Část 1 Echinakosid zvyšuje množství spermií u potkanů tím, že se zaměřuje na hypotalamický androgenní receptor

Zhihui Jiang1,2, Bo Zhou2, Xinping Li2, Gordon M. Kirby3 & Xiaoying Zhang1,2

Mužská neplodnost je hlavním zdravotním problémem s odhadovanou prevalencí 4,2% mužské neplodnosti na celém světě. Naše raná práce ukázala, žeCistanche extraktychrání před poškozením spermií u myší a žeechinakosid(ECH) je jednou z hlavních aktivních složek. Zde uvádíme zásadní roli ECH, přírodního produktu, který zvrací nebo chrání před oligoasthenovou aspermií u potkanů. ECH byl testován pomocí HPLC, množství a kvalita spermií byly hodnoceny a hladiny hormonů byly stanoveny radioimunsorbentním testem. ECH snížil hladiny androgenních receptorů (AR) a klíčových genů souvisejících se steroidy, jak je stanoveno analýzou Western blot a qPCR. Interakce mezi ECH a AR byla hodnocena nepřímým ELISA a molekulárním dokováním. Výsledky ukazují, že ECH v kombinaci s hypotalamickou AR v kapse Met-894 a Val-713 inhibuje přenos AR z cytoplazmy do jader v hypotalamu. Zatímco negativní zpětná vazba regulace pohlavních hormonů byla inhibována, pozitivní zpětná vazba byla stimulována ke zvýšení sekrece luteinizačního hormonu a testosteronu následně ke zvýšení množství spermií. Celkově tyto údaje ukazují, že ECH blokuje aktivitu AR v hypotalamu, aby zvýšil množství spermií a chránil před oligoasthenospermií u potkanů.

Produkce testosteronu v testikulárních buňkách je silně regulována osou hypotalamus-hypofýza-gonadála (HPG) vytvořením homeostatické zpětnovazební smyčky1. Hormon uvolňující gonadotropin (GnRH), vylučovaný hypotalamem, může stimulovat sekreci luteinizačního hormonu (LH) z hypofýzy, což dále stimulujetestosteronprodukce ve varlatických Leydigových buňkách. Testosteron je biosyntetizován řadou steroidogenních enzymů. Jako jedna z hlavních cest může steroidogenní akutní regulační protein (StAR) transportovat cholesterol z intracelulárních zdrojů do mitochondrií2, kde je vystaven enzymu štěpení postranního řetězce cholesterolu (CYP11A1), 3β-hydroxysteroiddehydrogenáze (HSD3β), 17α-hydroxylázy (CYP17A1) a 17β-hydroxysteroiddehydrogenáze (HSD 17β), které katalyzují přeměnu cholesterolu na testosteron3,4. Testosteron se pak negativně vrací zpět do prvku HPG, aby reguluje další sekreci LH způsobem závislým na dávce. Účinek testosteronu na zpětnou vazbu osy HPG nastává vazbou na androgenní receptor (AR), který se nachází jak v hypotalamu, tak v hypofýze5. U myší způsobuje ablace AR a minimální produkce testosteronu zvýšení hladin LH a folikuly stimulujícího hormonu (FSH)6, což naznačuje, že AR se podílí na regulaci negativní krmné smyčky. Klasický genomický mechanismustestosteronsignalizace nastává, když testosteron difunduje do buňky a váže se na AR. Tento komplex ligand-receptor se pak translokuje do jádra, kde se váže na prvky androgenní odpovědi (ARE) v regulačních oblastech genů reagujících na testosteron, aby modifikoval jejich translokaci. Testosteron také indukuje neklasickou dráhu působení steroidního hormonu, charakterizovanou rychlými událostmi, které vedou k aktivaci cytosolických signalizačních kaskád normálně spouštěných růstovými faktory7,8. Klasické i neklasické testosteronové dráhy přispívají k udržení spermatogeneze a plodnosti. Funkce AR je však důležitější v klasické cestě, protože testosteron působí na zvýšení kvality spermií. Echinakosid (ECH) je jednou z bioaktivních složek odvozených z léčivých rostlinných druhů Echinacea9 aCistanche10. Se širokým spektrem farmakologických aktivit jsou extrakty Echinacea 1 Výzkumné centrum moderní biotechnologie, Škola biotechnologie a potravinářského inženýrství, Anyang Institute of Technology, Anyang, Henan, 455000, Čína. 2 College of Veterinary Medicine, Northwest A & F University, Yangling, Shaanxi, 712100, Čína. 3Department of Biomedical Sciences, Ontario Veterinary College, University of Guelph, Guelph, Ontario, N1G 2W1, Kanada. Korespondence a žádosti o materiály by měly být adresovány společnosti X.Z

Cistancheechinakosidmůže zlepšit funkci ledvin a zlepšittestosteron

Pro více informací kontaktujte:Joanna.jia@wecistanche.com

jeden z nejpopulárnějších bylinných doplňků v Evropě a USA především díky svým antioxidačním vlastnostem11 a schopnosti předcházet běžnému nachlazení12. ZajímavěCistancheextrakty a ECH se tradičně používají jako tonikum k léčbě reprodukční dysfunkce a ke zvýšení mužské sexuální aktivity v tradiční čínské medicíně10. Některé OTC produktyExtrakce Cistanchebyly vyvinuty jako výživné doplňky a získávají popularitu na trzích se zdravou výživou v Číně a některých dalších asijských zemích (China Food and Drug Administration)13. Základní mechanismy působení ECH však zůstávají nejasné. Mužská neplodnost je hlavním zdravotním problémem s odhadovanou prevalencí 4,2 % mužské neplodnosti na celém světě14. Diagnóza mužské neplodnosti je v současné době založena na studiu kvality spermií včetně analýzy semenných parametrů, jako je koncentrace spermií, pohyblivost a morfologie15. Te estrogen-mimic Bisphenol A (BPA) je rozšířený kontaminant životního prostředí, který byl studován pro svůj dopad na mužskou plodnost u několika druhů zvířat a lidí16. BPA narušuje osu hypotalamus-hypofýza-gonadální, inhibuje expresi testikulárních steroidogenních enzymů a syntézu testosteronu u samčích mláďat17, což způsobuje stav hypogonadotropního hypogonadismu18. V této studii zkoumáme účinky ECH na kvalitu spermií a hladiny hormonů. Kromě toho byl BPA vybrán jako modelový prostředek pro poranění spermií pro další studium ochranného účinku ECH proti špatné kvalitě spermií.

Cistanche deserticola má mnoho účinků, klikněte zde pro více informací

Výsledky

ECH zvyšuje množství spermií.

Počty spermií u cauda epididymis, životaschopnosti spermií a pohyblivosti spermií jsou uvedeny v tabulce 1. Léčba 80 mg/kg ECH a 15 mg/kg testosteron propionátu (TP) významně zvýšila počet spermií naverbě. Nebyl však zjištěn žádný významný rozdíl v životaschopnosti a pohyblivosti spermií.

ECH zvyšuje hladinu testosteronu a LH v séru, encefalonu + hypofýze a varlatech.

Léčba ECH výrazně zvýšila hladiny LH v séru, encefalonu + hypofýze a varlatech (obr. 1A). Ve skupině s ECH(H) se hladiny LH významně zvýšily 1,1krát v séru, 1,4krát v encefalonu + hypofýze a 1,2krát ve varlatech. Testosteron byl významně zvýšen 1,5násobně a 1,3krát v encefalonu + hypofýze a varlatech, ale ne v séru po léčbě ECH(H). Po léčbě TP byly hladiny testosteronu významně zvýšeny o 1,6, 1,8 a 1,4násobek v séru, encefalonu + hypofýze a varlatech.

Cistanche echinakosid může zlepšit funkci ledvin a zlepšit testosteron

ECH zvýšil expresi genů steroidogenních enzymů.

ECHvýznamně zvýšila expresi klíčových steroidogenních enzymů ve varlatech (obr. 1B). Hladiny mRNA CYP11A1, CYP17A1, HSD3β1/2 a HSD17β ve skupině ECH(H) byly zvýšeny více než 3krát, zatímco hladiny StAR mRNA nevykazovaly žádné významné rozdíly u všechECHošetření (s>0.05). TP významně nezměnil expresi CYP11A1, CYP17A1, HSD3β1/2 a HSD17β. To se odráží v komplexní analýze heatmapy vlivu ECH na expresi steroidogenních enzymů, která naznačuje, žeECHvýznamně zvýšené hladiny mRNA CYP11A1, CYP17A1, HSD3β1/2 a HSD17β, a zejména HSD3β1/2 (obr. 1C).

ECH může procházet hematoencefalickou bariérou a v menší míře bariérou krevních varlat.

Chcete-li vyhodnotit androgenní zpětnovazební smyčku na ose HPG, schopnostECHpro vstup do hypotalamu byl hodnocen v řadě farmakokinetických studií.ECHkoncentrace byly zjištěny v hypotalamu po 12h jednorázovém perorálním podání 30 mg/kg ECH a ECH vykazoval výraznou penetraci hypotalamu s průměrným poměrem hypotalamus/plazma 33,92 % (obr. 2A). Hodnoty Te T1/2 byly 2,61±0,42 h a 1,88±0,22 h v plazmě a hypotalamu (obr. 2B). Pomocí HPLC však byl zjištěn velmi omezený přístup ECH do varlat. Koncentrace ECH ve varlatech byly 0,083 μg/ml, 0,043 μg/ml a 0,028 μg/ml při 0,5h, 1h a 1,5h po léčbě.

ECH snižuje hypotalamickou translokaci AR do jádra.

Testování účinkuECHpři translokaci AR byla exprese AR v cytoplazmě a jádře varlat a hypotalamu stanovena pomocí analýzy western blot. Jak je znázorněno na obr. 3A, ECH down-regulovaný AR protein v hypotalamických jádrech pětinásobně ve srovnání s kontrolní skupinou. Léčba enzalutamidem, inhibitorem AR, snížila hladiny proteinu AR v hypotalamických jádrech 4,8krát. Zejména cytoplazmatická ROZŠÍŘENÁ realita byla vyšší u léčby ECH a enzalutamidem než u kontrol, což naznačuje, žeECHblokuje transport AR z cytoplazmy do jádra v hypotalamu. Jak se očekávalo, ECH neinhibuje transport AR z cytoplazmy do jádra ve varlatech (obr. 3B).

ECH zvýšil expresi genů souvisejících s osou HPG.

ECHvýznamně zvýšil exprese LHβ, LHR, GnRH 1 a Gnrhr ve směsích encefalon+hypofýza, nicméně po léčbě TP nebyl v hladinách GnRH 1 žádný významný rozdíl. Analýza heatmapy ukazuje, že výrazy GnRH 1 a LH β byly nejvyšší mezi geny příbuznými HPG osy.

AR je cílem ECH.

Pro potvrzení vztahů mezi ECH a AR byl úspěšně syntetizován ECH-Ovalbumin (ECH-OVA) (obr. 5A, B). Molekulová hmotnost ECH-OVA je větší než OVA, takže mají různé rychlosti mobility (obr. 5A) a absorpční pík ECH-OVA je mezi ECH a OVA (obr. 5B),

naznačující, že ECH byl úspěšně konjugován s OVA. Nepřímé výsledky ELISA (obr. 5C) ukazují, že protilátka proti AR je schopna detekovat protein AR přítomný v jamkách obsahujících ECH-OVA (indikovaný protilátkou anti-OVA), což naznačuje, že ECH se může vázat na ar protein.

ECH se kombinuje s AR kapsou Met-894 a Val-713.

Sloučenina ECH byla ukotvena na místě AF2 na povrchu lidské AR a teoretický vazebný režim ECH a AR byl ukázán na obr. 5D. Sloučenina ECH přijala kompaktní konformační vazbu v kapse lidské AR. Te dvě fenylové skupiny ECH se vážou na hydrofobní doméně kapsy AR a udržovaly úzké hydrofobní kontakty se zbytky Leu-712, Val-716, Met-734, Ile-737, Met-894 a Ile-898, zatímco ostatní dvě strany ECH byly umístěny u vchodu do kapsy a navázaly pouze několik kontaktů. Podrobná analýza ukázala, že jak Met-894 (délka vazby: 2,4Å), tak Val-713 (délka vazby: 2,7Å) vytvořily vodíkové vazby s hydroxy1 skupinami ECH, což byla hlavní interakce mezi ECH a lidskou AR.

Cistanche echinakosid můžezlepšit funkci jaterazvýšit testosteron

ECH zmírňuje reprodukční poškození vyvolané BPA.

Aby se prozkoumal účinek ECH na poškození reprodukce, byla u myší indukovaných BPA zkoumána kvalita spermií a hladiny pohlavních hormonů a steroidogenních enzymů. Jak je znázorněno na obr. 6, léčba BPA významně snížila počet spermií a pohyblivost spermií o 26,5 % a 39,2 %. Podávání ECH zabránilo snížení počtu spermií o 35,5 % a pohyblivosti spermií o 30,1 %. Podávání BPA také vedlo k významnému snížení sekrece LH a T a ECH významně zvýšil hladiny LH a T o 24,1 % a 18,3 % ve srovnání se samotnou léčbou BPA (obr. 6A, B). Hladiny mRNA StAR, CYP17A1, 3β-HSD a 17β-HSD v léčbě BPA-ECH byly významně zvýšeny ve srovnání s léčbou BPA (obr. 6C, D).