ČÁSTⅠ: Nové ochranné účinky extraktu Cistanche Tubulosa proti degenerativní retinopatii indukované modrým světlem s nízkou svítivostí
Mar 04, 2022
Kontakt: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com
Man-Ru Wu Cheng-Hui Lin Jau-Der Hob George Hsiao, Yu-Wen Cheng
Farmaceutická fakulta, College of Pharmacy, Taipei Medical University, Taipei, Katedra oftalmologie, Taipei Medical University, Taipei, Department of Farmakology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, Taipei, Graduate Institute of Medical Sciences, College of Medicína, Taipei Medical University, Taipei, Ph.D. Program v biotechnologickém výzkumu a vývoji, College of Pharmacy, Taipei Medical University, Taipei, Taiwan
Abstraktní
Pozadí/cíle:Fototoxicita indukovaná modrým světlem emitujícím diodové světlo (BLL) hraje důležitou roli u očních onemocnění a způsobuje retinální degeneraci a apoptózu v lidských retinálních pigmentových epiteliálních (RPE) buňkách.Extrakt z Cistanche tubulosa (CTE)je tradiční čínská medicína s mnoha prospěšnými ochrannými vlastnostmi; jen málo studií však zkoumalo oční ochranné role CTE. V této studii jsme zkoumali mechanismy, které jsou základem účinků CTE na apoptózu indukovanou BLL in vitro a in vivo. Metody: Buňky RPE byly aplikovány v aktuální studii in vitro a životaschopnost buněk byla stanovena pomocí 3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-2,{{6} }test difenyltetrazoliumbromidu. Exprese proteinu související s apoptózou byla stanovena analýzou western blot a imunofluorescenčním barvením. Ke zkoumání expozice komerčně dostupnému BLL in vivo byly použity hnědé norské krysy. Ke zkoumání morfologické deformace sítnice bylo použito barvení hematoxylinem a eosinem, značení terminální deoxynukleotidyltransferázy dUTP (TUNEL) a testy western blot. Výsledky: CTE významně inhibovalo poškození RPE indukované peroxidem vodíku, terc-butylhydroperoxidem, azidem sodným a BLL. CTE dále snížila expresi apoptotických markerů, jako je štěpená kaspáza-3 a barvení TUNEL po expozici BLL inaktivací apoptotických drah, jak ukazuje imunofluorescenční barvení. Kromě toho CTE inhiboval BLL-indukovanou fosforylaci c-Jun N-terminální kinázy, extra signálních kináz 1/2 a p38 v RPE buňkách. In vivo orální podávání CTE zachránilo 60-denní periodické snížení tloušťky sítnice vyvolané expozicí BLL a snížilo počet TUNEL-pozitivních buněk v modelu hnědého norského potkana. Závěr: CTE je potenciální profylaktikum proti fototoxicitě indukované BLL
Úvod
Studie věkem podmíněné makulární degenerace (VPMD) uvádějí, že tímto onemocněním trpí 8,7 procenta světové populace [1]. AMD je neurodegenerativní onemocnění, které způsobuje deformaci fotoreceptorů, atrofii pigmentového epitelu sítnice (RPE), apoptózu gangliových buněk a ztrátu centrálního zraku u starší populace a stává se globální sociální zátěží. AMD se dělí na suchou nebo vlhkou formu [2, 3]. Zlepšení technologie vedla k tomu, že lidé tráví více času používáním moderních digitálních zařízení, a v důsledku toho jsou lidé vystaveni emisím modrého světla (BL) po dlouhou dobu. Problematika fototoxicity vyvolané BL v sítnici však není dostatečně prozkoumána. Nadměrná expozice krátkovlnné BL (450–495 nm) má za následek tvorbu reaktivních forem kyslíku (ROS), jako jsou superoxidové a hydroxylové radikály, které způsobují zvýšení spotřeby kyslíku a indukují poškození mitochondriální DNA. Akumulace ROS má za následek oxidační stres a rozsáhlou akumulaci retinoidních aduktů, které dále poškozují sítnici [4]. Výzkum ukázal, že oxidační stres je hlavním faktorem v patogenezi suché AMD [5]. Ozáření BL navíc snižuje expresi retinálních antioxidačních enzymů, jako je superoxiddismutáza a kataláza, zprostředkováním interakcí mezi proteiny Bax/Bcl-2 a podporou endogenní produkce ROS. RPE buňky a mitochondrie vnějšího segmentu fotoreceptorů jako takové trpí poškozením vyvolaným BL ozářením [6, 7]. Kromě generování ROS aktivuje BL ozařování mitogenem aktivované proteinkinázy (MAPK), které hrají důležitou roli v buněčném přežití a apoptóze. Proapoptotické proteiny související s apoptózou závislé na mitochondriích, jako je Bax a kaspáza-3, jsou aktivovány ozářením diodovým světlem emitujícím BL (BLL) prostřednictvím c-Jun N-terminální kinázy (JNK) a p38 v RPE a gangliové buňky sítnice [8]. Kromě toho jsou součástí obranného systému RPE buněk antioxidační dráhy závislé na fosfatidylinositol 3-kináze (PI3K)/Akt a erytroidním faktoru 2-závislém na faktoru 2 (Nrf2) [{{34} }].
Extrakt z Cistanche tubulosa (CTE)obsahuje deriváty fenylethanoidových glykosidů a jako tradiční čínská medicína se používá již desítky let. Echinakosid, akteosid a isoakteosid jsou tři hlavní aktivní sloučeniny CTE, které se vyznačují neuroprotektivními vlastnostmi, vlastnostmi zlepšujícími paměť, imunoregulačními vlastnostmi a vlastnostmi proti fibróze jater [13, 14]. Echinakosid je lapač ROS a chrání před apoptózou vyvolanou 1-methyl-4-fenylpyridiniovým iontem (MPP plus ) na zvířecích modelech Parkinsonovy choroby [15, 16]. Akteosid chrání před neurotoxicitou{10}}indukovanou amyloidem a snižuje zánět stimulovaný lipopolysacharidem, který lze připsat translokaci Nrf2 z cytoplazmy do jádra a vazbě na prvky antioxidační odezvy. K inhibici nadměrné angiogeneze se používají současné dostupné terapie vlhké formy AMD, jako je pegaptanib, ranibizumab, bevacizumab a aflibercept [17, 18]. Vzhledem k četným patologickým komplikacím tohoto onemocnění však pro suchou AMD neexistuje žádná účinná léčba.
V této studii demonstrujeme ochranné účinky CTE u buněk RPE a potkanů Brown Norway (BN). Kromě toho jsme aplikovali dlouhodobou expozici BLL s nízkým jasem na modely in vitro i in vivo, abychom vyhodnotili ochranné účinky CTE. Zjistili jsme, že CTE snižuje expresi proteinů souvisejících s apoptózou po expozici BLL. Kromě toho CTE snížil počet buněk pozitivních na terminální deoxynukleotidyltransferázu dUTP pro značení konce nick end labeling (TUNEL) v sítnici BN potkanů po dlouhodobé expozici BLL s nízkou svítivostí. Tato studie poskytuje další pohled na nové antiapoptotické účinky CTE a informace týkající se nové strategie pro léčbu degenerace sítnice.
Extrakt z Cistanche tubulosa (CTE): fenylethanoidní glykosid
Materiály a metody
Chemikálie a produkty
CTE velkoryse poskytla společnost Sinphar Pharmaceutical Company (Yilan, Taiwan). Soupravy pro detekci buněčné smrti in situ (kat. č. 11-684-817-910) byly zakoupeny od společnosti Roche (Mannheim, Německo).
RPE buněčná kultura
RPE buňky (ARPE{0}} a ATCC® CRL-2302™) byly zakoupeny od American Type Culture Collection (Manassas, VA) a kultivovány v Dulbeccově modifikovaném Eagleově médiu (Gibco, Grand Island, NY) doplněné 10 procentem fetálního bovinního séra ve zvlhčené atmosféře 5 procent CO2 při 37 stupních. ARPE-19 buňky v pasáži 19–30 byly udržovány na 10-cm miskách pro buněčné kultury (Orange Scientific, Braine-l'Alleud, Belgie). Po pasážování 0,05 procenty kyseliny trypsin-ethylendiamintetraoctové (Gibco) byly buňky znovu naneseny v poměru 1:4. Před testováním byly buňky ARPE{16}} nasazeny na 48-jamkové destičky (Orange Scientific) pro analýzu životaschopnosti buněk v hustotě 1,0 × 105 buněk/ml a na misky 6-cm (Orange Scientific ) pro analýzy westernovým přenosem při hustotě 2,0 x 105 buněk/ml po dobu 24 hodin. Poté, co buňky ARPE-19 dosáhly 80% konfluence, byly provedeny následující experimenty.
Léčba léky a test životaschopnosti buněk
RPE buňky v pasáži 19–30 byly nasazeny na 48-jamkové destičky a společně ošetřeny po dobu 24 hodin různými koncentracemi CTE, peroxidu vodíku (H2O2), terc-butylhydroperoxidu (t-BHP) a azidu sodného ( NaN3). Buňky byly poté kultivovány s 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-difenyltetrazolium bromidem (MTT) v konečné koncentraci 1 mg /ml a inkubovány po dobu 30 min. Do každé jamky byl poté přidán dimethylsulfoxid (200 ul), aby se buňky rozpustily. Absorbance byla měřena při 570 nm pomocí spektrofotometru Sunrise™ spektrofotometru enzym-linked immunosorbent assay reader (MRX-TC; Dynex Technologies, Chantilly, VA). Hodnoty byly korigovány na absorbanci pozadí odečtením příslušných slepých hodnot. Data jsou z pěti nezávislých testů.
Protokol expozice BL in vitro
Světelný zdroj a destičky s buňkami byly umístěny 25 cm od sebe, jak je popsáno v naší předchozí studii [19]. Svítivost byla měřena expozimetrem (LM-81LX; Lutron Electronic Enterprise, Taipei, Taiwan). BLL dosáhl vrcholu při 460 nm (60 lux) po uvedenou dobu (0–48 h), v závislosti na experimentálním uspořádání.
Western blotting
Po 0–48-hodinovém společném ošetření s expozicí CTE a BLL byly buňky dvakrát promyty ledově studeným fosfátem pufrovaným fyziologickým roztokem (PBS) a resuspendovány v lyzačním pufru pro radioimunoprecipitační test (1 % Nonidet P-40, 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM Na3VO4, 1 mM ethylenglykol-bis (-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraoctová kyselina, 1 mM NaF a koktejl inhibitorů proteázy/fosfatázy). Buněčný lyzát byl získán centrifugací při 12, 000 x g po dobu 35 minut a supernatant byl shromážděn pro stanovení koncentrací proteinu pomocí Bradfordova činidla (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Stejná množství vzorků proteinů byla oddělena elektroforézou na 10–12 procentech dodecylsulfátu sodného a polyakrylamidového gelu a poté přenesena na polyvinylidendifluoridovou membránu. Poté, co byla membrána blokována 5% odtučněným mlékem a inkubována v Tris-pufrovaném fyziologickém roztoku s Tween 20 (TBST) po dobu 1 hodiny, bylo provedeno imunoblotování s primárními protilátkami specifickými pro štěpenou kaspázu-3, fosfo-JNK, JNK , fosfo-p38, p38, fosfo-extracelulární kináza související se signálem (ERK), ERK, Bcl-2, Bax, Fas-asociovaný protein s doménou smrti (FADD), kaspáza-8 (GeneTex, Irvine , CA), Fas-ligand (Abcam, Cambridge, UK) a b-aktin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Bloty byly poté inkubovány se sekundárními protilátkami konjugovanými s křenovou peroxidázou (1:6000 v TBST; Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Pomocí vylepšené chemiluminiscenční soupravy (Millipore, Billerica, MA) byla intenzita pruhů na každém blotu analyzována pomocí softwaru Image J po normalizaci na b-aktin.
Imunofluorescence
RPE buňky byly fixovány 4% paraformaldehydem v PBS po dobu 15 minut. Poté byl k buňkám přidán Triton X-100 v PBS (0,2 procenta) na 15 minut a následně 5% fetální hovězí sérum v PBS po dobu 30 minut; buňky pak byly inkubovány s protilátkou proti štěpené kaspáze-3 v poměru 1:250 po dobu 24 hodin (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Kozí anti-králičí IgG sekundární protilátka (Dylight 594) byla použita v poměru 1:200 (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Buněčná jádra byla obarvena 4'-6-diamidino-2-fenylindolem (DAPI; AAT Bioquest, Sunnyvale, CA). Změny fluorescence byly pozorovány pomocí laserového zobrazovacího systému konfokálního spektrálního mikroskopu CS SP5 (Leica, Teban Gardens, Singapur).
Barvení TUNEL
Fragmenty DNA, které lze detekovat testem TUNEL, jsou významným znakem apoptózy. Použili jsme In situ Cell Death Detection Kit (kat. č. 11-684-817-910; Roche) k měření apoptotické programované buněčné smrti RPE podle protokolu výrobce. Stručně řečeno, fixovali jsme RPE buňky 4% paraformaldehydem a označili zlomy DNA v enzymatické reakci, abychom detekovali TUNEL-pozitivní buňky, které vykazovaly zeleně fluorescenční skvrnu. Obarvené buňky byly poté skenovány a analyzovány pomocí Tissue FAXS-plus Imaging System (TissueGnostics, Vídeň, Rakousko). V oblasti Gated RPE bylo spočítáno deset tisíc událostí a snímky jsme analyzovali na počet buněk pozitivních na TUNEL pomocí softwaru TissueQuest/HistoQuest (TissueGnostics).
Pokusy na zvířatech
Samci potkanů BN (300–350 g tělesné hmotnosti) byli zakoupeni od National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan) a chováni po dobu 2–3 měsíců. Krysy byly udržovány v cyklu 12-h/12-h světlo/tma při 26 ± 1 stupni, relativní vlhkosti 35–47 procent a ad libitnímu přístupu k vodě a potravě. Neošetřené krysy byly udržovány ve tmě, aby sloužily jako kontroly. Protokoly studie byly schváleny Institutional Animal Care Use Committee of Taipei Medical University (číslo schválení: LAC-2016-0442). Všechny experimentální postupy zahrnující použití zvířat byly v souladu s prohlášeními Asociace pro výzkum zraku a oftalmologie pro použití zvířat v očním a zrakovém experimentálním výzkumu.
BLL-indukovaný potkaní model degenerace sítnice
Použili jsme periodický model degenerace sítnice vyvolaný dlouhodobou expozicí BLL s nízkým jasem, jak je popsáno v naší předchozí studii [19]. Ve stručnosti, BN potkani byli rozděleni do tří skupin: kontrolní skupina, která byla držena ve tmě; skupina vystavená BLL, která byla vystavena periodické BLL ve tmě bez dilatace zornice (460 nm, 150 lux) po dobu 3 hodin denně po dobu 60 dnů; a skupina léčená CTE plus vystavená BLL, která byla předem léčena CTE (100 mg/kg tělesné hmotnosti) po dobu 14 dnů a poté souběžně léčena periodickou expozicí BLL po dobu 3 hodin denně po dobu 60 dnů. Všechny krysy byly vráceny do zvířecích kolonií a na konci experimentálního období byl obnoven normální cyklus světlo/tma (250 luxů, 12 h/12 h).
Statistická analýza
Významné rozdíly byly vypočteny pomocí jednosměrné analýzy rozptylu následované Tukeyho post hoc testem a testem vícenásobného srovnání. Statistická významnost byla stanovena pomocí p-hodnot<>
Produkty Cistanche tubulosa
Výsledek
CTE chrání buňky RPE před poškozením oxidativním stresem
K vyhodnocení cytotoxicity CTE pomocí testu MTT bylo na buňky RPE aplikováno několik koncentrací CTE ({{{{20}}}}–500 ug/ml). Léčba CTE neměla žádné zjevné toxické účinky na životaschopnost buněk RPE v žádné z testovaných koncentrací (obr. 1A). Proto bylo v následujících experimentech použito 50 a 100 ug/ml CTE. Pro zkoumání antiapoptotických účinků CTE byly různé oxidační induktory (H2O2, t-BHP a NaN3) společně podávány s CTE buňkám RPE po dobu 24 hodin. H202, NaN3 a t-BHP snižovaly životaschopnost buněk a poškozovaly buňky RPE způsobem závislým na dávce (přerušené sloupce, obr. 1B, 1C a 1D); životaschopnost buněk byla významně nižší u buněk ošetřených 0,03 mM H202, 0,3 mM NaN3 a 0,3 mM t-BHP než v kontrolní skupině.
Společná léčba 50 a 100 ug/ml CTE však zeslabila poškození buněk RPE indukované H2O2-, NaN3- a t-BHP a zvrátilo snížení životaschopnosti buněk (černé sloupce, obr. 1B, 1C a 1D). Výše uvedená data naznačují, že CTE zachraňuje buňky RPE před poškozením oxidativním stresem.
CTE inhibuje BLL-indukovanou RPE buněčnou smrt
V naší předchozí studii jsme zjistili, že BLL je cytotoxický pro buňky RPE, což lze přičíst změnám v expresi Bcl-2 a Bax. V této studii jsme dále zkoumali ochranné účinky CTE na poškození buněk RPE indukované BLL. Dvě modré elektrické LED desky jsme umístili do inkubátoru pro buněčnou kulturu. Vzdálenost mezi zdrojem světla a buněčnými deskami byla 25 cm a intenzita BLL byla 60 luxů, měřeno expozimetrem (obr. 2A). Test MTT prokázal, že expozice BLL po různá časová období (6–48 h) způsobila smrt buněk RPE časově závislým způsobem (obr. 2B). Snížení životaschopnosti buněk vyvolané BLL po 24 a 48 hodinách bylo významně oslabeno, když byly buňky současně ošetřeny CTE (100 ug/ml) (obr. 2C). Tyto údaje naznačují, že CTE chrání buňky RPE před fototoxicitou vyvolanou BLL.
CTE inhibuje BLL-indukovanou apoptózu v RPE buňkách regulací Bcl-2/Bax a Fas/FasL drah
Na základě potenciálních ochranných účinků CTE v RPE buňkách jsme dále zkoumali možné zapojení CTE do tohoto procesu. Byly zkoumány dvě apoptotické signální dráhy, tj. dráhy Bax/Bcl{{0}} a Fas/Fas ligand (FasL) a příbuzné proteiny (např. pro-kaspáza-8 a pro-kaspáza -3, obr. 3A a 3B). Bylo zjištěno, že expozice BILL (6–48 hodin) zvyšuje expresi proteinů Bax/Bcl-2, FasL a FADD časově závislým způsobem (obr. 3A). Navíc BLL snížila regulaci proteinové exprese prokaspázy-3 a prokaspázy-8, což vedlo k většímu počtu štěpných forem kaspázy-3 a kaspázy-8 po expozici BLL, což je v souladu s naším předchozí studie [19]. Pro další hodnocení ochranných účinků CTE byly na buňky RPE vystavené BLL aplikovány různé koncentrace CTE (obr. 3B). Po 48-h expozici BLL snížil CTE (50 µg/ml) poměr Bax/Bcl-2. Dále CTE (100 µg/ml) snížila proteinovou expresi FasL a FADD, ale významně zvýšila hladiny prokaspázy-8 a prokaspázy-3 (obr. 3C a 3D). Studie ukázaly, že aktivace kaspázy-3 je markerem apoptózy v buňkách RPE [20]. Pro další potvrzení ochranných účinků CTE jsme provedli imunofluorescenční barvení štěpené kaspázy-3. Bylo zjištěno, že expozice BILL po dobu 48 hodin indukuje štěpení kaspázy-3 a translokaci do jádra, což vede k apoptóze buněk RPE (žluté šipky, obr. 4A). Nicméně, když byly buňky vystavené BLL společně ošetřeny CTE (100 ug/ml), BLL-indukovaná exprese štěpené kaspázy-3 byla inhibována. Abychom lépe porozuměli antiapoptotickým účinkům CTE, použili jsme barvení TUNEL k detekci fragmentů DNA v buňkách RPE. Po expozici 48-h BLL se TUNEL-pozitivní buňky zvýšily z 1,78 ± 0,36 procenta na 23,82 ± 0,33 procenta; tento účinek byl zeslaben společnou léčbou s CTE (23,82 ± 0,33 procenta až 2,22 ± 0,11 procenta; obr. 4B, 4C a 4D). Tyto výsledky naznačují, že léčba CTE silně chrání buňky RPE před apoptózou indukovanou BLL zprostředkováním drah Bax/Bcl-2 a FasL/FADD.
CTE inhibuje BLL-indukovanou fosforylaci proteinů stresové reakce v RPE buňkách
Předchozí studie prokázaly, že dráhy MAPK, jako jsou ERK, JNK a p38 MAP, jsou aktivovány v buňkách RPE a na sítnici po expozici ultrafialovému světlu nebo BL [21, 22]. Aby se tedy prozkoumaly regulační účinky CTE na dráhu stresové reakce MAPK po expozici BLL, bylo na buňky RPE aplikováno 100 ug/ml CTE v různých dobách expozice BLL (obr. 5A). Analýza Western blot ukázala, že fosforylované ERK, JNK a p38 byly aktivovány po expozici BLL, ale významně inhibovány po společné léčbě s CTE v buňkách RPE (obr. 5B). Výše uvedené výsledky naznačují, že CTE inhibuje poškození buněk RPE indukované BLL, které může být spojeno s inhibicí MAPK v buňkách RPE.
CTE zachraňuje poškození sítnice vyvolané BLL po dlouhodobé periodické expozici na krysím modelu
Abychom vyhodnotili ochranné účinky CTE, vystavili jsme potkany BN dlouhodobé expozici BLL po dobu 60 dnů a vyhodnotili jsme účinky CTE. Jak je znázorněno ve schématu uvedeném na obr. 6A, krysy BN byly rozděleny do tří skupin: kontrolní skupina, skupina vystavená BLL a skupina CTE plus BLL (obr. 6A). Ve skupině CTE plus BLL byli potkani BN kontinuálně suplementováni CTE (100 mg/kg tělesné hmotnosti) perorální sondou jednou denně po dobu 14 dnů před expozicí BLL. V den 0 byli potkani BN současně léčeni CTE (100 mg/kg tělesné hmotnosti) a vystaveni BLL po dobu 3 hodin denně po dobu 60 dnů. Po 60 dnech expozice BLL byla zvířata usmrcena pro analýzu western blot a imunohistochemické barvení. Ve skupině CTE plus BLL byla exprese proteinu prokaspázy-3 v homogenátech oka potkana vyšší po léčbě CTE než ve skupině BLL (obr. 6B a 6C). Tato data ilustrují, že CTE zabraňuje dlouhodobé nízké jasové BLL indukované retinální fototoxicitě a apoptóze inhibicí aktivace štěpené kaspázy-3. Imunohistochemické barvení poskytlo více důkazů o ochranných účincích CTE na strukturu a fyziologické dráhy sítnice (obr. 7). Dále jsme po expozici BLL zjistili, že vnitřní neuronová vrstva byla zmenšena a pozorovali jsme morfologické deformace na vnější neuronové vrstvě (ONL), včetně vnitřního segmentu/vnějšího segmentu v centrální i periferní sítnici, což je v souladu s naší předchozí studií ( Obr. 7B). Důležité je, že CTE zabránil deformaci RPE buněk, poškození neuronálních buněk a celkovému ztenčení sítnice ve skupině CTE plus BLL (obr. 7C). Dále jsme nepozorovali TUNEL-pozitivní buňky v centrální a periferní sítnici normálních potkanů (obr. 8Ab a 8Bb). Naopak po expozici BLL po dobu 60 dnů byly TUNEL-pozitivní buňky často detekovány v ONL centrální a periferní sítnice (obr. 8Ae a 8Be). DAPI barvení ONL centrální sítnice bylo výrazně sníženo ve skupině BLL (obr. 8Ad). Nicméně přítomnost TUNEL-pozitivních buněk byla oslabena a DAPI barvení centrální a periferní sítnice ONL bylo zvýšeno ve skupině CTE plus BLL (obr. 8Ai a 8Bi).
Produkty Cistanche tubulosa
