhy Ang{20}}/Ang-1, s čímž souvisí se ztrátou mikrovaskulární integrity. U pacientů s diabetem byl navíc pozorován obrat kapilárního zdraví a pokles poměru Ang{22}}/Ang-1 a solubilního trombomodulinu (marker poškození endoteliálních buněk) během 12 měsíců po současné transplantaci ledvin a pankreatu [46 ]. Vedle cest angiopoetin/Tie2 [47] je přeslech mezi endotelem a pericytem regulován signalizací superrodiny TGF [48], VEGF [49] a signálními cestami sfingosin-1-}fosfátu (S1P) [50].

3.4. Pericyty jako prekurzor myofifibroblastů

Myší modely genetického sledování linie prokázaly, že pericyty (a další perivaskulární buňky) jsou hlavním zdrojem -SMA pozitivních myofifibroblastů u myších modelů renální fibrózy [51,52]. Ve skutečnosti nedávná elegantní studie zahrnující sekvenování jednobuněčné RNA přesně určila tři hlavní zdroje myofibroblastů v lidských ledvinách: (i) NOTCH3 plus RGS5 plus PDGFR – pericyty; (ii) MEG3 plus PDGFR plus fibroblasty; a (iii) COLEC11 plus CXCL12 plus fibroblasty [53]. Během diferenciace pericytu na myofibroblast byly pozorovány změny buněčného cyklu, které jsou v souladu s diferenciací a expanzí, a obohacené dráhy zahrnovaly kanonickou signalizaci WNT a aktivátorový protein-1 (AP-1) a také aktivační transkripci faktor 2 (ATF2), PDGFR, integrin, interakce s receptorem extracelulární matrice (ECM) a signální dráhy TGF [53]. Již dříve bylo prokázáno, že malá část populace buněk PDGFR plus se skládá z perivaskulárních Gli1 plus progenitorů, které označují perivaskulární buněčnou populaci podobnou MSC, u níž bylo prokázáno, že je také klíčovým přispěvatelem k fibróze orgánů vyvolané poraněním prostřednictvím generování myofifibroblastů [54]. . Kromě toho bylo prokázáno, že homolog 1 onkogenu asociovaného s gliomem (Gli1) plus ztráta pericytů indukují vzácnost kapilár a poškození proximálních tubulů [55]. Je třeba poznamenat, že vzhledem k tomu, že pericyty byly dříve spojeny a úzce souvisí s MSC [56], vyvolává to také otázku, zda by podskupina pericytů mohla být MSC a jako taková přispívat k regeneraci ledvin. Ve skutečnosti mnoho studií zjistilo multipotentní progenitorovou roli pericytů v různých tkáních [35,57,58].

Celkově vzato, mikrovaskulární vzácnost přímo přispívá k zásobě myofibroblastů, které jsou zodpovědné za nadměrnou tvorbu ECM proteinů, které jsou hlavní složkou jizevnaté tkáně při fibróze. Přechod pericytu na myofibroblast navíc způsobuje oddělení pericytů od cévní stěny, což má za následek nestabilní kapiláry, které by samy o sobě způsobovaly vzácnost [52]. Nicméně hlavní dopad vzácnosti na patogenezi chronického selhání ledvin je způsoben ztrátou renální perfuze, která dále zhoršuje medulární ischemii a řídí rozvoj intersticiální fibrózy, která je zprostředkována zvýšenou expresí TGF- a růstového faktoru pojivové tkáně. (CTGF) [59]. Mikrovaskulární vzácnost tedy může dobře fungovat jako rychlost omezující profibrotický přepínač v patogenezi chronického selhání ledvin. Terapie zaměřené na interakci endoteliálních buněk a pericytů, např. zaměřené na signalizaci receptorů PDGFR nebo VEGF, by skutečně mohly zabránit přechodu myofibroblastů a omezit rozvoj fibrózy [60–62], což ilustruje klíčovou roli kapilární sítě při poškození ledvin a jako potenciálním terapeutickým cílem.

Na základě výše uvedeného je zřejmé, že složitá vaskulární architektura ledviny vytváří více perivaskulárních kompartmentů, z nichž každý má své vlastní specifické funkce a požadavky. Proto je nutný budoucí výzkum zaměřený na hloubkovou klasifikaci renálních pericytů charakterizací subpopulací na základě jejich umístění, buněčné morfologie a funkce. Nové zobrazovací metody, jejichž cílem je neinvazivně získat přístup k malým krevním cévám, by jako takové mohly poskytnout tyto základní informace. Jak dokládá oblast neurobiologie [12], dobře definovaná kategorizace různých podtypů pericytů by mohla poskytnout nové cesty pro vývoj cílené terapie vaskulární poruchy.

4. Cévní zobrazovací modality

Různá onemocnění ledvin odrážejí charakteristický vzor ultrastrukturálních změn. V důsledku technologického pokroku v oblasti biomedicínského zobrazování byly v posledních několika desetiletích odhaleny renální fyziologické a patofyziologické mechanismy [63]. Zaměřením na anatomické a morfologické změny tkáňové architektury se naše znalosti o onemocnění ledvin postupně rozšiřovaly, což zlepšilo diagnostiku a poskytlo inovativní možnosti léčby. Dynamické změny krevních cév však byly ignorovány hlavně kvůli výzvě zkoumat vaskulární chování v experimentech s časovými řadami. V důsledku toho existuje nenaplněná medicínská potřeba vyvinout neinvazivní zobrazovací techniky k monitorování hemodynamiky renální mikrocirkulace [16].

Bylo by také zajímavé spojit výsledky zobrazení s (novými) biomarkery v oblasti vaskulární nefrologie. Prokázali jsme například, že nekódující RNA jsou těsně spojeny s vaskulárním poškozením [64,65]. Kombinace těchto měření může přinést nové (kauzální) vztahy a nové možnosti diagnostiky. Navíc, když jsou nové zobrazovací modality spojeny s nedávným vývojem technik založených na jednotlivých buňkách, jako je sekvenování jednobuněčné RNA a prostorová transkriptomika [53,66,67], mohlo by to umožnit bezprecedentní hloubkovou analýzu složení a dynamiky. ledvinové vaskulatury. Následující části shrnují již dostupné ex vivo a in vivo zobrazovací modality pro zkoumání morfologických a funkčních aspektů renální mikrovaskulatury.

4.1. Ex vivo

Mnoho našich znalostí o renální mikrovaskulatuře je odvozeno z komplexní ex vivo analýzy tkáňových biopsií. V souladu s tím je terapie založená na buňkách často hodnocena řezáním tkání a barvením. I když existuje mnoho studií zkoumajících terapeutický účinek MSC na renální vaskulaturu [68], jen málo výzkumných skupin využilo sofistikovaných zobrazovacích metod, jako je mikropočítačová tomografie (mikro-CT), k posouzení terapie MSC zkoumáním 3D architektury. renální vaskulatury [69–74].

4.1.1. Mikropočítačová tomografie (Micro-CT)

Zavedení mikropočítačové tomografie (mikro-CT) Flannery et al. [75] v roce 1987 otevřel nové cesty pro studium neporušené vaskulatury hlodavců s cílem získat znalosti o mechanismech onemocnění s vysokým prostorovým rozlišením. Tato ex vivo modalita umožnila vizualizaci renální mikrovaskulární architektury a kvantifikaci glomerulárního počtu, prostorové distribuce a objemu, které lze použít jako indikátor patofyziologického stavu celého orgánu [76]. Rozlišení v jednom 3D zorném poli s 10 243 voxely umožnilo vizualizaci aferentních a eferentních arteriol, stejně jako glomerulárních kapilár ledvin hlodavců. U potkanů ​​byl použit rekonstituovaný voxel o velikosti 21 µm [77] au prasat byla studována renální vaskulatura s velikostí voxelu 40 µm a skenovacím polem 1,2 mm [78]. Pokroky v oblasti mikro-CT poskytly příležitost zobrazit krevní cévy nefronů krysy s rozlišením voxelu 1 µm v zorném poli skenování 2 mm [79].

Na základě kvantifikační techniky vyvinuté Hillmanem et al. [80] pomocí konvenčního CT byly stanoveny architektura cév a vaskulární objem v různých kompartmentech renální tkáně v souladu s podobnými studiemi, které hodnotily renální cévy na základě histologických řezů tkání [77]. Je zajímavé, že aplikací zobrazovacích modalit, jako je mikro-CT, se kromě konvenčního způsobu uvažování o úloze glomerulární kapilární sítě zvýšil význam zkoumání peritubulárních kapilár a jejich zapojení do patologických stavů.

Časné strukturální změny mikrovaskulatury lze vizualizovat a detekovat pomocí mikro-CT, a proto není překvapivé, že pomocí mikro-CT bylo identifikováno několik molekulárních mechanismů na vaskulární úrovni, které se podílejí na onemocnění ledvin. U různých modelů onemocnění ledvin, jako je polycystické onemocnění ledvin (PKD), byla popsána korelace mezi patologií a sníženou mikrovaskulaturou, jak bylo stanoveno pomocí mikro-CT s rozlišením velikosti voxelu 17 µm [81]. Navíc byla u hypercholesterolémie pozorována zvýšená kortikální mikrovaskulární denzita jako časná známka progresivního morfologického poškození ledvin [78]. U potkanů ​​s chronickým podvázáním žlučovodu byla pomocí mikro-CT detekována kortikální hypoperfuze, což může vysvětlit poruchu retence solí a vody s další progresí onemocnění [82]. Kromě toho u stenotických ledvin byl zvýšený oxidační stres spojen s renální mikrovaskulární remodelací a možnosti léčby byly navrženy prostřednictvím chronické antioxidační intervence [83].

Velkou výhodou mikro-CT je, že lze definovat axiální i radiální geometrii cévních systémů [84]. Kromě vizualizace renální vaskulární architektury ve 3D lze ocenit prostorovou hustotu mikrocév [78,83], hustotu a velikost cév lze určit s průměrem až 80 µm v různých anatomických renálních kompartmentech [77,78,83,85 ] a lze pozorovat tortuozitu cév [83]. Kromě toho lze v kortexu rozlišit a kvantifikovat vaskulární kapilární objem glomerulů a také peritubulární kapiláry [82].

Standardizovaný kvantifikační protokol byl široce používán ke zkoumání mikrovaskulárních změn v dobře definovaných kortikálních a medulárních kompartmentech na strukturální úrovni za účelem stanovení vaskulární denzity a průměru [77,82]. Ngo a kol. [84] provedli srovnávací studii mikro-CT a světelné mikroskopie a došli k závěru, že kvantifikace geometrie renální vaskulatury získaná pomocí mikro-CT je proveditelnou a přesnou technikou. Jedinou přidanou hodnotou zobrazení světelným mikroskopem ve srovnání s mikro-CT je to, že umožňuje rozlišení mezi tepnami a žilami prostřednictvím možnosti zobrazení cévní stěny. Použitím mikro-CT však mohly být tepny o průměru 100 a 60 um u krys a králíků vizualizovány ve 3D. Malé krevní cévy menší než 10 µm však nemohou být správně identifikovány pomocí mikro-CT, což nabádá k nutnosti vrátit se zpět k imunohistochemii, aby bylo možné zachytit i ty nejmenší renální kapiláry [85].

4.1.2. Světelná plošná fluorescenční mikroskopie (LSFM)

Se zavedením fluorescenční mikroskopie se světelným listem (LSFM) lze v dnešní době dosáhnout zobrazení velkých objemů s vysokým rozlišením za rozumnou dobu [86,87]. Díky dostupnosti LSFM se zájem přesunul od rutinně používaných konvenčních histologických technik, které zahrnují řezání tkáně s následným barvením mikrovaskulatury, k zobrazení tkáně jako celku. Volumetrická analýza je příznivá, protože je vyšetřena nejen vybraná část tkáně, ale ve 3D zobrazení je zachován dynamický charakter architektury a chování cévy.

Aby byla zachována 3D informace, je biologický vzorek transparentní pomocí různých protokolů optického čištění tkáně (OTC), aby se minimalizoval rozptyl světla a absorpce světla pro další fluorescenční barvení FL [87]. V posledních letech získaly OTC metody popularitu, protože 3D zobrazování poskytuje příležitost studovat intaktní orgány díky moderním pokrokům LSFM. Stavbu neporušeného orgánu nebo dokonce celého zvířete s rozlišením na buněčné úrovni ve 3D lze získat během několika minut [88]. S rozlišením srovnatelným s konfokální FL fluorescenční mikroskopií má však LSFM o dva řády lepší poměr signálu k šumu, dramaticky snižuje bělení FL fluoroforem a fototoxicitu, což umožňuje zpracování obrazu ve velkém měřítku potřebné pro OTC [89]. Další výhody spočívají v tom, že zaznamenaný počet snímků a rychlost záznamu jsou vyšší, zatímco celková doba zobrazování je mnohem kratší.

Od zavedení LSFM bylo vylepšeno a zdokonaleno několik OTC protokolů pro různé tkáňové vzorky a orgány pocházející z několika druhů. V posledních letech se k čištění myších ledvin široce používá netoxické čištění na bázi rozpouštědla ethylcinnamátem (ECi) [88,90,91]. Tento protokol je méně časově náročný, jako jsou například průkopnické protokoly CLARITY (čiré lipidové hybridizované rigidní zobrazování s akrylamidem), CUBIC (čisté, nerušené koktejly pro zobrazování mozku/těla a výpočetní analýza) a/nebo DISCO (trojrozměrné zobrazování orgány vyčištěné rozpouštědlem), přesto nabízí relativně rozumné pročištění ledviny s malým množstvím zbývající autofluorescence. Pozoruhodnou práci odvedli Ertürk a kolegové [92], kteří úspěšně vyčistili celou lidskou ledvinu novým přístupem permeabilizace tkání zvaným SHANEL (small-micelle-mediated human organ effective clearing and labeling). Zóna kůry měla rozměry přibližně 2742 ± 665 mm (průměr ± SD), která obsahovala glomerulární kapiláry o průměru 221 ± 37 mm a aferentní arteriola měla průměr 71 ± 28 mm. Kromě toho byl v oblasti neurověd vyvinut vysoce sofistikovaný rámec založený na hlubokém učení pro kvantifikaci neuronální vaskulatury po OTC, nazvaný VesSAP (vessel segmentation & analysis pipeline) [93].

Navzdory skutečnosti, že v oblasti OTC bylo v posledních letech dosaženo velkého pokroku, některé nevýhody stále přetrvávají, protože exprese endogenních FL fluoroforů většinou není uspokojivě zachována, což omezuje použití transgenních zvířat. Hlavním problémem však je, že morfologická velikost tkáně a následně vaskulatury se mění drsnými rozpouštědly požadovanými pro OTC. Navíc obrovské množství dat produkovaných LSFM zůstává výzvou nejen pro správné ukládání dat a manipulaci s nimi, ale také pro kvantitativní analýzu [87].

Stručně řečeno, jednou z důležitých výhod aplikací technik, jako je mikro-CT nebo SFM, je to, že lze zachytit prostorovou distribuci cév a identifikuje se strukturní vzácnost vaskulární sítě s vhodným rozlišením pro zobrazení téměř všech renálních kapilárních struktur. Obě techniky však vyžadují fixaci a lze je tedy provádět pouze ex vivo. Pro monitorování morfologických a funkčních změn renální mikrovaskulatury jsou žádoucí in vivo strategie časového zobrazování.

4.2. In vivo

Aplikace zobrazovacích modalit in vivo by nabídla příležitost vyhodnotit buněčnou terapii v reálném čase a ověřit možné terapeutické účinky na vaskulární úrovni. V důsledku toho jsou pokroky v oblasti biomedicínského zobrazování in vivo naléhavé pro studium účinků založených na MSC na renální vaskulaturu. Pouze ruka plná studií použila in vivo zobrazování ke zkoumání působení MSC s využitím multifotonové mikroskopie (MPM) [94], CT [95,96] a zobrazování magnetickou rezonancí (MRI) [95–97].

4.2.1. Multifotonová mikroskopie (MPM)

Multifotonová mikroskopie (MPM) závisí na současné absorpci dvou nebo více fotonů pouze v ohniskové rovině, která byla dostupná v roce 1995 [98]. Dynamické procesy lze vizualizovat in vivo na buněčné úrovni a kromě studia renálního vaskulárního průtoku krve [63] nabízí MPM možnost monitorovat různé renální mikrovaskulární segmenty v reálném čase. Vysoké rozlišení umožňuje vizualizaci aferentních a eferentních arteriol a glomerulárních kapilár. I když je technicky možný přístup k dřeňové mikrocirkulaci, stále zůstává problémem kvůli hloubce průniku [98]. Je však možné zobrazit celý glomerulus o přibližném průměru 100 µm a získat přístup k dynamickým procesům na buněčné úrovni.

Důležité je, že mikrovaskulární únik in vivo lze vizualizovat a kvantifikovat pomocí extravazace Evansovy modři ve fibrotických ledvinách pomocí MPM [99]. Byl kvantifikován počet perfundovaných kapilár a průměr byl stanoven hluboko pod 10 um. Nedávno naše výzkumná skupina aplikovala MPM, aby poskytla in vivo důkaz, že organoidy ledvin derivované z lidských pluripotentních kmenových buněk (hPSC) tvoří funkční spojení s již existující renální vaskulaturou u myší po renální subkapsulární transplantaci [100,101].

Výhodou MPM je absence fluorescence FL mimo ohnisko a omezené fotobělení v ohniskové oblasti [98]. Jednou z nevýhod je však omezená hloubka zobrazení, která vyžaduje použití abdominálního zobrazovacího okna pro přístup k renální vaskulatuře in vivo [102,103]. Toto břišní okno umožňuje zobrazování in vivo po dobu několika týdnů až jednoho měsíce; vložení takového zobrazovacího okna však vyžaduje invazivní chirurgický zákrok a je spojeno s možností zánětu. Navíc se někdy ztratí zobrazovací okna a může dojít k nekróze tkáně [102]. Je zřejmé, že tuto zobrazovací metodu nelze převést do klinické praxe.

Od zavedení ruční vitální mikroskopie (HVM) do klinické praxe je dosažitelná zajímavá alternativa k neinvazivnímu monitorování průtoku kapilární krve u lůžka [104]. I když je tato zobrazovací modalita založena na zcela odlišné technologii, tj. na videomikroskopech s bočním proudem a dopadajícím temným polem, nabízí hodnocení povrchově umístěných kapilár v reálném čase. Nové klinicky implementované algoritmy, známé jako softwarové balíčky MicroTools, umožňují automatizovanou mikrovaskulární zobrazovací analýzu celkové a perfundované hustoty cév pro přístup k angiogenezi, dilataci/konstrikci cév a rovnováze tekutin, stejně jako kapacitě dodávky kyslíku na základě kapilárního hematokritu a rychlosti erytrocytů [105 ]. Pro studium renální mikrovaskulatury však tyto modality nejsou vhodné kvůli jejich omezené hloubce průniku.

4.2.2. Počítačová tomografie (CT)

Neinvazivní zobrazovací modality schopné monitorovat a kvantifikovat morfologické a funkční změny renální mikrovaskulatury jsou velmi žádané pro určení role mikrovaskulatury v progresi onemocnění do CKD. I když kauzální vztah mezi kapilární vzácností a progresí renální fibrózy byl rozpoznán již mnoho let, Ehling et al. [3] jako první provedli neinvazivní kvalitativní a kvantitativní analýzy anatomických a funkčních vaskulárních změn během progrese CKD. Progresivní pokles renálního krevního objemu byl pozorován pomocí mikro-CT s kontrastem in vivo u tří myších modelů s progresivní fibrózou ledvin, tj. ischemicko-reperfuzním poškozením (IRI), jednostrannou ureterální obstrukcí a Alportovými myšmi. Kromě funkčních změn mikrocév korelovala peritubulární vaskulární ztráta s tvorbou fibrotické tkáně ve všech třech myších modelech CKD. Aby však bylo možné získat informace o bodech větvení, průměru cév a tortuozitě, bylo zapotřebí mikro-CT ex vivo, což naznačuje potřebu nových biomedicínských zobrazovacích technologií, které poskytují přístup k mikrocévám in vivo s téměř buněčným rozlišením.

Hlavní výhodou CT je, že vizualizace renální vaskulatury je pořízena během několika minut s přiměřeným rozlišením a poskytuje 3D informaci o vaskulární organizaci. Použitím kontrastních látek na bázi jódu se kontrast zvýší a dosáhne se ještě detailnějšího zobrazení mikrovaskulatury. Nedávno bylo kvalitativní a kvantitativní hodnocení myších ledvin pomocí mikro-CT za fyziologických a patologických stavů zdokonaleno perfuzí kyselinou fosfowolframovou (PTA) ke zvýšení kontrastu v krevních cévách [106]. I když omezení, že tepny a žíly nebylo možné od sebe jasně odlišit, rozlišení s velikostí voxelu 40 µm in vivo a velikostí voxelu 12,5 µm ex vivo zachytilo organizaci až do úrovně obloukovitých krevních cév.

Další velkou nevýhodou použití CT k monitorování renálního onemocnění je však nutnost použití jodovaných rentgenových kontrastních látek. O těchto kontrastních látkách je známo, že způsobují nefrotoxicitu, což je kontraindikací pro klinickou aplikaci u pacientů s preexistujícím renálním poškozením [107–109]. Akutní poškození ledvin v důsledku podané kontrastní látky mění renální hemodynamiku a způsobuje medulární hypoxii, která je zvláště nežádoucí při vyšetřování renální mikrovaskulární vzácnosti. Podobně kontrastní látky na bázi gadolinia široce používané v MRI jsou eliminovány ledvinami a zdá se, že způsobují poškození ledvin [110].

4.2.3. Zobrazování magnetickou rezonancí (MRI)

MRI byla zavedena do klinické praxe v 80. letech 20. století a okamžitě se stala jednou z nejpoužívanějších zobrazovacích technik [111]. MRI je neinvazivní a neionizující zobrazovací modalita, která aplikuje silné magnetické pole a pomocí změny kontrastních látek T1 a T2 lze detekovat relaxační vlastnosti krve. Kromě toho magnetická rezonanční angiografie (MRA) vizualizuje vaskulární architekturu malých zvířat pomocí kontrastní látky na bázi gadolinia. Velkou nevýhodou MRA je však obtížné použití požadované kontrastní látky. Naštěstí lze renální perfuzi stanovit s použitím kontrastních látek i bez nich, což přináší výhody i omezení [112].

Bez použití kontrastní látky využívá spin-labeling endogenní vodu jako difuzní indikátor, který umožňuje kvantifikovat pouze perfuzi v ledvinové kůře, protože doba medulárního tranzitu je příliš dlouhá na to, aby byla zachycena. Kromě toho se pro stanovení průtoku krve ledvinami měří fázové posuny spinů v jednom směru, což implikuje potřebu kolmé zobrazovací roviny směrem k arteriím zájmu pro dosažení přesného měření [112]. Proto není divu, že tato technika představuje velkou výzvu, pokud jde o vizualizaci renálních tepen, nemluvě o malých kortikálních kapilárách.

Funkčnost cév lze určit kvantifikací RBF pomocí MR perfuze a monitorováním stavu okysličení pomocí kontrastního zobrazení závislého na hladině kyslíku v krvi (BOLD) [112,113]. Hlavním omezením funkční MRI je však dosažení spolehlivých a reprodukovatelných výsledků v orgánech, které jsou postiženy respiračními pohyby, mezi něž patří ledviny, i když jsou méně náchylné k pohybovým artefaktům ve srovnání s játry nebo střevem [112]. Navzdory skutečnosti, že studie proveditelnosti provedené pomocí 1,5 Tesla funkční MRI poskytly velký slib při provádění voxelové kvantifikace [114], perfuzní abnormality bylo možné detekovat pouze v patologických oblastech, což vyvolává otázku, zda budou dostatečně detekovány drobné vaskulární změny. Se zavedením MRI skeneru se silou magnetického pole 3.{13}} Tesla se výrazně zlepšil poměr signálu k šumu [115 116], problémem však zůstává získané rozlišení.

Rozlišení poskytované magnetickou rezonancí závisí hlavně na síle magnetického pole a může být optimalizováno pro jakékoli dané magnetické pole přizpůsobením pulzních sekvencí [111]. Prostorové rozlišení je omezeno především poměrem signálu k šumu, který vyžaduje rychlý čas akvizice a obecně dosahuje rozlišení 3 × 4 mm ve velikosti pixelu [117]. I když je aplikováno vysoké magnetické pole 7 Tesla, nejlepší rozlišení, kterého lze s BOLD dosáhnout, je kolem 500 µm. Kromě neuspokojivého rozlišení a omezení vizualizace většiny dynamických procesů je další velkou nevýhodou to, že MRI je spojena s vysokými náklady a vyžaduje speciální zařízení a údržbu.

4.2.4. Ultrazvuk

Pokroky v ultrazvuku přinesly změnu paradigmatu pro neinvazivní monitorování strukturálních a funkčních renálních mikrovaskulárních změn a otevřely nové cesty k průzkumu malých cév pomocí přenosného systému za relativně nízkou cenu. Na potkaním modelu akutní ischemie způsobené těžkou hypoperfuzí po dobu 1 hodiny byl renální průtok krve hodnocen v reálném čase pomocí barevného a pulzního dopplerovského ultrazvuku (PW) [118]. Barevné dopplerovské zobrazování také odhalilo obtížnost vizualizace obloukových tepen kvůli jejich relativně malé velikosti a kolmému umístění sondy pro zachycení tepenného toku potřebného pro výpočet rychlosti krve a aplikaci dopplerovské korekce úhlu. Rychlost krve však mohla být vypočtena pouze na intrarenálních tepnách, tj. segmentálních, interlobárních a obloukových tepnách. V důsledku toho nebylo možné získat informace o mikrocirkulaci kvůli omezení rozlišení poskytovaného konvenčním ultrazvukem.

Se zavedením ultrarychlé dopplerovské ultrazvukové technologie bylo možné dosáhnout vyššího rozlišení přenosem nezaostřených vln, který vysílá několik synchronních vln při vysoké snímkové frekvenci současně v jednom celém zorném poli, spíše než skenování řádek na řádek pomocí aplikace fokusovaný přenos paprsku [119]. Tento přenos rovinných vln je základním konceptem ultrarychlého dopplerovského ultrazvukového zobrazování a umožňuje detekovat kortikální cévy transplantované lidské ledviny o průměru pod 1 mm [120]. Ultrarychlý dopplerovský ultrazvuk navíc poskytuje velmi příznivou techniku ​​in vivo pro monitorování renální mikrovaskulární vzácnosti v preklinických studiích (obrázek 3A). Přes pokroky ultrarychlého dopplerovského ultrazvuku je přístup ke kapilární hladině stále závislý na použití kontrastních látek [121]. Při použití kontrastní látky pro dopplerovský ultrazvuk však neexistují žádné cenné bezpečnostní obavy, zvláště ve srovnání s kontrastními látkami pro CT a MRI, které často vykazují nefrotoxicitu [122]. Neuvěřitelné rozlišení myší ledvinové vaskulatury však může být dosaženo in vivo (obrázek 3B).

Ultrazvuková lokalizační mikroskopie (ULM) vyřešila kompromis mezi prostorovým rozlišením a hloubkou průniku jednak aplikací ultrarychlého dopplerovského ultrazvukového zobrazování a jednak využitím ultrazvukových kontrastních látek ve formě plynem naplněných mikrobublin. [121,123,124]. Mimo jiné Errico a spol. [123] navrhli ULM k zobrazení kraniálních mikrocév o průměru 10 µm po celé hloubce myšího mozku, který je tlustý přibližně 10 mm. V nedávné publikaci Demené et al. [125] mohl zachytit dynamiku cerebrovaskulárního průtoku krve na mikroskopické úrovni hluboko v lidském mozku tím, že by jednotlivě sledoval intravenózně injikované mikrobubliny, aby se zlepšilo zobrazování s vysokým rozlišením a umožnilo vaskulární rozlišení až 25 µm. Abychom pochopili tento úžasný úspěch, je důležité zmínit, že žádná jiná neinvazivní zobrazovací modalita nedokázala vizualizovat mikrovaskulaturu in vivo pod milimetrovou stupnicí. K dosažení tohoto pozoruhodného prostorového rozlišení in vivo bylo třeba překonat dvě hlavní výzvy: aberaci lebky a pohybové artefakty. I když aplikaci ULM pro břišní orgány, jako jsou ledviny, nebrání aberace kostních struktur, pohybové artefakty představují velkou obtíž. Nedávné studie in vivo však úspěšně poskytly první pokusy o zobrazení renální vaskulatury pomocí ULM [5,126,127].

V ledvinách potkana bylo možné rozlišit různé vaskulární kompartmenty a aplikací mikrobublinek se zvýšilo rozlišení pro vizualizaci tenkých cévních svazků vasa recta, které jsou od sebe odděleny ve vzdálenosti 400 µm [5]. Navíc byla odhadnuta axiální rychlost krve, tj. pod 2 mm/s, spojená s průtokem ledvinovými mikrocévami, sledováním injikovaných mikrobublin o průměru 1 um, které mohou dosáhnout průměru cévy menšího než 20 um. Song a kol. [127] zobrazili renální kortikální mikrocévy králíků a mohli jasně oddělit cévy in vivo o průměru 76 µm. Přestože respirační pohyb lze korigovat, pohybové artefakty mimo rovinu zůstávají náročné a nelze je opravit, protože zobrazovací informace nelze zcela získat [5].

Nedávno byla progrese AKI do CKD studována pomocí kontrastního ultrarychlého dopplerovského ultrazvuku na myším modelu unilaterální IRI [6]. Pomocí injekce mikrobublinek byly identifikovány 32 um malé renální krevní cévy a byly kvantifikovány vaskulární změny v ledvině, tj. renální krevní objem, vaskulární hustota a tortuozita. Vaskulární hustota kortexu a kortikomedulárního spojení získaná ultrazvukem během in vivo zobrazování byla v souladu s kvantifikací získanou po imunobarvení CD31, které je uznáváno jako zlatý standard ve vaskulární biologii. To je v souladu s další studií, kterou provedli Cao et al. [128], který ilustroval, že závažnost AKI lze určit pomocí ultrazvuku se zvýšeným kontrastem pomocí injekce mikrobublin. Měření renální perfuze in vivo úzce koreluje s poškozením ledvin stanoveným na histologické úrovni.

V souladu s těmito ultrazvukovými studiemi Hueper et al. [7] dříve navrhli, že perfuze ledvin může předpovídat progresi AKI k CKD stanovenou pomocí MRI.

Ultrazvukové zobrazení renální vaskulatury pomocí mikrobublinek již bylo u lidí úspěšně provedeno za účelem stanovení renální mikrovaskulární perfuze a ukázalo velkou perspektivu pro diagnostiku [129–133]. Je zajímavé, že tato zobrazovací modalita byla použita při transplantaci ledvin ke stanovení stavu perfuze ledvinových aloštěpů, což může poskytnout vhodné neinvazivní výsledky pro predikci akutní rejekce [134]. Kromě závislosti na operátorovi, která může představovat omezení při použití ultrazvuku, byla síla shody mezi pozorovateli velmi vysoká mezi dvěma čtenáři, což odráží velkou proveditelnost při aplikaci v klinickém prostředí [132]. Vzhledem k přenositelnosti a časově úsporné a jednoduché přizpůsobené aplikaci poskytuje ultrazvuk s kontrastními mikrobublinami skvělé perspektivy pro hodnocení renální mikrovaskulatury v klinické praxi, zejména u pacientů na JIP [135]. Tato technologie proto nabízí velký příslib pro převedení do klinické praxe po úspěšném zvládnutí korekce pohybových artefaktů břicha pro robustní sledování mikrobublin s vysokou přesností.

5. Závěry a perspektivy

Nápadná heterogenita renální vaskulární architektury odráží její komplexní funkční diverzitu a kompartmentalizaci, s logickým důsledkem, že studium mikrovaskulárních změn a vzácností vyžaduje sofistikované zobrazovací modality. Vývoj, aplikace a zlepšení in vivo zobrazovacích modalit pro studium renálních vaskulárních onemocnění poskytne lepší porozumění působení buněčných terapií, jako je MSC, na vaskulární úrovni a může objasnit specifické biomarkery, které lze monitorovat během progrese onemocnění.

Reference

1. Chade, AR Renální cévní struktura a vzácnost. Kompr. Physiol. 2013, 3, 817–831. [CrossRef] [PubMed]

2. Chade, AR Small Vessels, Big Role: Renální mikrocirkulace a progrese renálního poškození. Hypertenze 2017, 69, 551–563. [CrossRef] [PubMed]

3. Ehling, J.; Bábícková, J.; Gremse, F.; Klinkhammer, BM; Baetke, S.; Knochel, R.; Kiessling, F.; Floege, J.; Lammers, T.; Boor, P. Kvantitativní zobrazení vaskulární dysfunkce u progresivních onemocnění ledvin pomocí mikropočítačové tomografie. J. Am. Soc. Nephrol. 2016, 27, 520–532. [CrossRef] [PubMed]

4. Chen, TK; Knicely, DH; Grams, ME Diagnóza a léčba chronického onemocnění ledvin: Přehled. Physiol. Chovej se. 2019, 322, 1294–1304. [CrossRef] [PubMed]

5. Foiret, J.; Zhang, H.; Ilovitsh, T.; Mahakian, L.; Tam, S.; Ferrara, KW Ultrazvuková lokalizační mikroskopie k zobrazení a posouzení mikrovaskulatury v ledvině potkana. Sci. Rep. 2017, 7, 13662. [CrossRef] [PubMed]

6. Chen, Q.; Yu, J.; Rush, BM; Stocker, SD; Tan, RJ; Kim, K. Kidney Int. 2020, 98, 355–365. [CrossRef] [PubMed]

7. Hueper, K.; Gutberlet, M.; Rong, S.; Hartung, D.; Mengel, M.; Lu, X.; Haller, H.; Wacker, F.; Meier, M.; Gueler, F. Akutní poškození ledvin: Značení arteriální rotace k monitorování renální perfuze u myší – srovnání s histopatologickými výsledky a renální funkcí. Radiologie 2014, 270, 117–24. [CrossRef]

8. Levy, BI; Schiffrin, EL; Mourad, JJ; Agostini, D.; Vicaut, E.; Šafář, ME; Struijker-Boudier, HA Porucha tkáňové perfuze patologie společná pro hypertenzi, obezitu a diabetes mellitus. Náklad 2008, 118, 968–976. [CrossRef]

9. Carmeliet, P.; Jain, RK Molekulární mechanismy a klinické aplikace angiogeneze. Příroda 2011, 473, 298–307. [CrossRef]

10. Molema, G.; Aird, WC Vaskulární heterogenita v ledvinách. Semin. Nephrol. 2012, 32, 145–155. [CrossRef]

11. Armulík, A.; Abramson, A.; Betsholtz, C. Interakce endotel/pericyt. Circ. Res. 2005, 97, 512–523. 03.16652.d7. [CrossRef]

12. Attwell, D.; Mishra, A.; Hall, CN; O'Farrell, FM; Dalkara, T. Co je pericyt? J. Cereb. Blood Flow Metab. 2016, 36, 451–5. [CrossRef]

13. Evans, RG; Eppel, GA; Anderson, WP; Denton, KM Mechanismy, které jsou základem diferenciální kontroly průtoku krve v ledvinové dřeni a kůře. J. Hypertens. 2004, 22, 1439–1451. [CrossRef]

14. Pallone, TL; Silldorff, EP; Turner, MR Intrarenální krevní tok: Mikrovaskulární anatomie a regulace medulární perfuze. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 1998, 25, 383–392. doi:10.1111/j.1440-1681.1998.tb02220.x. [CrossRef]

15. Pallone, TL; Edwards, A.; Mattson, DL Renální medulární oběh. Kompr. Physiol. 2012, 2, 97–140. [CrossRef] [PubMed]

16. Guerci, P.; Ergin, B.; Ince, C. Makro- a mikrocirkulace ledvin. Nejlepší praxe. Res. Clin. anesteziol. 2017, 31, 315–329. [CrossRef]

17. Shaw, I.; Rider, S.; Mullins, J.; Hughes, J.; Péault, B. Pericytes v renální vaskulatuře: Role ve zdraví a nemoci. Nat. Rev. Nephrol. 2018, 14, 521–534. [CrossRef]

18. Rosivall, L.; Peti-Peterdi, JJ Heterogenita aferentní arterioly – korelace mezi morfologií a funkcí. Nephrol. Vytáčení. Transplantace. 2006, 21, 2703–2707. [CrossRef]

19. Štefanská, A.; Kenyon, C.; Christian, HC; Buckley, C.; Shaw, I.; Mullins, JJ; Péault, B. Perocyty lidských ledvin produkují renin. Kidney Int. 2016, 90, 1251–1261. [CrossRef]

20. Schlondorff, DO Přehled faktorů přispívajících k patofyziologii progresivního onemocnění ledvin. Kidney Int. 2008, 74, 860–866. [CrossRef]

21. Pallone, TL; Zhang, Z.; Rhinehart, K. Fyziologie renální medulární mikrocirkulace. Dopoledne. J. Physiol. Ren. Physiol. 2003, 284, F253–66. [CrossRef] [PubMed]

22. Pallone, TL Komplexní cévní svazky, tlusté vzestupné končetiny a akvaporiny: Vyždímání vnější dřeně. Dopoledne. J. Physiol. Ren. Physiol. 2014, 306, 505–506. [CrossRef] [PubMed]

23. Zimmerhackl, BL; Robertson, ČR; Jamison, RL Medulární mikrocirkulace. Kidney Int. 1987, 31, 641–647. [CrossRef] [PubMed]

24. Dumas, SJ; Meta, E.; Borri, M.; Luo, Y.; Li, X.; Rabelink, TJ; Carmeliet, P. Fenotypová diverzita a metabolismus. Nat. Rev. Nephrol. 2021, 1–24. [CrossRef]

25. Dumas, SJ; García-Caballero, M.; Carmeliet, P. Metabolické znaky odlišných endoteliálních fenotypů. Trendy Endocrinol. Metab. 2020, 31, 580–595. [CrossRef]

26. Jourde-Chiche, N.; Fakhouri, F.; Dou, L.; Bellini, J.; Burley, S.; Format, M.; Jarrot, PA; Kaplanski, G.; Le Quintrec, M.; Pernin, V.; a kol. Struktura a funkce endotelu při zdraví a onemocnění ledvin. Nat. Rev. Nephrol. 2019, 15, 87–108. [CrossRef]

27. Dlouhá, DA; Norman, JT; Dobře, LG Obnovení renální mikrovaskulatury k léčbě chronického onemocnění ledvin. Nat. Rev. Nephrol. 2012, 8, 244–250. [CrossRef]

28. Choi, YJ; Chakraborty, S.; Nguyen, V.; Nguyen, C.; Kim, BK; Shim, SI; Suki, WN; Truong, LD Peritubulární kapilární ztráta je spojena s chronickým tubulointersticiálním poškozením lidských ledvin: Změněná exprese vaskulárního endoteliálního růstového faktoru. Hučení. Pathol. 2000, 31, 1491–1497. [CrossRef]

29. Ishii, Y.; Sawada, T.; Kubota, K.; Fuchinoue, S.; Teraoka, S.; Shimizu, A. Poranění a progresivní ztráta peritubulárních kapilár při rozvoji chronické aloštěpové nefropatie. Kidney Int. 2005, 67, 321–332. [CrossRef]

30. Serón, D.; Alexopoulos, E.; Raftery, MJ; Hartley, B.; Cameron, JS Počet intersticiálních kapilárních průřezů hodnocených monoklonálními protilátkami: Vztah k intersticiálnímu poškození. Nephrol. Vytáčení. Transplantace. 1990, 5, 889–893. [CrossRef]