ČÁST PRVNÍ Echinakosid zvyšuje množství spermií u potkanů ​​cílením na hypotalamický androgenní receptor

Jak echinakosid stimuluje estrogen a zvyšuje počet spermií?

Zhihui Jiang1,2, Bo Zhou2, Xinping Li2, Gordon M. Kirby3 & Xiaoying Zhang1,2

Mužská neplodnost je hlavním zdravotním problémem s odhadovanou prevalencí 4,2 procenta mužské neplodnosti na celém světě. Naše raná práce ukázala, že extrakty Cistanche chrání před poškozením spermií u myší a toechinakosid(ECH) je jednou z hlavních aktivních složek. Zde uvádíme zásadní roli proECH, přírodní produkt, který ruší nebo chrání před oligo, jako je aspermie u potkanů.ECHbyl testován pomocí HPLC, bylo hodnoceno množství a kvalita spermií a hladiny hormonů byly stanoveny radioimunosorbentovým testem. ECH snížila hladiny androgenního receptoru (AR) a klíčegeny související se steroidogeny, jak bylo stanoveno analýzou Western blot a qPCR. Interakce meziECHa AR byla hodnocena nepřímou ELISA a molekulárním dokováním. Výsledky ukazují, že ECH v kombinaci s hypotalamickou AR v kapse Met-894 a Val-713 inhibuje přenos AR zcytoplazmy do jader v hypotalamu. Zatímco negativní zpětná vazba regulace pohlavních hormonů byla inhibována, pozitivní zpětná vazba byla stimulována ke zvýšení sekrece luteinizačního hormonu a testosteronu a následně ke zvýšení množství spermií. Dohromady tyto údaje ukazujížeECHblokuje aktivitu AR v hypotalamu, čímž zvyšuje množství spermií a chrání před oligo aspermií u potkanů.

Pro více informací prosím kontaktujte:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola má mnoho účinků, klikněte sem a dozvíte se více

Produkce testosteronu v buňkách varlat je silně regulována osou hypotalamus-hypofýza-gonadální osa (HPG) vytvořením homeostatické zpětnovazební smyčky1. Hormon uvolňující gonadotropin (GnRH), vylučovaný hypotalamem, může stimulovat sekreci luteinizačního hormonu (LH) z hypofýzy, což dále stimuluje produkci testosteronu v testikulárních Leydigových buňkách. Testosteron je biosyntetizován řadou steroidogenních enzymů. Jako jedna z hlavních cest může steroidogenní akutní regulační (StAR) protein transportovat cholesterol z intracelulárních zdrojů do mitochondrií2, kde je vystaven enzymu štěpení bočního řetězce cholesterolu (CYP11A1), 3 -hydroxysteroid dehydrogenáze (HSD3), { {10}}hydroxyláza (CYP17A1) a 17-hydroxysteroid dehydrogenáza (HSD 17 ), které katalyzují přeměnu cholesterolu na testosteron3,4. Testosteron se pak negativně vrací zpět do elementu HPG, aby snížil další sekreci LH způsobem závislým na dávce.

Účinek testosteronu na zpětnovazební smyčku osy HPG nastává vazbou na androgenní receptor (AR), který se nachází jak v hypotalamu, tak v hypofýze5. U myší ablace AR a minimální produkce testosteronu způsobují zvýšení hladin LH a folikuly stimulujícího hormonu (FSH)6, což naznačuje, že AR se účastní regulace negativní napájecí smyčky. Klasický genomový mechanismus testosteronové signalizace nastává, když testosteron difunduje do buňky a váže se na AR. Tento komplex ligand-receptor se pak translokuje do jádra, kde se váže na androgenní responzivní elementy (ARE) v regulačních oblastech genů reagujících na testosteron, aby modifikovala jejich translokaci. Testosteron také indukuje neklasickou dráhu působení steroidních hormonů, charakterizovanou rychlými jevy, které vedou k aktivaci cytosolických signálních kaskád normálně spouštěných růstovými faktory7,8. Klasické i neklasické dráhy testosteronu přispívají k udržení spermatogeneze a plodnosti. Funkce AR je však důležitější v klasické dráze, protože testosteron působí na zvýšení kvality spermií.

Echinakosid(ECH) je jednou z bioaktivních složek pocházejících z léčivých rostlin Echinacea9 a Cistanche10. Se širokým spektrem farmakologických aktivit jsou extrakty z echinacey jedním z nejoblíbenějších bylinných doplňků v Evropě a USA především díky svým antioxidačním vlastnostem11 a schopnosti předcházet běžnému nachlazení12. Zajímavě,Cistancheextrakty aECHbyly tradičně používány jako tonikum k léčbě reprodukční dysfunkce a ke zvýšení mužské sexuální aktivity v tradiční čínské medicíně10. Některé OTC produkty extrakce Cistanche byly vyvinuty jako výživové doplňky a získávají na popularitě na trzích zdravé výživy v Číně a některých dalších asijských zemích (China Food and Drug Administration)13. Nicméně základní mechanismyECHakce zůstává nejasná. Mužská neplodnost je hlavním zdravotním problémem s odhadovanou prevalencí 4,2 procenta mužské neplodnosti na celém světě14. Diagnostika mužské neplodnosti je v současnosti založena na studiu kvality spermií včetně analýzy semenných parametrů, jako je koncentrace spermií, motilita a morfologie15. Bisfenol A (BPA) napodobující estrogen je široce rozšířeným kontaminantem životního prostředí, který byl studován pro svůj vliv na samčí plodnost u několika druhů zvířat a lidí16. BPA narušuje osu hypotalamus-hypofýza-gonadální osa, inhibuje expresi testikulárních steroidogenních enzymů a syntézu testosteronu u samců mláďat17, což způsobuje stav hypogonadotropního hypogonadismu18. V této studii zkoumáme účinkyECHna kvalitu spermií a hladinu hormonů. Kromě toho byl BPA vybrán jako modelové činidlo poškození spermií pro další studium ochranného účinkuECHproti špatné kvalitě spermií.

Výsledky ECH zvyšuje množství spermií. Počty spermií v cauda epididymis, životaschopnost spermií a motilita spermií jsou uvedeny v tabulce 1. Léčba 80 mg/kg ECH a 15 mg/kg testosteron propionátu (TP) významně zvýšila počet spermií nadvarlete. Nebyl však žádný významný rozdíl ve životaschopnosti spermií a pohyblivosti spermií.

ECH zvyšuje hladiny testosteronu a LH v séru, encefalu plus hypofýze a varlatech. Léčba ECH výrazně zvýšila hladiny LH v séru, encefalu plus hypofýze a varlatech (obr. 1A). Ve skupině ECH(H) se hladiny LH významně zvýšily 1.1-násobně v séru, 1.4-násobně v mozku a hypofýze a 1.2-násobně ve varlatech. Testosteron se po léčbě ECH(H) významně zvýšil 1,5 a 1{10}}krát v encefalu plus hypofýze a varlatech, ale ne v séru. Po léčbě TP se hladiny testosteronu významně zvýšily 1,6, 1,8 a 1{16}}krát v séru, encefalu plus hypofýze a varlatech.

ECH increased steroidogenic enzyme gene expression. ECH significantly increased the expressions of key steroidogenic enzymes in the testis (Fig. 1B). The mRNA levels of CYP11A1, CYP17A1, HSD3β1/2, and HSD17β in the ECH(H) group were increased more than 3-fold, while the levels of StAR mRNA showed no significant differences with all ECH treatments (p>0.05). TP významně nezměnil expresi CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 a HSD17. To se odráží v komplexní analýze teplotní mapy účinku ECH na expresi steroidogenních enzymů, která ukazuje, že ECH významně zvýšilo hladiny mRNA CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 a HSD17, a zejména HSD3 1/ 2 (obr. 1C).

ECH může procházet hematoencefalickou bariérou a v menší míře hematoencefalickou bariérou. K vyhodnocení androgenní zpětnovazební smyčky na HPG-ose byla v sérii PK studií hodnocena schopnost ECH vstoupit do hypotalamu. Koncentrace ECH byly detekovány v hypotalamu po 12 hodinách jednorázového perorálního podání 30mg/kg ECH a ECH vykazovala výraznou penetraci hypotalamu s průměrným poměrem hypotalamus/plazma 33,92 procent (obr. 2A). Hodnoty Te T1/2 byly 2,61±0,42 h a 1,88±0,22 h v plazmě a hypotalamu, v daném pořadí (obr. 2B). Pomocí HPLC byl však detekován velmi omezený přístup ECH do varlete. Koncentrace ECH ve varlatech byly 0.083 ug/ml, 0,043 ug/ml a 0,028 ug/ml za 0,5 h, 1 h a 1,5 h po léčbě .

ECH snižuje translokaci AR hypotalamu do jádra. Pro testování účinku ECH na translokaci AR byla exprese AR v cytoplazmě a jádru varlat a hypotalamu stanovena pomocí analýzy western blot. Jak je znázorněno na obr. 3A, ECH snížila AR protein v hypotalamických jádrech pětinásobně ve srovnání s kontrolní skupinou. Léčba enzalutamidem, inhibitorem AR, snížila hladiny proteinu AR v jádrech hypotalamu 48-krát. Je pozoruhodné, že cytoplazmatická AR byla vyšší při léčbě ECH a léčbě enzalutamidem než kontroly, což naznačuje, že ECH blokuje transport AR z cytoplazmy do jádra v hypotalamu. Jak se očekávalo, ECH neinhibuje transport AR z cytoplazmy do jádra ve varlatech (obr. 3B).

ECH zvýšila expresi genů souvisejících s HPG osou. ECH významně zvýšila exprese LH, LHR, GnRH 1 a Gnrhr ve směsných zásobách mozku a hypofýzy, avšak po léčbě TP nebyl žádný významný rozdíl v hladinách GnRH 1 . Analýza teplotní mapy ukazuje, že exprese GnRH 1 a LH byly nejvyšší mezi geny souvisejícími s HPG osou.

AR je cílem ECH. Pro potvrzení vztahů mezi ECH a AR byl úspěšně syntetizován ECH-ovalbumin (ECH-OVA) (obr. 5A, B). Molekulová hmotnost ECH-OVA je větší než OVA, takže mají různé rychlosti mobility (obr. 5A), a absorbanční pík ECH-OVA je mezi ECH a OVA (obr. 5B),

což naznačuje, že ECH byla úspěšně konjugována s OVA. Nepřímé výsledky ELISA (obr. 5C) ukazují, že anti-AR protilátka je schopna detekovat AR protein přítomný v jamkách obsahujících ECH-OVA (indikováno anti-OVA protilátkou), což naznačuje, že ECH se může vázat na AR protein. ECH se kombinuje s AR pocket of Met-894 a Val-713. Sloučenina ECH byla připojena k místu AF2 na povrchu lidského AR a teoretický vazebný režim ECH a AR byl ukázán na obr. 5D. Sloučenina ECH přijala kompaktní konformační vazbu v kapse lidského AR. Tyto dvě fenylové skupiny ECH se vážou na hydrofobní doménu AR kapsy a udržují těsné hydrofobní kontakty se zbytky Leu-712, Val-716, Met{10}}, Ile-737 , Met-894 a Ile-898, zatímco další dvě strany ECH byly umístěny u vchodu do kapsy a vytvořily pouze několik kontaktů. Podrobná analýza ukázala, že jak Met-894 (délka vazby: 2,4Å), tak Val-713 (délka vazby: 2,7Á) vytvořily vodíkové vazby s hydroxy1 skupinami ECH, což byla hlavní interakce mezi ECH a lidské AR. ECH zmírňuje reprodukční poškození vyvolané BPA. Pro zkoumání účinku ECH na reprodukční poškození byla zkoumána kvalita spermií a hladiny pohlavních hormonů a steroidogenních enzymů u myší indukovaných BPA. Jak je znázorněno na obr. 6, léčba BPA významně snížila počet spermií a pohyblivost spermií o 26,5 procenta a 39,2 procenta. Podání ECH zabránilo poklesu počtu spermií o 35,5 procenta a pohyblivosti spermií o 30,1 procenta. Podávání BPA také vedlo k významnému snížení sekrece LH a T a ECH značně zvýšilo hladiny LH a T o 24,1 procenta a 18,3 procenta, v tomto pořadí, ve srovnání s léčbou samotným BPA (obr. 6A, B). Hladiny mRNA StAR, CYP17A1, 3 -HSD a 17 -HSD při léčbě BPA-ECH byly významně zvýšeny ve srovnání s léčbou BPA (obr. 6C, D).