Část 5: Mapování epigenomické a transkriptomické souhry během formování paměti a vzpomínání v souboru Hippocampal Engram Ensemble
Mar 22, 2022
ali.ma@wecistanche.com
Rozšířená data Obr. 2: Stabilní DAR jsou převážně obohaceny o zesilovací značky
(a) Pracovní postup pro pitvu různých neuronálních populací z hipokampu průtokovou cytometrií běhemPaměťformování a získávání. Reprezentativní grafy FACS ukazující expresi celé populace (levý panel). Další selekce byla provedena na jednotlivých jádrech a populaci NeuN plus /DAPI plus (střední panel). Nakonec byl proveden výběr na uzavřené subpopulaci; GFP plus (upraveno na ~2,5 procenta ze všech buněk), ARC plus /GFP plus (~0,15 procent ze všech buněk) a jádra byla roztříděna do 1,5ml Eppendorfových zkumavek potažených 200 ul 1% PBS.
Klikněte naPrášek s extraktem z cistanche zlepšuje paměť
(b) Vennův diagram (vlevo) a tabulka (vpravo) ilustrují překrývání mezi DAR identifikovanými v různých párových porovnáních běhemPaměťformace a odvolání.
(c) Byla provedena statistická analýza založená na převzorkování, aby se určilo, zda jsou obohacení stavů chromatinu nad emisemi ChromHMM (pozorované) statisticky významné. Očekávané obohacení bylo vypočteno provedením 10,000 randomizovaných sad překryvů (permutací) mezi lokusy „všech přístupných míst“ a „všech míst modifikace histonů (tj. všech emisí)“ a prezentováno jako histogram v postava. Velikost vzorku každého randomizovaného souboru byla určena velikostí DAR z každého státu. Byl vypočten průměr a standardní odchylka vzorku (doplňková tabulka 3). Počet pozorovaných překryvů mezi DAR a každou emisí byl vypočten a prezentován jako čáry. z-skóre bylo vypočítáno jako poklesy; Z=(pozorované hodnoty (X) – průměr vzorku (μ))/(směrodatná odchylka vzorku (σ)). z-skóre bazální vs. rané; SE 10.5, ST 6.9. Stabilní; SE 16,9, ST 12,7, všechny p < 0,0001,="" z-skóre="" brzy="" vs.="" pozdní;="" sp="" 91,7,="" wp="" 38,7.="" pozdní="" vs.="" reaktivováno;="" sp="" 26.8,="" wp="" 28.9,="" všechny=""><0.0001. p-values="" (two-sided)="" were="" calculated="" from="" the="" z-table.="" a="" full="" analysis="" is="" reported="" in="" supplement="" table="">
(d) Koláčový graf ukazuje procento různých stavů zesilovače pro všechny stabilní oblasti. Překrytí každé stabilní oblasti bylo provedeno s dříve publikovanými daty H3K4me1 a H3K27ac ChIP-seq, získanými 1 hodinu po FS21. Stavy zesilovačů byly klasifikovány jako „primed“ – překrývající se s oblastmi označenými pouze H3K4me1, „aktivní“ – s H3K4me1/H3K27ac nebo „latentní“ – žádné překrývání.
(e) Motifs identified from nucleosome-free regions (NFR) on the ATAC-seq tracks from each state (Basal, Activated -early, Activated -late, and Reactivated). Peaks were divided into positions that were annotated to promoters (5kb from TSS) and enhancers (>5 kb od TSS). Velikost kruhu udává procento obohacení (1–50 procent). Barva označuje –log (hodnota P).
Rozšířená data Obr. 3: Koordinované priming epigenetického stavu běhemPaměťkódování a
(a) Vlastnosti interakcí detekovaných v Chicagu v každé fázi (Basal, Activated – early, Activated – late, and Reactivated). Výchozí nastavení a práh skóre 5 byly použity při volání významné interakce, prováděné společně na všech replikátech.
(b) Koláčový graf představuje procento všech interakcí detekovaných v Chicagu, které jsou ohraničeny buď H3K27ac/H3K4me1 (67,5 procenta značek zesilujících), H3K4me3/H3K9ac (46,2 procenta značek promotorů) nebo H3K27me3 (1,1 procenta represivních značek).
(c) Obraz prohlížeče WashU epigenomu, zahrnující oblast ~ 500 Kb kolem genů Eif4e2. Oblouky ukazují významné společné (červený obdélník) a jedinečné (šipky) zesilovače, které interagují s promotory (modrý obdélník).
(d) Příklady interakcí volaných Chicagem. Grafy zobrazující všechny počty přečtení z bait-other-end (enhancer), do 500–700 kb (proti proudu a po proudu) od Grink3 a Promotéři Wwc2. Významné interakce detekované Chicago (skóre větší nebo rovno 5) jsou zobrazeny červeně a podprahové interakce (3 menší nebo rovné skóre < 5)="" jsou="" zobrazeny="" modře.="" šedé="" čáry="" ukazují="" očekávané="" počty="" a="" přerušované="" čáry="" horní="" hranici="" 95procentního="" intervalu="" spolehlivosti.="" (e)="" analýza="" překrývajícího="" se="" obohacení="" mezi="" interagujícími="" zesilovači="" a="" dar="" pomocí="" permutační="" procedury="" na="" 10,000="" randomizovaných="" sadách="" přístupných="" míst.="" histogram="" představuje="" náhodné="" výběrové="" rozložení="" přístupných="" míst="" pro="" každý="" stav="" (basální="" vs.="" aktivovaný="" –="" časně,="" aktivovaný="" –="" brzký="" vs.="" aktivovaný="" –="" pozdní,="" aktivovaný="" –="" pozdní="" vs.="" reaktivovaný,="" stabilní).="" počet="" překrývajících="" se="" lokusů="" je="" uveden="" v="" barevných="" čarách="" z="" bazálních,="" aktivovaných="" -="" časných,="" aktivovaných="" -="" pozdních="" a="" reaktivovaných="" neuronů.="" dar="" bas="" vs.="" aktivované="" –="" brzy="" (z-skóre;="" 7,1,="" 7,7,="" 8,5,="" 10,9).="" dar="" aktivovaných="" –="" časně="" vs.="" aktivovaných="" –="" pozdě="" (z-skóre;="" −0,1,="" −0,8,="" −2,4,="" −3,2).="" dar="" aktivované="" -pozdní="" vs.="" reaktivované="" (0,4,="" 1,8,="" 0,4,="" -0,2).="" dar="" stabilní="" (z-skóre;="" 1,7,="" 2,0,="" 6,5,="">
Rozšířená data Obr. 4: Povolení změn chromatinu, ke kterým dochází během časné fáze
(a) Analýza překrývání mezi názvy genů z párové diferenciální analýzy a dříve publikovaných dat i) aktivovaných granulárních buněk DG 1 hodinu po nové expozici32 ii) 24 hodin po FS20 a iii) po prodloužené stimulaci (6 hodin) myší kultivované kortikální kůry neurony s KCl33. Analýza byla provedena pomocí balíčku GeneOverlap R.
(b) Exonické (červené) a intronové (modré) čtení byly kvantifikovány odděleně za všech podmínek a porovnány s transkripční aktivitou měřenou pomocí DEseq2. Hodnoty byly normalizovány (RPKM) a pro každý stav jsou uvedeny změny log2FC. houslový graf ukazuje průměr,
mezikvartilní rozsah a minimální a maximální, jednosměrná ANOVA (parametrická, nepárová), bazální vs. raná; F (5, 248)=389.9. Brzy vs. Pozdní; F (5, 2374)=2183. Pozdní vs. Reaktivováno. F (5, 1357) {{10}}.5, všechna Ps < 0.0001.="" bonferroniho="" mnohonásobné="" srovnání.="" ns="nevýznamné," ***p=""><>
(c) Poměry exon/intron byly měřeny v každém shluku za všech podmínek (škála Log2FC). houslový graf ukazuje průměr, mezikvartilové rozmezí a minimální a maximální, jednosměrná ANOVA (parametrická, nepárová), F (5, 1143)=260.2, P<0.0001. bonferroni's="" multiple="" comparisons="" test.="" n.s="non-significant," ***p="" <="">
(d) Analýza překrytí mezi DAR a DEG během různýchPaměťfáze. DAR na intergenových a intronových oblastech byly mapovány na jejich příslušné geny pomocí interakčních map pc-HiC. Analýza překryvu byla provedena pomocí balíčku GeneOverlap R. P-hodnota (čísla) a poměr šancí (barva) z Fisherova exaktního testu jsou uvedeny v teplotní mapě. ns – nevýznamné.
(e) Pearsonova korelace mezi hodnotami log2FC DAR a log2FC DEG, které byly anotovány do této oblasti (intergenní oblasti byly mapovány prostřednictvím datové sady pc-HiC). Změny v dostupnosti chromatinu byly porovnány s analyzovanými exonickými čteními (červená čára), intronovými čteními (modré čáry) a celkovými transkripčními změnami (jak intronové, tak exonické čtení), jak bylo měřeno pomocí Desq2 (šedá čára). Všechny hodnoty r a p jsou uvedeny v doplňkové tabulce 9.
Rozšířená data Obr. 5: Transkripční změny v aktivovaných-pozdních neuronech korelovaly výše
(a) Exonické (červené) a intronové (modré) čtení byly kvantifikovány odděleně za všech podmínek pro každý ze shluků identifikovaných na obr. 5B. Čtení byla normalizována (RPKM) a změny log2FC jsou uvedeny pro každý cluster.
(b) Poměry exon/intron byly měřeny v každém shluku za všech podmínek. Houslový graf ukazuje průměr, mezikvartilní rozsah a minimum a maximum, n=3 biologicky nezávislých vzorků jednosměrná ANOVA (parametrická, nepárová), Dw – pozdní shluk; F (3, 968)
652) = 93.97, P<0.0001. reactivation="" -cluster;="" f="" (3,="" 1600)="485.2,"><0.0001. bonferroni's="" multiple="" comparisons="" test="" to="" deseq2="" reads.="" ***p="" <="">
Rozšířené Data Obr. 6: Odlišný dočasně transkripční programy jsou bytost synchronizované na
závislým způsobem v přítomnosti tamoxifenu. V pravém panelu reprezentativní IHC snímky DG. Zelená – AAV-eYFP, Červená – endogenní Arc. Stupnice měřítka představuje 50 μm.
(b) Hodnocení morfologie trnů během různýchPaměťfáze. Pravý panel zobrazuje jeden eYFP plus dendritický dřík s různými typy trnů (stubby, tenký, houbový, zvětšený hřib). Stupnice měřítka představuje 5 μm. boxplot ukazuje průměr, mezikvartilové rozmezí a minimum a maximum, Aktivováno - brzy: n=4 myší /5 sekcí na zvíře, Aktivováno -pozdně: n=4 myší /4 sekce na zvíře, Reaktivováno: n=4 myší /2 sekce na zvíře. jednosměrná ANOVA (parametrická, nepárová), Stubby; F (2, 36)=2.313, P=0.1135. Tenký; F (2, 36)=35.12, P<0.0001. mushroom;="" f="" (2,="" 36)="38.42," p="" <="" 0.0001.="" bonferroni's="" multiple="" comparisons="" test,="" ***p="" <="">
(c) Reprezentativní obrazy IHC a kvantifikace hladin proteinu dvou členů rodiny EIF; (vlevo) Eif2a a (vpravo) Eif3e. Měřítko představuje 10 μm. Data pro dendritický dřík jsou prezentována jako poměr mezi počtem a délkou (μM). n=4 myší /5 řezů na zvíře, box graf ukazuje průměr, mezikvartilní rozsah a minimální a maximální, jednosměrnou ANOVA (parametrickou, nepárovou) s Bonferroniho testem vícenásobného srovnání, ns - nevýznamné, Eif2a Shaft; F (2, 20)=4.484, P=0.0246. Soma; F (2, 21)=19,58, P < 0,0001.="" (aktivováno="" -brzy="" vs.="" aktivováno="" -pozdně="" *p="0.0142," aktivováno="" -předčasně="" vs.="" reaktivováno="" *p="">< 0,0001,="" aktivováno="" -pozdně="" vs.="" reaktivováno="" *p="0.0303)." hřídel="" eif3e;="" f="" (2,="" 14)="1,983," p="0,1745." soma;="" f="" (2,="" 23)="8.309," p="0.0019," (aktivováno="" -předčasně="" vs.="" reaktivováno="" *p="0.0057," aktivováno="" -pozdně="" vs.="" reaktivováno="" *p="" {{="">
(d) Koláčový graf představuje procento zvětšených hřibových trnů (Dh větší nebo rovno 3Dn) a hřibových trnů z aktivovaných -pozdních a reaktivovaných neuronů.
(e) Reprezentativní snímky (levý panel) a kvantifikace (pravý panel) hladin Gria1 mRNA během různých fázíPaměť. Data jsou prezentována jako poměr mezi několika body a délkou dendritického dříku. Stupnice měřítka představuje 10 μm. N=4 myší /5 řezů na zvíře, box graf ukazuje průměr, mezikvartilní rozsah a minimum a maximum, Shaft; jednosměrná ANOVA (parametrická, nepárová) F (2, 15)=10.41, P=0.0015. Bonferroniho vícenásobný srovnávací test, **P=0.0011. spodní panel - Soma; jednosměrná ANOVA F (2, 12)=0.13, P=0.88.
Rozšířená data Obr. 7: Interakce s odlišnými kombinatorickými zesilovači vede ke směrovému
(a) Vennovy diagramy ukazují procento překrytí mezi dostupností chromatinu (DAR) napříč všemiPaměťfáze (BAS vs. Aktivovaný -časný, světle zelený kruh mřížky; Aktivovaný -časný vs. Aktivovaný -pozdní, tmavě zelený kruh mřížky; Aktivovaný -pozdní vs. Reaktivovaný, oranžový kruh mřížky) a celkové transkripční změny ze všech identifikovaných shluků (Dw – pozdě, Nahoru – pozdě, Stabilní, Reaktivace, modrý kruh mřížky). Intergenní a intronové DAR byly mapovány na jejich příslušné geny pomocí interakčních map pc-HiC. Procento překrytí bylo vypočteno ze všech identifikovaných stupňů ve shlucích (n=1095).
(b) Analýza překrytí mezi DAR (párově) a DEG z každého shluku. Intergenní a intronové DAR byly mapovány na jejich příslušné geny pomocí interakčních map pc-HiC.
Analýza překryvu byla provedena pomocí balíčku GeneOverlap R. P-hodnoty a Jaccard hodnoty (barva) z Fisherova exaktního testu jsou uvedeny na teplotní mapě (vlevo). Procento překrytí bylo vypočteno ze všech identifikovaných stupňů ve shlucích (vpravo).
(c) Reprezentativní obraz chromatinu a transkripčních změn lokusu Gabrb3 z Dw-late clusteru. Zatímco interakce raného stavu byly mezi promotorem a enhancery s aktivátory transkripce (Ap1), interakce pozdního stavu byly s represory transkripce (Slug). Horní stopy prohlížeče genomu IGV (fialová - bazální, světle zelená - aktivovaná - časně, tmavě zelená - aktivovaná - pozdní a oranžová - reaktivovaná) vykazují transkripční změny (ncRNA-seq), střední stopy ukazují dynamiku dostupnosti chromatinu (ATAC-seq) na promotor (červený obdélník) a zesilovače (šedý obdélník). Významné interakce mezi promotorem a zesilovačem jsou znázorněny jako oblouky (prohlížeč WashU). Spodní stopa představuje motivy, které byly identifikovány pomocí nástrojů HOMER (Slug, Ap1 a Rest).
(d) Agregační grafy pro jednotlivé motivy. Hodnoty obohacení (motivy na bp/ na pík) šesti vybraných motivů (dva represory, dva aktivátory a dva bivalentní) byly hodnoceny kolem středu píku (-/ plus 4000 bp) z každého klastru.
Rozšířená data Obr. 8: Navrhovaný model dostupnosti chromatinu, interakce promotor-enhancer a dynamiky transkripce hipokampálních paměťových engram neuronů
oblasti, které nesou motivy transkripčních aktivátorů. Toto přeprogramování promotoru a zesilovače vede ke zvýšené genové expresi, která pravděpodobně umožňuje stabilizaciPaměť. Recall - reaktivované engramové neurony využívaly podmnožinu primovaných interakcí promotor-enhancer, což je spojeno s transkripčními změnami zapojenými do transportu mRNA do synaptických kompartmentů a translace proteinů. Transkripční faktor – TF, E(1–3) – různé enhancery, které interagují se stejným promotorem, Červená – transkripční represory, Modrá – transkripční aktivátory.
Doplňkový materiál
Doplňkový materiál naleznete ve webové verzi na PubMed Central.
Poděkování
Děkujeme E. Niederst, J. Penney, S. Barker, RT Stott, M. Victor, A. Watson, N. Dedic, E. Lockshin a členům L.HT Lab za užitečnou diskuzi a návrhy. Děkujeme vedoucím laboratoře Y. Zhou, E. McNamara za údržbu kolonií myší. Děkujeme P. Autissierovi (Whitehead Institute) za pomoc s FACS. Financování: Tyto práce byly podpořeny granty NIH RF1AG062377, AF1AG054012, RO1NS102730, RF1AG064321, The JPB Foundation, The Alana Down Syndrome Research Foundation, The LuMind Down Syndrome Research Foundation, Cure Alzheimer's Fund CIRCUITS a E Robertne and Consortium, CIRCUITS Belfer Family Foundation LH.T. Tato práce byla také částečně podporována granty NIH R01AG058002, U01NS110453, R01AG062335, UG3NS115064 pro MK a LH.T a R01AG067151, R01MH109978, U09, R044Associace pro Alzheimer's podporovaná U09, R0KV5{09, R0KV5 grantem R02HAR0KV0{095{0KV5{0KV5{0KV5{0KVAR0 . HSM podporuje Burroughs Wellcome Fund a postdoktorandské stipendium UNCF-Merck. C. A je podporována Nadací JPB. RMR je podporováno grantem NIH T32 5T32HD09806. Sada pro přípravu knihoven Hi-C byla přijata jako štědrý dárek od společnosti DovetailTM (v.1.03, Dovetail Genomics, Chicago, USA). Děkujeme týmu Dovetail za užitečnou diskuzi a návrhy.
