Část 3: Odtok hořčíku z buněk Drosophila Kenyon je kritický pro normální a dietou vylepšenou dlouhodobou paměť

další informace:ali.ma@wecistanche.com

Pls klikněte sem pro část 2

Klikněte naVýhody a vedlejší účinky Cistanche pro paměť

byl omezen na dospělé mouchy, což naznačuje, že UEX má trvalejší roli v neuronální fyziologii. Naproti tomu snížení exprese uex v abs nebo a{{0}}b0 neuronech nenarušilo LTM. Aktivita neuronů a0b0 je nutná po tréninku ke konsolidaci apetitivního LTM (Krashes a Waddell, 2008), zatímco výstup abc a abs KC, společně i odděleně, je nezbytný pro jeho expresi (Krashes a Waddell, 2008; Perisse et al., 2013). Proto pozorování normálního výkonu LTM u much se ztrátou funkce uex v neuronech abs a a0b0 argumentuje proti obecnému nedostatku funkce neuronů ab při manipulaci s uex.

Dietní Mg2 plus nemohlo zvýšit defektní LTM výkon much, které byly konstitutivně uex mutanty nebo byly ukryty ab KC omezenou ztrátou funkce uex. Nicméně exprese uex v ab KC mušek mutantů uex obnovila schopnost Mg2 plus zvýšit výkon. Proto jsou ab KC buněčným lokusem pro Mg2 plus-enhancedPaměťv letu.

Možná se zdá neintuitivní, že pro podporu KC je vyžadován odtok hořčíku řízený UEXPaměť-zesilující účinky Mg2 plus krmení, když dietní Mg2 plus zvyšuje KC [Mg2 plus ]i. V této fázi můžeme jen spekulovat, proč tomu tak je. Předpokládáme, že zejména mozek a ab KC se musí vyváženým způsobem adaptovat na vyšší hladiny intracelulárního a extracelulárního Mg2 plus, které jsou výsledkem doplňování stravy. Naše živé zobrazování KC [Mg2 plus ]i v mozcích divokého typu a uex mutantů naznačuje, že eflux řízený UEX je pravděpodobně základním faktorem v aktivním a možná stimulem vyvolaném homeostatickém udržování těchto zvýšených hladin.

Řada savčích buněčných typů vytlačuje Mg2 plus způsobem závislým na cAMP, několik minut po vystavení b-adrenergní stimulaci (Romani a Scarpa, 2000; Vormann a Gunther, 1987; Jakob a kol., 1989; Romové a Scarpa, 1990b; Romové a Scarpa, 1990a; Vormann a Gunther, 1987; Gunther a kol., 1990; Howarth a kol., 1994). Přítomnost domény CNBH naznačuje, že UEX a CNNM by mohly být přímo regulovány cAMP. Testovali jsme důležitost CNBH zavedením substituce aminokyseliny R622K, která by měla blokovat vazbu cAMP v UEX CNBH. Tato jemná mutace zrušila schopnost transgenu uexR622K obnovit výkon LTM u mušek mutantů uex. Také jsme použili CRISPR k mutaci CNBH v nativním lokusu uex. Ačkoli odstranění CNBH z CNNM4 zrušilo Mg2 plus efluxní aktivitu (Chen et al., 2018), mouchy homozygotní pro lézi uexT626NRR byly životaschopné, což dokazuje, že si zachovávají dostatečnou úroveň funkce UEX. Tyto mouchy však vykazovaly okamžité a dlouhodobé zhoršeníPaměť. Navíc výkonnost mušek uexT626NRR nebylo možné zvýšit krmením Mg2 plus. Tyto údaje ukazují, že intaktní CNBH je kritickým prvkemPaměť-příslušná funkce UEX. Vazba klatrinových adaptorových proteinů na CNNM4 CNBH byla zapojena do bazolaterálního cílení (Hirata et al., 2014), což naznačuje, že UEXT626NRR může být nevhodně lokalizován v KC. Dále KC exprese mutantní varianty CNNM2 E122K, která si zachovává reziduální funkci

ale má poruchu obchodování (Arjona et al., 2014), neobnovil defekt uex LTM.

Ačkoli bylo zpochybněno, zda domény CNNM2/3 CNBH vážou cyklické nukleotidy (Chen et al., 2018), zjistili jsme, že FSK vyvolalo zvýšení ab KC [Mg2 plus ]i, které bylo citlivé na mutaci uex, a že UEX: :HA byla chybně lokalizována v rut2080 adenylátcykláze (Han et al., 1992) a dnc1 fosfodiesteráze (Dudai et al., 1976), které se učí defektní mutantní mouchy. Zatímco značka UEX::HA byla rovnoměrně distribuována v g, abc a abs KC u much divokého typu, značka UEX::HA byla snížena v g a abs KC a byla silnější v abc neuronech u rut2080 a dnc1 mutantů. Chronické manipulace s cAMP v mutantech jsou proto v souladu s tím, že cAMP ovlivňuje lokalizaci UEX, možná interakcí s CNBH. Kromě toho může změněná lokalizace UEX přispět kPaměťzávady mušek rut2080 a dnc1.

Naše fyziologická data využívající hořčíkovou zeleň v savčí buněčné kultuře a geneticky kódovaný reportér MagIC v ab KCs ukazují, že fly UEX usnadňuje odtok Mg2 plus. Stimulace mozku mouchy pomocí FSK vyvolala větší zvýšení ab KC [Mg2 plus ]i v mozcích mutantů uex než u kontrol divokého typu, což poskytuje první důkaz, že UEX omezuje nárůst [Mg2 plus ]i u Drosophila KCs. Naše záznamy MagIC také odhalily pomalou oscilaci (se středem kolem 0,015 Hz, přibližně jednou za minutu) ab KC [Mg2 plus ]i, která byla závislá na UEX. Dosud nerozumíme fyziologické funkci této fluktuace [Mg2 plus ]i, i když pravděpodobně odráží vlastnost buněk na úrovni homeostatických systémů. Biochemická oscilační aktivita hraje klíčovou roli v mnoha aspektech buněčné fyziologie (Nova´k a Tyson, 2008). Nejpozoruhodnější je, že cirkadiánní časovaná fluktuace [Mg2 plus]i spojuje dynamický buněčný energetický metabolismus s hodinově řízenou translací prostřednictvím Mg2 plus senzitivní dráhy mTOR (mechanistický cíl rapamycinu) (Feeney et al., 2016). Je proto možné, že pomalé Mg2 plus oscilace by mohly sjednotit role pro cAMP, UEX, energetický tok (Plac¸ais et al., 2017) a mTOR-dependentní translaci, která je základem LTM-relevantní synaptické plasticity (Casadio et al., 1999 Huber a kol., 2000; Beaumont a kol., 2001; Hou a Klann, 2004; Hoeffer a kol., 2008).

Kontakt pro sdílení činidel a zdrojů

Úplný seznam činidel si můžete prohlédnout v tabulce klíčových zdrojů.

Další informace a požadavky na zdroje a činidla by měly být směrovány na hlavní kontaktní osobu, Scott Waddell (scott.waddell@cncb.ox.ac.uk), která bude vyřízena.

Experimentální model a detaily předmětu

Muchové kmeny

Pokud není uvedeno jinak, mouchy byly chovány na standardním krmivu z kukuřičné mouky v 12hodinovém cyklu světlo-tma při 60% vlhkosti a 25˚C. Testovací a kontrolní mouchy pro experimenty GAL80ts byly chovány při 18 °C. V experimentech byly použity mušky smíšeného pohlaví staré 1–7-dny.

Canton-S byl kmen divokého typu. Řídicí linie GAL4 použité v této studii jsou c739-GAL4 (McGuire et al., 2001), c305a-GAL4 (Krashes et al., 2007), NP7175-GAL4 (Tanaka et al., 2004), 0770-GAL4 (Gohl a kol., 2011), MB247-GAL4 (Zars a kol., 2000), nSyb-GAL4 (Bloomington Drosophila Stock Centre, BDSC 51635), elav-GAL4 (BDSC, 8765) a uex-GAL4 (Kvon et al., 2014); Vienna Drosophila Resource Center, VDRC, VT23256-GAL4). UAS linie získané ze skladového centra jsou UAS-CD8::GFP (BDSC, 5136), UAS-NmdarRNAi (BDSC, 25941) a UAS-uexRNAi (BDSC, 36116). Jsou popsány různé mutantní a transgenní linie, uexMI01943 (Venken et al., 2011; BDSC, 32805), uexNC1 (BDSC, 7167), rut2080 (Han et al., 1992) a dnc1 (Dudai et al.), 1976 , tubP-GAL80ts (McGuire et al., 2003) a PhsILMiT (BDSC, 24613). Excizní linie uexMI01943.ex1 a uexMI01943.ex2 Minos byly vytvořeny pomocí postupu popsaného v Arc et al., 1997. Podrobné schéma párování je znázorněno na obrázku 2 – příloha k obrázku 2A. Potenciální excizní linie byly vytvořeny z jednotlivých much vykazujících fenotyp žluté barvy těla. Genomová DNA byla extrahována ze šesti takových linií a DNA lemující uexMI01943 MiMIC byla amplifikována pomocí PCR a sekvenována. Linie uexMI01943.ex1 a uexMI01943.ex2 byly identifikovány tak, aby obsahovaly přesné excize a obnovily genomickou sekvenci divokého typu. Viz tabulka zdrojů pro PCR a sekvence primerů pro sekvenování. Schéma detailu sekvence inzerce uexMI01943 MiMIC a v excizích je znázorněno na obrázku 2 – příloha k obrázku 2B. Pro konstrukci transgenních much UAS-uex byla pomocí RT-PCR klonována kódující sekvence uex v plné délce (CDS). Celková RNA byla izolována z much divokého typu pomocí TRIZOL (Thermo Fisher, 15596018) a reverzně transkribována do cDNA pomocí systému syntézy prvního vlákna SuperScript III (Invitrogen, 18080400). Tato celková směs cDNA byla použita jako templát pro amplifikaci uex CDS. Sekvence primerů viz Tabulka zdrojů. Produkt PCR byl štěpen SacII a Xhol a poté ligován do komplementárních míst pUAST (Brand a Perrimon, 1993). PUAST klonovaný uex CDS byl plně sekvenován a ověřen, že představuje 2505 bp čtecího rámce cDNA uex divokého typu (povšimněte si, že všechny čtyři možné izoformy uex mRNA, FlyBase Release 6, kódují stejný protein o 834 aminokyselinách). Transgenní mouchy UAS-uex byly vytvořeny komerčně (Bestgene) transformací vektorem pUAST-uex. Mapovali jsme inzerci UAS-uex chromozomu 10 nezávislých transgenních linií a behaviorálně testovali tři linie, označené UAS-uex3M, UAS-uex5M a UAS-uex8M, s insertem na třetím chromozomu. Mouchy UAS-uex3M byly ty, které se používaly v průběhu studie a v rukopise se označovaly jako UAS-uex.

Transgenní mouchy UAS-uexR622K byly vytvořeny podobně jako mouchy UAS-uex. Missense mutace byla zavedena v kodonu 622 UEX v doméně CNBH, napodobující mutaci dříve vytvořenou v cAMP-vazebné doméně regulační podjednotky proteinkinázy A (Bubis et al., 1988). Mutace mění CGT kodon kódující Arg na AAA kódující Lys. Mutace byla zavedena do divokého typu uex CDS pomocí Gibson Assembly Master Mix (New England Biolabs, E2621S), jak je popsáno v 'Vylepšené metody pro místně cílenou mutagenezi pomocí Gibson Assembly Master Mix' (NEB Application Note). Použité sady primerů jsou podrobně uvedeny v tabulce zdrojů. Produkt Gibsonova sestavení byl dále amplifikován pomocí PCR a výsledný produkt byl klonován do vektoru pUAST a sekvenován. Transgenní inzerce byly mapovány jako pro UAS-uex a jedna ze dvou inzercí mapovaná na třetím chromozomu byla použita v experimentech chování.

Transgenní linie much UAS-CNNM2, UAS-CNNM2E122K, UAS-CNNM2E357K, UAS-CNNM2S269W a UAS-CNNM2T568I byly vytvořeny transformací pomocí konstruktů pUAST obsahujících divoký typ nebo bodově mutované verze myší CNNM2 cDNA označené 2 HA (mCNNM2: HA), popsané v Arjona et al., 2014. Divoký typ nebo mutované verze CNNM2 byly amplifikovány z původních klonů mCNNM2::HA v pCiNEO_IRES_GFP plasmidech (Arjona et al., 2014). Primery jsou podrobně uvedeny v tabulce zdrojů. Produkty PCR byly štěpeny Xhol a Xbal a ligovány do komplementárních míst v pUAST. Inzerce každého konstruktu na třetím chromozomu byly identifikovány mapováním, jak je popsáno výše, a byly použity v experimentech chování. Všimněte si, že všechny konstrukty kódující CNNM2 použité ve studii jsou HA-značené, i když je zápis často pro stručnost vynechán.

UAS-MagFRET-1 transgenní linie much byly vytvořeny transformací pomocí pJFRC-MUH konstruktů obsahujících MagFRET-1 CDS, který byl subklonován z plazmidu pCMVMagFRET-1, popsaného v Lindenburg et al. , 2013. Primery jsou podrobně uvedeny v tabulce zdrojů. Produkty PCR byly štěpeny Xhol a Xbal a ligovány do komplementárních míst v pJFRC-MUH. Inzerce konstruktu byla zprostředkována místně specifickým systémem transgeneze a místo přistání je attP2 (na třetím chromozomu).

UAS-MagIC a UAS-MARIO transgenní muší linie byly vytvořeny transformací pTW konstrukty obsahujícími MagIC/MARIO CDS, které byly subklonovány z plazmidů MagIC/pcDNA3 a MARIO/pcDNA3, laskavě poskytnutých T. Nagai: (Maeshima et al., 2018 a Koldenkova et al., 2015). MagIC/MARIO CDS byly nejprve PCR amplifikovány z MARIO/pcDNA3 a MagIC/pcDNA3 v daném pořadí a byly klonovány do vektoru pENTR/D-TOPO. Primery jsou podrobně uvedeny v tabulce zdrojů. Všimněte si, že MARIO sense primer byl navržen tak, aby se překrýval se sekvencí pcDNA3 v místě inzerce MARIO. MagIC/MARIO CDS byly dále klonovány do Gateway cílového vektoru pTW (Drosophila Gateway Vector Collection).

UexD lokus upravený CRISPR/Cas9 byl komerčně vygenerován GenetiVision. Schéma úprav je znázorněno na obrázku 2 – příloha obrázku 2C. Lokus uex sedí v obrácené orientaci na chromozomu 2R a pokrývá oblast 49 141 bp mezi pozicí 3 900 285 a 3 949 425 (FlyBase, vydání 6). Následující popis se týká těchto souřadnic v lokusu uex. Pro vytvoření uexD byly zkonstruovány dva plazmidy gRNA a jeden plazmid donoru dvouvláknové DNA (dsDNA) a injikovány do embryí nos-Cas9 (BDSC, 54591). Jak je znázorněno na obrázku 2 – doplněk k obrázku 2C a podrobně popsáno v tabulce zdrojů, upstream gRNA1 leží v exonu 6 a cílí na sekvenci 30 930 30 952. Odpovídající downstream gRNA2 leží mezi Exonem 7 a Exonem 8 mezi 33,988 a 34,010. Obě gRNA byly jednotlivě klonovány do pCFD3-dU63gRNA (Addgene, 49410). Místo řezu gRNA1 by mělo být mezi 30 946 a 30 947, zatímco gRNA2 by mělo vést k řezu mezi 33 993 a 33 994. 795 bp upstream homologní rameno (30,152,30,946) a 977 bp downstream homologní rameno (33,994,34,970) byly klonovány do donorového DNA plazmidu. Terminační kodon (STOP, ve všech třech čtecích rámcích) byl vložen mezi dvě homologní ramena a následovala GFP kazeta řízená promotorem 3xP3. Páteř DNA dárce byla navržena společností GenetiVision a kompletní sekvence dárce pro linii uexD je k dispozici na vyžádání. Úspěšná editace byla identifikována expresí GFP v očích much a potvrzena genomickou PCR a sekvenováním. U mušek uexD byl fragment o velikosti 3047 bp od 30 947 do 33 993 nahrazen sekvencí mezi dvěma rameny homologie v donorovém plazmidu, hlavně signálem STOP a kazetou GFP. Alela uexD zkracuje uex ORF. Primery použité pro ověření genomové PCR jsou podrobně uvedeny v tabulce zdrojů. Transgen nos-Cas9 (na chromozomu X) byl odstraněn křížením.

Uex::HA mušky upravené CRISPR/Cas{0}}vygenerovala WellGenetics pomocí systému ScarlessDsRed vyvinutého laboratoří Kate O'Connor-Giles (nepublikováno, původní plazmid darovaný společnosti Addgene, #80822). Značka 6XHA byla fúzována v rámci ke karboxy-konci UEX vložením sekvence kódující 6XHA bezprostředně před nativní STOP kodon v lokusu uex (obrázek 3 – obrázek doplněk 1A). Proces zahrnoval dva hlavní kroky. V kroku 1 byla značka 6XHA spolu s transposonem pBAC obsahujícím kazetu DsRed vložena do rámce se STOP kodonem uex pomocí úpravy genomu zprostředkované CRISPR/Cas{11}} pomocí homologie řízené opravy (HDR) s použitím 1 gRNA a jeden donor plazmidu dsDNA. gRNA leží 50 bp od uex STOP kodonu a měla by řídit řez mezi 48 587 a 48 588. gRNA byla klonována do plazmidu pCFD3-dU63gRNA. 1200 bp upstream rameno (47,438,48,637) a 1,033 bp downstream rameno (48,641,49,673) byly klonovány do donorového DNA plazmidu s pUC57-}Kan (2579 bp) páteří. Viz tabulka zdrojů pro gRNA a sekvence primerů. Protospacer Adjacent Motif (PAM) mutace (TCC na TCG, 48,581,48,583) byla zavedena do dárce pro podporu HDR. Mezi dvě homologní ramena byla vložena značka 6XHA následovaná transposonem pBAC obsahujícím kazetu DsRed řízenou promotorem 3XP3. Rozpoznávací motiv pBAC TTAA je zabudován do STOP kodonu 6XHA. Kompletní sekvence dárců je k dispozici na vyžádání. Donorové a gRNA plazmidy byly injikovány do embryí nos-Cas9 (NIG-FLY, CAS0002). Úspěšná editace byla identifikována expresí DsRed v očích much a potvrzena genomickou PCR a sekvenováním. Bylo identifikováno šest nezávislých pozitivních linií a čtyři prošly validací PCR. Jedna z těchto čtyř linií dále prošla validací sekvenování a je střední linií znázorněnou na obrázku 3 – dodatek k obrázku 1A. Z této linie byly založeny čtyři izogenizované a vyvážené zásoby. V kroku 2 byl selekční marker DsRed vyříznut transpozicí PiggyBac (PBac) s pomocnou linií Tub-PBac (BDSC, 8285). Pět homozygotních životaschopných linií s úspěšnou excizí bylo validováno genomickou PCR a sekvenováním. Jeden označený uex::HA byl použit v experimentech v rukopisu.

Ke konstrukci mušek uexT626NRR upravených CRISPR/Cas{{0}}} jsme navrhli a naklonovali gRNA a navrhli a objednali (Sigma) jednovláknový oligo-deoxynukleotid (ssODN). Sekvence gRNA a ssODN jsou podrobně uvedeny v tabulce zdrojů. Protože jsme plánovali provést substituci jedné aminokyseliny R622K v doméně UEX CNBH, 120 bp ssODN donor byl centrován na kodon R622 a nese změnu kodonu CGT na AAA (na 31 179,31 181) odpovídající R622K. Očekávané místo řezu gRNA (mezi 31 192 a 31 193) je vzdáleno pouze 11 bp od očekávaného bodu mutace. Abychom zvýšili pravděpodobnost HDR, která je při použití ssODN jako dárce údajně nízká, komerčně (GenetiVision) jsme injektovali editační materiál do 250 embryí lig4 KO vasa-Cas (Zimmer et al., 2016). Z injikovaných embryí jsme získali 37 životaschopných much G0. Celkem 224 much G1 bylo podrobeno genomové PCR a sekvenování jedné mušky pro screening očekávané mutace. Primery podrobně popsané v tabulce zdrojů. Identifikovali jsme 59 domnělých upravených linií z prvního kola screeningu a z nich 12 bylo potvrzeno. Navzdory použití lig4 KO vasa-Cas9 jsme místo bodových mutací zprostředkovaných HDR detekovali pouze události nehomologického spojování konců (NHEJ). Z 12 upravených linií bylo šest homozygotně letálních a dalších šest bylo životaschopných. Ve čtyřech z homozygotních životaschopných linií jsme našli náhradu G za T v pozici 31,192 spolu s 6 bp in-frame inzercí ATCTTC mezi 31,192 a 31,193. Tato úprava NHEJ odpovídá T626! Změna NRR v proteinové sekvenci UEX (obrázek 5A). Chromozom X vasa-Cas9 byl z těchto linií odstraněn křížením a jedna linie označovaná jako uexT626NRR byla použita v experimentech s chováním v rukopisu.

Podrobnosti metody

Behaviorální experimenty

Pro behaviorální experimenty v T-bludišti byly použity 1–7-denní mušky smíšeného pohlaví. Pachy byly 4-methylcyklohexanol (MCH) a 3-oktanol (OCT), zředěné ~1:103 (konkrétně 9 ml MCH nebo 7 ml OCT v 8 ml minerálního oleje). Všechny experimenty byly prováděny při 23 °C a 55–65 procentech relativní vlhkosti.

Chuť hned i pozdějiPaměťexperimenty byly provedeny v podstatě tak, jak je popsáno (Krashes a Waddell, 2008; Perisse et al., 2013). Dávky 100–120 much byly před tréninkem vyhladověny po dobu 21–23 hodin v 35ml lahvičkách s hladověním obsahujícím ~2 ml 1% agaru (jako zdroj vody) a 2 cm 4 cm filtrační papír. Cukrové papíry (5 cm 7,5 cm) pro trénink byly připraveny namočením 4 ml 2 M sacharózy a sušením přes noc. Vodní papíry stejné velikosti byly napuštěny vodou a ponechány přes noc. Pro apetitivní trénink byly mouchy přeneseny z hladovějící trubice do tréninkové trubice se suchým „vodním“ papírem a okamžitě připojeny k tréninkovému rameni T-bludiště a vystaveny pachu CS po dobu 2 minut, poté následovalo 30 s čistý vzduch. Mouchy byly poté přeneseny do jiné tréninkové zkumavky se suchým cukrovým papírem, připevněny k T-bludišti a vystaveny CS plus vůni po dobu 2 minut. BezprostředníPaměťbyl testován přepravou much do bodu T-volby a ponecháním jim 2 minuty na výběr mezi dvěma proudy pachu. K testování 24 hodinPaměťmouchy byly vyjmuty z cvičné zkumavky a přeneseny do standardních lahviček s kukuřičnou moukou na 1 hodinu, poté přeneseny zpět do hladovějících lahviček na 23 hodin do testování. Výkonnostní index byl vypočten jako počet mušek v CS plus rameno mínus počet v CS rameni, děleno celkovým počtem mušek. MCH a OCT byly střídavě použity jako CS plus nebo CS a jeden vzorek, neboli n, představuje průměrný výkonnostní index ze dvou recipročně trénovaných skupin.

Pro testy chování po krmení Mg2 plus byly 1–{2}}denní mouchy umístěny v lahvičkách s Mg2 plus doplněným krmivem po dobu 1–5 dnů, než byly vyhladověny kvůli apetitnímu tréninku a testování, jak je popsáno výše. K výrobě 80 mM [Mg2 plus ] potravy bylo 40 ml 1 M roztoku MgCl2 přidáno do 460 ml normální tekuté potravy pro mouchy; 1 mM [Mg2 plus] krmivo bylo vyrobeno zředěním 0,5 ml 1 M MgCl2 ve 39,5 ml MilliQ vody a jeho přidáním do 460 ml tekutého krmiva. Potrava byla rozdělena na alikvoty a ochlazena, aby ztuhla. Jídlo doplněné MgS04 a CaCl2 bylo připraveno stejným způsobem.

Averzivní okamžitá a 24 hodPaměťexperimenty byly prováděny tak, jak bylo popsáno dříve (Hirano a kol., 2013; Perisse a kol., 2016; Tully a Quinn, 1985). Skupiny 100–120 much byly trénovány buď jedním cyklem averzivního tréninku, nebo pěti cykly rozmístěnými po 15 minutových intervalech mezi zkouškami (rozložený trénink). Pro averzivní okamžitéPaměť, byly mušky testovány po jednocyklovém tréninku. Averzivní 24 hodPaměťbyl testován pomocí dvou různých protokolů. V protokolu usnadněném půstem byly mouchy před jednocyklovým tréninkem hladověny po dobu 16 hodin (Hirano et al., 2013). Pro trénink s roztečem nebyly mouchy před tréninkem hladověny. Mouchy byly krmeny běžnou potravou pro mouchy po dobu 24 hodin po tréninku usnadněném půstem a rozloženém tréninku, než byly testovány naPaměťvýkon. Během každého averzivního tréninkového cyklu byly mouchy vystaveny po dobu 1 minuty prvnímu pachu (CS plus) spárovanému s dvanácti 90V elektrickými výboji v 5s intervalech. Po 45 s čistého vzduchu se po dobu 1 minuty bez šoku objevil druhý pach (CS ). Výkonnostní index byl vypočten jako počet mušek v rameni CS mínus počet v rameni CS plus

paže, děleno celkovým počtem much. MCH a OCT byly střídavě použity jako CS plus nebo CS a jeden vzorek, neboli n, představuje průměrný výkonnostní index ze dvou recipročně trénovaných skupin.

Testy senzorické ostrosti (obrázek 2 – zdrojová data 1) byly provedeny tak, jak je popsáno (Keene et al., 2004; Keene et al., 2006; Schwaerzel et al., 2003) s modifikacemi. Pro testování čichové ostrosti dostaly netrénované mouchy 2 minuty na výběr mezi zředěným zápachem, jak se používá při kondicionování, a vzduchem probublávaným minerálním olejem v T bludišti. Index zamezení byl vypočten jako počet much ve vzduchovém rameni mínus počet v pachovém rameni, dělený celkovým počtem much. Zabránění úrazu elektrickým proudem bylo provedeno a vypočteno podobně. Netrénované mouchy si volily 1 minutu mezi dvěma trubicemi obsahujícími elektrické sítě, ale pouze jedna byla připojena ke zdroji energie. Index vyhýbání se vypočítal jako počet much v neelektrifikovaném rameni mínus počet v elektrifikovaném rameni, dělený celkovým počtem much. K posouzení cukerné ostrosti dostaly hladovějící mouchy 2 minuty na výběr mezi ramenem T-labyrintu obsahujícím sušený cukrový papír a druhým obsahujícím sušený „vodní“ filtrační papír. Oba papíry byly připraveny jako v předkrmuPaměťtesty. Preferenční index byl vypočítán jako počet much v cukerném rameni mínus počet v druhém rameni, dělený celkovým počtem much. Zjistili jsme, že udržování světla v behaviorální místnosti a proudění vzduchu skrz testovací zkumavky značně zvýšilo preferenční index u much divokého typu, a proto jsme tyto podmínky aplikovali na všechna testování preference cukru.

Anti-UEX protilátka a western blot

Polyklonální protilátka UEX byla vyvinuta komerčně společností Eurogentec. Jako antigeny byly syntetizovány dva peptidy: Peptid 1H-CLPKLDDKFESKQSKP-OH (16aa) a Peptid 2H-CVDNRTK TRRNRYKKA-NH2 (16aa) a injikovány králíkům. Pouze Peptid 2 vyvolal silnou imunitní reakci a byl dále zpracován. Konečné sérum bylo purifikováno proti Peptidu 2 a použito pro analýzu western blot jako ředění 1:2000.

Pro každý vzorek ve western blotu byly proteiny extrahovány ze 20 hlav much důkladnou homogenizací ve 120 ml vzorkového proteinového pufru obsahujícího směs 30 ml 2-merkaptoethanolu (Bio-Rad), 270 ml 4 Vzorkový pufr Laemmli (BioRad) a 900 ml vody bez nukleázy (Invitrogen). Vzorky byly poté vařeny na 100˚C tepelném bloku po dobu 3 minut a před vložením centrifugovány po dobu 10 minut. Do každé dráhy gelu SDS-PAGE byl nanesen objem vzorku ekvivalentní čtyřem hlavám. Proteiny byly přeneseny na PVDF membránu a blokovány v 5% odstředěném mléce po dobu 1 hodiny při 25 °C s 35 ot./min. Membrána byla poté inkubována v roztoku anti-UEX (1:2000 králičí anti-UEX v 5% odstředěném mléce) přes noc při 4 °C s 35 ot./min. Membrána byla rychle třikrát promyta a následně 3 10 min promyta v roztoku TBST (100 ml roztoku TBS 10, BioRad, zředěného v 900 ml vody MilliQ, s 0,1 % Tween 20) a poté inkubována s HRP-konjugovaným roztok sekundární protilátky (1:5000 kozí anti-králičí v 5% odstředěném mléce) po dobu 1–2 hodin při 25 °C s 35 otáčkami za minutu. Membrána byla znovu rychle třikrát promyta a následně 3 10 min promyta v TBST. Proteinové pásy byly vizualizovány pomocí substrátu pro western blotting Pierce ECL (Life technologies, 32134). Membrána byla poté stripována pomocí roztoku Millipore ReBlot Plus Mild (Merck, 2502), znovu blokována v 5% odstředěného mléka a sondována myší anti-tubulinovou primární protilátkou (1:2000, Sigma, T6199) a odpovídající HRP konjugovanou kozí anti- myší sekundární protilátka (1:5000) podle protokolu popsaného výše.

Imunobarvení

Imunobarvení bylo provedeno tak, jak je popsáno (Wu a Luo, 2006). Mozky od 1- do 5-denních dospělých much byly vypreparovány v PBS a fixovány po dobu 20 min v PBS se 4 procenty paraformaldehydu při pokojové teplotě. Poté byly dvakrát krátce promyty v 0,5% PBT (2,5 ml Triton-X100 v 497,5 ml PBS) a třikrát po 20 minutách. Mozky byly poté blokovány po dobu 30 minut při teplotě místnosti v PBT obsahujícím 5 procent normálního kozího séra a poté inkubovány s primárními a sekundárními protilátkami s mírnou rotací (35 otáček za minutu) při 4 °C po dobu 1 nebo 2 dnů. Primárními protilátkami byly králičí anti-GFP (1:250; Invitrogen A11122) a králičí anti-HA (1:250, NEB 3724T). Alexa 488 – konjugovaná kozí anti-králičí protilátka (1:250; Invitrogen, A11034) byla sekundární protilátkou. Před a po inkubaci sekundární protilátky byly mozky podrobeny dvěma rychlým promytím, po kterých následovaly tři 20minutové promytí v 0,5% PBT. Obarvené mozky byly upevněny na sklíčka ve Vectashield (Vector Labs H1000) a zobrazeny pomocí konfokálního mikroskopu Leica TCS SP5 při zvětšení 40 (HCX PL APO 40, 1,3 CS olejový imerzní objektiv, Leica). Zásobníky snímků byly shromážděny v rozlišení 1024 1024 s kroky 1 mm a zpracovány pomocí Fidži (Schindelin et al., 2012). Pro kvantifikaci na obrázku 3G a H byly obdélníkové ROI přibližně 40 25 mm pro zeměkouli nebo kulaté ROI o průměru 15 mm pro ab, a'b' a EB ručně nakresleny na jeden řez. skenování z-stack mozku mouchy. Odpovídající ROI byly také nakresleny na superior mediální protocerebrum (SMP) jako kontrolní oblast pozadí a průměrná fluorescence byla vypočtena pomocí ImageJ. Intenzita ROI laloků MB a EB byla normalizována na intenzitu příslušné intenzity SMP. Pro jeden datový bod byl použit průměr mezi levým a pravým mozkem. Pro kvantifikaci na obrázcích 7C a D jsou oblasti zájmu uvedeny na obrázcích a intenzita oblasti zájmu byla vypočtena podobně jako výsledky na obrázku 3H. Na obrázku 7C byla nakreslena čára skrz nejširší část špičky laloku a. Profil intenzity této linie byl získán pomocí ImageJ. Pro každý profil čáry bylo extrahováno 30 datových bodů uprostřed takového profilu, pokrývající přibližně 15 mm čáru. Profil byl dále normalizován na střední hodnotu prvních pěti datových bodů (FO) a vypočten jako (Fo)/F0. Průměrné hodnoty těchto normalizovaných profilů z různých mozků byly vyneseny do grafu (obrázek 7C, střední panel). Byly vypočteny levý a pravý profil mozku a jsou samostatně zobrazeny. Na obrázku 7D jsou relativní intenzity z různých oblastí zájmu reprezentující různé oblasti sečteny, aby se vytvořila celková míra intenzity pro MB.

Expresní konstrukt lidské CNNM4 cDNA používaný ke zkoumání Mg2 plus efluxu v buněčné kultuře je ten, který byl popsán dříve (Yamazaki et al., 2013). Konstrukt exprimující Drosophila uex byl vytvořen vložením značky FLAG před STOP kodon uex CDS. FLAG-značené CNNM4 a uex cDNA byly následně vloženy do pCMV tag-4A (Agilent) pro expresi v HEK293 buňkách. Buňky HEK293 byly kultivovány v Dulbeccově modifikovaném Eagle médiu (Nissui) doplněném 10 procenty fetálního bovinního séra (FBS) a antibiotiky. Expresní plazmidy byly transfekovány Lipofectaminem 2000 (Invitrogen).

Pro imunobarvení byly buňky fixovány 3,7% formaldehydem v PBS po dobu 20 min a poté permeabilizovány 0,2% Tritonem X-100 v PBS po dobu 5 min, obojí při pokojové teplotě. Poté byly blokovány PBS obsahujícím 3 procenta FBS a 10 procent hovězího sérového albuminu (blokovací pufr) po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Buňky byly poté inkubovány přes noc při 4 °C s králičí anti-FLAG protilátkou (F7425, Sigma-Aldrich) zředěnou v blokovacím pufru, promyty 3x PBS a inkubovány po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti s Alexa 488-konjugovanou anti- králičí IgG (Invitrogen) a rhodamin-faloidin (pro vizualizaci F-aktinu, Invitrogen) zředěné v blokovacím pufru. Po třech promytích PBS byla krycí sklíčka připevněna na sklíčka a zobrazena konfokálním mikroskopem (FluoView FV1000; Olympus).

Zobrazování Mg2 plus pomocí Magnesium Green bylo provedeno tak, jak je popsáno (Yamazaki et al., 20}13), s mírnými modifikacemi. Aby se zabránilo potenciálnímu snížení [Mg2 plus]i s exprimovanými proteiny, byly transfekované buňky HEK293 kultivovány v růstovém médiu doplněném 40 mM MgCl2 až do zobrazení. Buňky byly poté inkubovány s Mg2 plus nanášecím pufrem (78,1 mM NaCl, 5,4 mM KCI, 1,8 mM CaCl2, 40 mM MgCl2, 5,5 mM glukózy a 5,5 mM HEPES-KOH [pH 7,4]), včetně magnesium-AM Green 2 m (Invitrogen), po dobu 30 minut při 37 °C. Buňky byly poté jednou opláchnuty nanášecím pufrem a pozorovány mikroskopem Olympus IX81 vybaveným fotoaparátem ORCA-Flash 4.0 CMOS (Hamamatsu) a rtuťovou výbojkou SHI-1300L (Olympus). Fluorescence byla měřena každých 20 s (excitace při 470–490 nm a emise při 505–545 nm) pod kontrolou softwaru Metamorph (Molecular Devices). Pufr byl poté vyměněn za Mg2 plus volný pufr (MgCl2 v nanášecím pufru byl nahrazen 60 mM NaCl). Data jsou prezentována jako čárové grafy (průměr 10 buněk). Po zobrazení byly buňky fixovány PBS obsahujícím 3,7 procenta formaldehydu a podrobeny imunofluorescenční mikroskopii pro potvrzení exprese proteinu.

Měření koncentrace Mg2 plus na bázi FRET v mozcích fixovaných much

Jedno až dvoudenní mouchy s genotypem c739; UAS-MagFRET-1 byly umístěny v lahvičkách s 1 mM nebo 80 mM [Mg2 plus ] potravou po dobu 4 dnů, než byly odebrány. Mozky much byly vypreparovány v PBS a fixovány po dobu 20 min v PBS se 4 procenty paraformaldehydu při teplotě místnosti. Poté byly dvakrát krátce promyty v 0,5% PBT (2,5 ml Triton-X100 ve 497,5 ml PBS) a třikrát 10 minutových promytí. Mozky byly poté upevněny na skleněná sklíčka ve Vectashield (Vector Labs H1000) a zobrazeny pomocí širokoúhlého mikroskopu Scientifica Slicescope s 40 , 0,8 NA vodním imerzním objektivem a kamerou Andor Zyla sCMOS se softwarem Andor Solis (v4.27). Aby se získal poměr FRET, který ukazuje koncentraci Mg2 plus ab neuronu, byly získány časové řady střídavě mezi blankytným kanálem a kanálem citrínu při 3 Hz s 512 512 pixely a 16 bity. Vlnová délka excitace pro oba kanály je 436 nm, přičemž emisní filtr pro blankyt je 460–500 nm a pro citrín je 520–550 nm. Sériové získávání začíná od blankytného kanálu a trvá 5 s, poté se přepne na citrínový kanál a trvá dalších 5 s a tento cyklus se opakuje ještě dvakrát. Pro každý mozek byl tedy získán soubor obrázků o délce 30 s (90 snímků). Zásobníky obrázků byly následně analyzovány pomocí ImageJ a vlastních skriptů Matlab. Stručně řečeno, obdélníkové oblasti zájmu (obrázek 1E, levý panel) byly ručně nakresleny na laloky ab (jeden na laloku a jeden na laloku b pro každou hemisféru) a mimo laloky ab (jeden pro každou hemisféru) jako kontrola pozadí. Intenzita fluorescence z blankytného kanálu byla vypočtena vydělením ROI každého vertikálního nebo horizontálního laloku ROI pozadím a zprůměrována mezi dvěma hemisférami pro každý lalok a zprůměrována za 15 snímků pro každý cyklus. To z citrínového kanálu bylo získáno podobně. Z výše uvedených intenzit byl získán poměr FRET, dále zprůměrovaný mezi třemi cykly získávání, znázorněný jako jeden datový bod na obrázku 1E (pravý panel).

Konfokální zobrazení Mg2 plus v mozku explantátu mouchy

Explantátové mozky exprimující c739-GAL4 řízené UAS-MagIC byly umístěny na dno 35mm mikrotitrační misky se skleněným dnem (díl č. P35G-1.5–14 C, MatTek Corporation), pod extracelulární fyziologický roztok pufru (103 mM NaCl, 3 mM KCl, 5 mM N-Tris, 10 mM trehalóza, 10 mM glukóza, 7 mM sacharóza, 26 mM NaHC03, 1 mM NaH2P04, 1,5 mM CaCl2, MgCl2m2, osmomm pH 7,3]) po disekci v pufru bez vápníku (Barnstedt et al., 2016). Pro stanovení Mg2 plus citlivosti UAS-MagIC a také odezvy UAS-MagIC na jiné chemikálie, jako je EDTA, EGTA a CaCl2 (obrázek 8B), byly mozky inkubovány ve fyziologickém roztoku pufru s 20 mg/ml digitoninu. 6 min před snímkováním (Koldenkova et al., 2015). Ke zkoumání fluktuace Mg2 plus v reakci na aplikaci Forskolin (FSK) (obrázek 8C–I) byly mozky vloženy do fyziologického roztoku pufru bez digitoninu nebo inkubace. V obou situacích se fyziologický roztok týká pufru (buď s digitoninem nebo bez něj), ve kterém je mozek ponořen.

Zobrazování bylo provedeno na konfokálním mikroskopu LSM780 (Zeiss) s objektivem 20 vzduchu pomocí softwaru ZEN 2011. Venušina část MagIC byla excitována 488 nm laserem a jeho emise byla shromažďována v rozsahu 520–560 nm. mCherry byl excitován 561 nm laserem a jeho emise byla shromažďována v rozsahu 600–640 nm. Časové řady byly pořízeny při 0,5 Hz s 512 512 pixely a 16 bity. Po 60 s základního měření Venuše/mCherry bylo do misky přidáno 2–20 ml fyziologického roztoku nebo jiného příslušného chemického roztoku pomocí mikropipety s konstantním snímáním obrazu. Účinky aplikovaných látek na emisi Venuše/mCherry byly poté zaznamenávány po dobu 15–20 minut.

Zásobníky obrázků byly následně analyzovány pomocí ImageJ a vlastních skriptů Python. Stručně řečeno, obdélníkové oblasti zájmu byly ručně nakresleny na neurony ab (jedna pro každou hemisféru, obrázek 8A) a další oblast zájmu stejné velikosti byla nakreslena uprostřed, ale mimo MB jako kontrola pozadí. Intenzita fluorescence z kanálu Venuše (nebo mCherry) byla vypočtena odečtením pozadí ROI od kalichových oblastí zájmu a zprůměrována mezi dvěma hemisférami. Toto je označováno jako „Rel. Intenzita (au)' na obrázku 8D a E. Poměr mezi intenzitou Venuše a mCherry byl vypočten jako 'MagIC Ratio' na obrázku 8B a C a obrázku 8F a G. Pro obrázek 8H byla intenzita pro dva kanály vypočtena samostatně. V tomto případě „Rel. Intenzita (DF/F0)' označuje relativní intenzitu fluorescence normalizovanou na průměrnou intenzitu ze základního období F0, vypočtenou jako (FF0)/F{{9} }. Relativní intenzita DF/F0 Venuše byla použita k výpočtu PSD (obrázek 8I) prostřednictvím pythonovské funkce psd (pod matplotlib.pyplot), která převzala Welchovu metodu průměrného periodogramu (Bendat et al., 2000).

Reverzní transkripce a kvantitativní real-time PCR

Pro každý vzorek bylo 120 much zmraženo v kapalném dusíku a jejich hlavy byly kompletně homogenizovány v činidle TRIzol (Invitrogen). Celková RNA byla extrahována pomocí soupravy Direct-zol RNA MiniPrep (R2050) podle pokynů výrobce. cDNA byla syntetizována za použití systému syntézy prvního řetězce SuperScript III (Invitrogen). Pro každé odlišné ošetření nebo genotyp bylo připraveno pět nezávislých vzorků. Kvantitativní PCR byla provedena trojmo pro každý vzorek cDNA na přístroji LightCycler 480 (Roche) s použitím SYBR Green I Master Mix (Roche). Křivky tání byly analyzovány po amplifikaci a amplikony byly vizualizovány elektroforézou na agarózovém gelu, aby se potvrdila specificita primeru. Relativní hladiny transkriptů byly vypočteny 2-metodou DDCt (Livak a Schmittgen, 2001) a pro normalizaci byl použit geometrický průměr hodnot Ct tří referenčních genů (Gapdh, Tbp a Ef1a 100E). Primery jsou podrobně uvedeny v tabulce zdrojů.

Inverzní PCR

Inverzní PCR byla použita k mapování polohy inzerce MiMIC u mušek uexMI01943. Genomová DNA byla připravena z 15 dospělých much. DNA ekvivalentní dvěma mouchám byla poté štěpena ve 25 ml restrikční reakci s Mbol a 10 ml produktu bylo ligováno přes noc při 4 °C přes noc, aby se fragmenty cirkulovaly; 5 ml ligačního produktu bylo použito pro inverzní PCR. PCR produkt byl před sekvenováním purifikován pomocí Exo/SAP reakce (Thermo Fisher, 78201). Sekvence byla porovnána s genomem D. melanogaster (FlyBase, Release 6) pomocí BLAST a jednotně přiřazena k oblasti 3,882,886,3,882,641 na 2R, v souladu s hlášenou inzercí uexMI01943 na FlyBase. Primery jsou podrobně uvedeny v tabulce zdrojů.

Predikce a zarovnání proteinových domén

Zarovnání proteinové sekvence bylo provedeno pomocí Geneious R10.2.2. Predikce proteinové domény byla provedena pomocí InterPro (Finn et al., 2017; Jones et al., 2014) a Phyre2 (Kelley et al., 2015). Zarovnání proteinové domény a struktury bylo provedeno pomocí TM-align (Zhang a Skolnick, 2005). Vizualizace proteinové struktury byla poskytnuta v Chimera 1.11.2 (Pettersen et al., 2004).

Kvantifikace a statistické analýzy

Data o chování byla analyzována pomocí Excelu a Prism 6. Zobrazovací data byla analyzována pomocí ImageJ a vlastních skriptů MATLAB nebo Python. Pro srovnání dvou skupin byly použity nepárové dvoustranné t-testy a pro srovnání více skupin byla použita jednocestná ANOVA následovaná Tukeyho post-hoc testem. Práh statistické významnosti byl stanoven na p<>

Poděkování

Děkujeme FJ Arjoně a JGJ Hoenderopovi za myší klony CNNM2 a komentáře k rukopisu. Jsme vděční T Nagai za klony MagIC a MARIO a Bloomington Stock Center a VDRC za mouchy. Děkujeme P Cognignimu, Y Huangovi, R Brainovi, R Szoke-Kovacsovi a M Goodwinovi za technickou podporu a dalším členům skupiny Waddell za diskusi. Děkujeme N Halidi, C Monico a Micron Advanced Bioimaging Unit (s podporou Wellcome Strategic Awards 091911/B/10/Z a 107457/Z/15/Z) za jejich podporu a pomoc při této práci. EM byl financován dlouhodobým stipendiem EMBO (ALTF 184-2109). KDJ uznává podporu od Rhodes Trust. SW byl financován z Wellcome Principal Research Fellowship (200846/ Z/16/Z) a ERC Advanced Grant (789274).