Část 1: Nový přístup ke zvýšení regeneračního potenciálu cirkulujících endoteliálních progenitorových buněk u pacientů s onemocněním ledvin v konečném stádiu

Pro více informací Kontakttina.xiang@wecistanche.com

Abstraktní: Cirkulující endoteliální progenitorové buňky (EPC) pocházející z kostní dřeně usnadňují vaskulární opravu v několika orgánech včetně ledvin, ale v konečné fázi se postupně zmenšujínemoc ledvin(ESKD), což koreluje s kardiovaskulárními výsledky a související mortalitou. Zjistili jsme tedy, zda zvýšení tkáňových reparačních účinků mezenchymálních stromálních buněk (BM-MSC) pocházejících z lidské kostní dřeně s vaskulogickými účinky rekombinantního lidského relaxinu (RLX) může podporovat proliferaci a funkci EPC. CD34 plus EPC byly izolovány z krve zdravých pacientů a pacientů s ESKD, kultivovány, dokud se nevytvořily pozdní EPC, a poté stimulovány kondičním médiem odvozeným od BM-MSC (CM; 25 procent o), RLX (1 nebo 10 ng/ml) nebo oběma léčby kombinované. Zatímco samotný RLX stimuloval proliferaci EPC, tvorbu kapilár a hojení ran in vitro, tato opatření byla rychleji a výrazněji posílena kombinovanými účinky CM odvozených od BM-MSC a RLX v EPC odvozených od zdravých pacientů i pacientů s ESKD. Tato zjištění mají důležité klinické důsledky, protože identifikovala novou kombinovanou terapii, která může obnovit a zvýšit počet a funkci EPC u pacientů s ESKD.

Klíčová slova: endoteliální progenitorové buňky; konečné stádium onemocnění ledvin; mezenchymální kmenové buňky odvozené z kostní dřeně; relaxin; hojení ran; angiogeneze; regenerace

Kliknutím sem se dozvíte více o cistanche na prodej

1. Úvod

Chronické onemocnění ledvin(CKD) je globální zdravotní problém, definovaný jako snížení rychlosti glomerulární filtrace (GFR) menší nebo rovné 60 ml/min/1,73 m2, který často vede ke konečnému (stadiu V) onemocnění ledvin (ESKD; definované jako GFR Menší nebo rovno 15 ml/min/1,73 m2)[2]. Patologické rysy CKD zahrnují tubulární atrofii spojenou s redukcí renálních kapilár a podocytů, destrukcí renálních endoteliálních buněk a rozvojemrenální fibróza[3,4]. Endotel ledvin je během těchto procesů narušen, což vede k poruše angiogeneze a funkce ledvin [5]. Následujícípoškození ledvinendoteliální progenitorové buňky (EPC) derivované z kostní dřeně se rekrutují do míst poranění, aby se usnadnila oprava tkáně [6]. EPC hrají klíčovou roli při zrání a proliferaci endoteliálních buněk ledvin, vaskulární integritě a opravě poškozeného endotelu. Počet cirkulujících EPC se však u pacientů s ESKD progresivně snižuje [7-9], což koreluje s nepříznivými kardiovaskulárními výsledky [9,10] a dlouhodobou mortalitou.

Bylo popsáno, že mezenchymální stromální buňky (MSC) podporují angiogenezi stimulací EPC programování. I když byly MSC hodnoceny v různých klinických studiích [13], jejich schopnost usnadnit regeneraci endotelu ledvin nebyla zkoumána. Nedávné studie z naší laboratoře identifikovaly zvýšený terapeutický potenciál kombinace MSC pocházejících z lidské kostní dřeně (BM) s antifibrotickým činidlem, jmenovitě rekombinantním lidským (gen{3}})relaxinem (serelaxin; RLX[14) při zlepšování poškození ledvin,záněta fibróza v preklinických modelech onemocnění. Zatímco samotný RLX může stimulovat proliferaci EPC pocházející z lidské krve a produkci oxidu dusnatého (NO) in vitro a vaskulogenezi u myší in vivo[18], zůstává neznámé, zda by jeho kombinované účinky s BM-MSC mohly urychlit a/nebo zvýšit EPC- odvozená angiogeneze a hojení ran. Tato studie tedy hodnotila terapeutický potenciál kombinace RLX a kondicionovaného média (CM) odvozeného od BM-MSC na proliferaci EPC, angiogenezi a hojení ran in vitro u zdravého versus ESKD pacienta.

2. Materiály a metody

2.1. Izolace a kultivace EPC z periferní krve

Po obdržení podepsaného formuláře souhlasu pacienta bylo od Australského Červeného kříže odebráno přibližně {{0}}} ml krve od zdravých mužských kontrol. Na rozdíl od toho bylo z Monash Medical Center odebráno maximálně ~5 ml krve mužských pacientů s ESKD kvůli jejich zdravotnímu stavu. Všechny vzorky krve byly zpracovány do 24 hodin od doby odběru. Všechny vzorky krve byly naředěny 1× Hankovým vyváženým solným roztokem (HBSS; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) na celkový objem 20 ml. Poté byla krev opatrně navrstvena přes 15 ml Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare, Uppsala, Švédsko) do 50 ml zkumavky Falcon (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) a centrifugována při 400× g po dobu 40 minut při pokojové teplotě, aby se oddělila buffy coat od ostatních složek použitím separační metody s hustotním gradientem, jak bylo popsáno dříve [19,20]. Po gradientové separaci byla horní vrstva obsahující plazmu a krevní destičky odstraněna opatrným vložením sérologické pipety, přičemž zůstal nenarušený buffy coat obsahující mononukleární buňky z periferní krve (PBMC), sestávající z endoteliálních progenitorových buněk (EPC). Peleta byla resuspendována ve 2 ml média pro růst endotelových buněk (EGM)-2 Microvascular (MV)Bullet Kit (produkt #CC-3162, Lonza, Hayward, CA, USA); doplněno 5 procenty fetálního bovinního séra (FBS), 0,04 procenta hydrokortizonu, 0,4 procenta lidského fibroblastového růstového faktoru (hFGF) a 0,1 procenta vaskulárního endoteliálního růstového faktoru (VEGF), R3-inzulinu podobného růstového faktoru (IGF )-1, kyselinu askorbovou, lidský epidermální růstový faktor (hEGF) a gentamicin sulfát/amfotericin (GA-1000), ke kultivaci izolovaných EPC. Buňky byly spočítány pomocí CountessM Automated Cell Counter (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) předtím, než byly naočkovány na fibronektinem potažené kultivační destičky/lahve.

The yield of EPC varied significantly between the uncomplicated control and ESKD patients. More specifically EPC yield was significantly lower in ESKD patient samples compared to control and this observation was consistent with previous studies reported in our laboratory[19]. EPCs isolated from healthy controls were directly seeded into T-75 flasks(1-10 × 10'cells per sample), which were supplemented with 10 mL of pre-warmed endothelial growth media-2(EGM-2).In contrast, due to the low yield of EPCs from the ESKD patient samples, the cells were seeded at a density of 1 × 10°cells per well into 12 well plates, with the addition of pre-warmed EGM-2, giving a total volume of 2 mL per well. Due to the large variability in the yield of EPCs isolated from ESKD patients, cells were plated in one well of a 12-well plate if the cell yield was less than 1 ×10°cells. The media was changed every second day until outgrowth endothelial cells (OECs, also known as late EPCs) were observed. These late EPCs were identified by their cobble-stone appearance under light microscopy (Olympus CK-X41, USA). A maximum period of 30 days was allowed for late EPCs to be detected, which were further cultured until~80% confluency was reached. The cells were then passaged 1-2 times to obtain the desired number of cells for all functional assays including proliferation, tube formation, and wound-healing assays as detailed below. Cellular morphological characteristics were further assessed by the ability of the EPC cultures in both control and ESKDpatients to form a number of colonies (>50 buněk/kolonii) za použití testu jednotky tvořící kolonie (CFU).

2.2. Příprava kondicionovaného média (CM) z kultivovaného BM-MSC

Protože přidání BM-MSC ke kulturám EPC by ohrozilo měřené koncové body spojené s EPC, bylo rozhodnuto, že by bylo lepší analyzovat účinky CM odvozené od BM-MSC na funkci EPC, jak bylo dříve použito pro analýzu. jiných koncových bodů [19]. Stručně řečeno, BM-MSC byly pěstovány v Alpha-Minimum Essential Media (-MEM; Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Austrálie), doplněném 16 procenty fetálního bovinního séra (FBS) a 1 procentem 200 mM L-glutamin a 1 procento penicilin/streptomycin. Jakmile buňky dosáhly ~80% konfluence, BM-MSC byly dále subkultivovány a umístěny na 12-jamkovou destičku v hustotě ~0,5×10 stupňů na jamku a udržovány v kultuře po dobu 24-48 h k zajištění buněčného připojení. Pro přípravu kondicionovaného média (CM) z BM-MSC byly buňky krátce třikrát promyty předehřátým 1 ml 1 x HBSS. Po promývacích krocích bylo přidáno 500 μl séra a bazálního média endoteliálních buněk bez růstového faktoru (EBM; Produkt #CC-3121.Lonza, Hayward, CA, USA) byl přidán k buňkám a udržován v kultuře při 5 procentech CO, 37 stupňů po dobu dalších 24 hodin. Na konci této inkubační doby byl CM sebrán a centrifugován při 400 x g po dobu 10 minut, aby se odstranily veškeré buněčné zbytky. CM v 500 μl alikvotech byl skladován při -80 stupni až do budoucího použití.

2.3. Funkční testy

2.3.1. Léčba kultivovaných pozdních EPC

Jakmile byly sklizeny pozdní EPC, byly provedeny funkční testy. Všechny experimenty byly provedeny v pasážích 3-6. Byly provedeny funkční testy, aby se prozkoumal účinek (i)25 procent kondicionovaného média odvozeného z BM-MSC (25 procent CM)[20];(ii)1 [RLX-1] nebo 10 [RLX-10 ]ng/ml [18] RLX (představující cirkulující hladiny H2 relaxinu nalezené u těhotných žen [21]); nebo (i) kombinované účinky 25 procent CM a 1 nebo 10 ng/ml RLX; (iv) 20 procent FBS bylo použito jako pozitivní kontrola na proliferaci a potenciál tvorby trubic (angiogenní) pozdních EPC odvozených od kontrolních pacientů . Ošetřené skupiny byly porovnány s neošetřenými buňkami.

2.3.2. Test životaschopnosti a proliferace

Životaschopnost a proliferační potenciál pozdních EPC byly určeny pomocí {{0}}(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5- difenyltetrazolium bromid (MTT) test podle pokynů výrobce (Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC, Austrálie). Stručně, ~5×103 buněk na jamku bylo nasazeno na 96-jamkové destičky (BD Falcon, North Ryde, NSW, Austrálie), poté byly buňky ošetřeny CM odvozeným od BM-MSC, RLX (10 ng/ ml), nebo kombinaci CM a RLXat 1 nebo 10 ng/ml po dobu 24 hodin. Na konci inkubační doby bylo přidáno 10 μl MTT značícího činidla (0,5 mg/ml, Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC, Austrálie) a inkubováno při 37 stupních Cand 5 procent CO2 další 4 hodiny. Buňky byly solubilizovány přidáním 100 ul solubilizačního roztoku (Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC Austrálie) a proliferační potenciál pozdních EPC byl stanoven měřením absorbance každého vzorku při 590 nm pomocí mikrodestičky čtečky (Bio-strategy, Balwyn North, VIC, Austrálie) a analyzovány pomocí softwaru SoftMax Pro pro OS Windows (Ver. 7.3, Molecular Devices LLC, CA, USA). Každá z léčebných skupin byla provedena a analyzována v šesti opakováních.

2.3.3. Zkouška tvorby trubice

Účinky různých ošetření na podporu angiogenního potenciálu pozdních EPC pomocí testu tvorby trubice byly stanoveny pomocí testu μ-angiogeneze (Abidi, Fitchburg, WI, USA). Stručně řečeno, 10 μl Matrigelu se sníženým růstovým faktorem (GFR) (Produkt #356231, Corning, Tewksbury, MA, USA) bylo přidáno do vnitřní jamky μ-Slide soupravy pro analýzu angiogeneze (Abidi, Fitchburg, WI, USA ). Konfluentní kultury pozdních EPC byly nasazeny na potažené buňky a ošetřeny CM odvozeným od BM-MSC, RLX (10 ng/ml) nebo kombinací CM a RLX v koncentraci 10 ng/ml. Do každé jamky byl aplikován celkový objem 50 ul buněčné suspenze obsahující~1 x 104 buněk. Snímky byly okamžitě pořízeny a označeny jako 0-hodinový časový bod. Schopnost buněk při různých ošetřeních

byla pozorována forma zkumavek a snímky byly pořízeny 2-24 h po naočkování buněk pomocí světelného mikroskopu. Počet trubic, délka trubice a počet bodů rozvětvení byly stanoveny pomocí softwaru ImageJ.

2.3.4. Test hojení ran

Účinky různých ošetření na regenerační potenciál pozdních EPC byly stanoveny pomocí testu hojení ran. Pro provedení testu bylo ~ 1 x 10 buněk suspendováno v 50 ul růstového média a naočkováno do 2-jamkové silikonové misky o průměru 35 mm pro test hojení ran (Abidi Inc., Fitchburg, WI, USA). Umělé rány v miskách byly vytvořeny jemným odstraněním silikonových jamek pomocí sterilní pinzety (vzdálenost mezery=500±100μm）. Misky byly doplněny 2 ml 50% EGM-2 s přidáním různých ošetření zahrnující CM odvozený od BM-MSC, RLX (10 ng/ml) nebo kombinaci CM a RLX při 1 nebo 10 ng/ml Počet buněk, které migrovaly do uzavření rány, byl hodnocen pomocí světelné mikroskopie. migrované buňky byly zachyceny 0-24 h po ošetření. Procento oblasti uzavření mezery bylo stanoveno pomocí softwaru Image].

2.3.5. Analýza obrazu

Všechny obrazové analýzy pro funkční testy byly provedeny pomocí ImageJ pro MacOS (Ver. 1.8, National Institute of Health, Bethesda, MD, USA). Pro potenciál tvorby trubic pozdních EPC byly snímky analyzovány pomocí pluginu pro test angiogeneze a byly zaznamenány čtyři různé parametry včetně celkové délky, počtu ok, počtu spojení a počtu větví. Pro test hojení ran byla oblast uzavření rány analyzována ručním označením oblasti bez buněk v každém z časových bodů. Všechna měření byla provedena alespoň 3krát pro kontrolu odchylek.

2.3.6. Imunofluorescence

Lokalizace proteinu receptoru 1 receptoru relaxinové rodiny (RXFP1; příbuzný receptor RLX) v kultivovaných pozdních EPC byla stanovena pomocí imunofluorescenčního barvení. Nejprve byly ~1× 1{{20}} buňky pěstované na 13mm skleněném krycím sklíčku (potaženém poly-D-lysinem) v 12-jamkové destičce fixovány ve 4% PFA pro 15 min při pokojové teplotě. Fixované buňky byly blokovány pro nespecifickou proteinovou vazbu pomocí 1% hovězího sérového albuminu (BSA) po dobu 60 minut při teplotě místnosti. Na konci inkubační doby byly buňky promyty v PBS po dobu 5 minut (3krát) a inkubovány s králičí polyklonální protilátkou RXFP1 (aa 609-624; A 9227;1:2000; Immunodiagnostic AG, Bensheim, Německo ) v 0,01 procenta BSA přes noc při 4 stupních. Buňky byly promyty PBS a inkubovány s kozí-anti-králičí Alexa-fluor 594 sekundární protilátkou (1:500; Invitrogen, Scoresby, Victoria, Austrálie) v 0,01 procenta BSA po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Jaderné kontrastní barvení bylo provedeno přidáním 40 ul DAPI do montážního média Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) a překrytím krycím sklíčkem. Imunoreaktivní protein RXFP1 byl vizualizován pomocí fluorescenčního mikroskopu při 40násobném zvětšení (Olympus BX51) a snímky byly sloučeny pomocí softwaru ImageJ.

2.4. Statistické analýzy

Všechna data jsou uvedena jako průměr ± SEM a všechny statistické analýzy byly provedeny pomocí GraphPad Prism'M (Ver. 9; GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). K porovnání účinku různých ošetření na proliferaci (test MTT) a angiogenní (test tvorby zkumavky) pozdních EPC byla použita metoda ANOVA, po níž následoval Tukeyho post-hoc test, aby se umožnilo mnohonásobné srovnání mezi léčenými skupinami. Opakované měření - obousměrná - ANOVA byla použita k porovnání účinku různých způsobů léčby na uzavření rány pozdními EPC v průběhu času, po čemž následoval Tukeyův post-hoc test pro srovnání každé z léčebných skupin. P-hodnota menší než 0,05 byla považována za statisticky významnou.