Aktivní přechod fáze paměti strachu od opětovné konsolidace k zániku prostřednictvím ERK-zprostředkované prevence opětovné konsolidace

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

VyhledánístrachPaměťvyvolává dva protichůdné paměťové procesy, tj. rekonsolidaci a zánik. Krátké vyhledání vyvolává opětovné sjednocení k udržení nebo posílení strachuPaměť, zatímco delší vyhledávání tuto vzpomínku zhasne. Ačkoli byly zkoumány mechanismy opětovné konsolidace a zániku, zůstává neznámé, jak se fáze paměti strachu přepne z opětovné konsolidace na zánik během získávání paměti. Zde ukazujeme, že proces přechodu paměti závislý na extracelulárním signálu kinázy (ERK) po vyhledání reguluje přepnutí fází paměti z opětovné konsolidace do zániku tím, že zabrání indukci opětovné konsolidace v úkolu inhibičního vyhýbání se (IA) u samců myší. Za prvé, fáze přechodové paměti, která ruší indukci rekonsolidace, ale je nedostatečná pro získání extinkce, byla identifikována po rekonsolidaci, ale před fázemi extinkce. Za druhé, fáze rekonsolidace, přechodu a zánikunačítání pamětivykazovaly odlišné molekulární a buněčné podpisy prostřednictvím cAMP-responzivního proteinu vázajícího element (CREB) a fosforylace ERK v amygdale, hippocampu a mediálním prefrontálním kortexu (mPFC). Fáze opětovné konsolidace ukázala zvýšenou fosforylaci CREB, zatímco fáze extinkce vykazovala několik nervových populací s různými kombinacemi fosforylace CREB a/nebo ERK v těchto oblastech mozku. Je zajímavé, že tři paměťové fáze, včetně přechodové fáze, vykazovaly přechodnou aktivaci ERK ihned po vyvolání. Nejdůležitější je, že blokáda ERK v amygdale, hippocampu nebo mPFC ve fázi přechodové paměti dezinhibovala posílení IA paměti vyvolané rekonsolidací. Tato pozorování naznačují, že signální dráha ERK aktivně reguluje přechod paměťové fáze od opětovné konsolidace k zániku a tento proces funguje jako spínač, který ruší opětovné utužení strachu.Paměť.

Klíčová slova: ERK; zánik; paměť strachu; znovukonsolidace; přechod

1Department of Bioscience, Fakulta přírodních věd, Tokijská zemědělská univerzita, Tokio 156-8502, Japonsko a

2Graduate School of Agriculture and Life Sciences, The University of Tokyo, Tokio 113-8657, Japan

Prohlášení o významu

Vyvolání paměti strachuvyvolává dva opačné paměťové procesy; znovukonsolidace a zánik. Rekonsolidace udržuje/zlepšujepaměť strachu, zatímco vyhynutí oslabuje paměť strachu. Zůstává neznámé, jak se fáze paměti přepínají z opětovné konsolidace na zánik během vyhledávání. Zde jsme identifikovali proces aktivního přechodu paměti fungující jako přepínač, který brání opětovné konsolidaci. Tato fáze paměťového přechodu ukázala přechodné zvýšení fosforylace kinázy regulované extracelulárním signálem (ERK) v amygdale, hippocampu a mediálním prefrontálním kortexu (mPFC). Je zajímavé, že inhibice ERK v těchto oblastech v přechodné fázi deinhibovala rekonsolidací zprostředkované posílení inhibiční vyhýbavé (IA) paměti. Tato zjištění naznačují, že proces přechodové paměti aktivně reguluje přepínání fází paměti strachu paměti strachu tím, že brání indukci opětovné konsolidace prostřednictvím aktivace signální dráhy ERK.

Úvod

Paměťvyhledávání není pasivní proces, ale je to spíše dynamický proces, který umožňuje udržení, posílení, oslabení nebo změnu/aktualizaci původní paměti (Misanin a kol., 1968; Schneider a Sherman, 1968; Lewis, 1979; Mactutus a kol. ., 1979; Gordon, 1981; Nader a kol., 2000; Nader a Hardt, 2009; Dudai, 2012; Fukushima a kol., 2014). Důležité je, že získaná podmíněná paměť strachu krátkým opětovným vystavením podmíněnému stimulu (CS) se stává labilní a vyžaduje pro své udržení nebo posílení rekonsolidaci závislou na genové expresi (Nader et al., 2000; Dudai, 2002; Kida et al., 2002; Suzuki a kol., 2004; Tronel a kol., 2005; Fukushima a kol., 2014). Naopak nepřetržité nebo opakované vystavování CS vyvolává zánik paměti, což oslabuje paměť strachu (Pavlov, 1927; Rescorla, 2001; Myers a Davis, 2002). Vyvolání paměti strachu tedy vyvolává dva protichůdné paměťové procesy, tj. rekonsolidaci a zánik, ačkoli oba procesy jsou vyvolány opětovným vystavením identickému CS, ale liší se podle doby trvání opětovného vystavení CS.

Společným a kritickým biochemickým rysem opětovné konsolidace a extinkce je požadavek na genovou expresi zprostředkovanou proteinem vázajícím element (CREB) reagujícím na cAMP (Mamiya et al., 2009). Je zajímavé, že jsme ukázali kontrastní molekulární, anatomické a behaviorální signatury mezi fázemi rekonsolidace a zániku kontextové paměti strachu (Suzuki et al., 2004; Mamiya et al., 2009). Blokování syntézy proteinů během fáze rekonsolidace narušuje původní strachPaměť, zatímco blokování syntézy proteinů během fáze extinkce to nedokáže, ačkoli kontextová paměť strachu byla znovu aktivována. Požadavek na oblasti mozku vykazující aktivaci genové exprese zprostředkované CREB se liší mezi rekonsolidací a zánikem; rekonsolidace závisí na amygdale a hippocampu, zatímco zánik závisí na amygdale a mediálním prefrontálním kortexu (mPFC). Časový průběh aktivace amygdaloidního CREB se však mezi fázemi paměti rekonsolidace a extinkce liší. Tato pozorování naznačují, že fáze opětovné konsolidace a zániku nejsou nezávislé, ale spíše se vzájemně ovlivňují. Je zajímavé, že nedávné studie identifikovaly časové okno (přechodnou fázi), které nevykazuje žádnou aktivaci kinázy regulované extracelulárním signálem (ERK) v amygdale po opětovné konsolidaci, ale před fázemi zániku po obnovení paměti sluchového strachu (Merlo et al., 2018 ). Dohromady tato zjištění naznačují možné mechanismy, kterými se fáze paměti přepínají z opětovné konsolidace na zánik během získávání paměti strachu. Jinými slovy, je možné, že proces přechodu paměti aktivně reguluje tento přepínač.

Při úloze inhibičního vyhýbání (IA) dostanou myši elektrický šok do nohy poté, co vstoupí do tmavého prostoru ze světlého prostoru a vytvoříPaměťabyste se vyhnuli tmavému oddělení. Dříve jsme pomocí tohoto úkolu ukázali, že fáze rekonsolidace a extinkce mohou být rozlišeny v okamžiku, kdy myš vstoupí do tmavého prostoru ze světlého prostoru během re-expoziční relace (Fukushima et al., 2014). Tento úkol nám proto umožňuje charakterizovat perspektivní molekulární signatury fází rekonsolidace a extinkce, na rozdíl od klasického kontextuálního paradigmatu podmiňování strachu, ve kterém reaktivace podmíněné paměti strachu opětovným vystavením CS iniciuje jak rekonsolidaci, tak zánik; krátké (3 min) opětovné vystavení podmíněnému kontextu indukuje konsolidaci, zatímco dlouhé (30 min) nebo opakované opětovné vystavení tomuto kontextu indukuje zánik (Eisenberg et al., 2003; Pedreira a Maldonado, 2003; Suzuki et al., 2004; Lee a kol., 2008; Mamiya a kol., 2009). Dále jsme zjistili, že získaná paměť IA je v tomto úkolu vylepšena prostřednictvím opětovné konsolidace paměti (Fukushima et al., 2014).

Porozumět mechanismu přechodu od opětovného sjednocení k zániku během získávání strachuPaměťjsme se zaměřili na identifikaci a charakterizaci molekulárních, buněčných a behaviorálních signatur fáze rekonsolidace, přechodu a zániku paměti IA. Analyzovali jsme aktivaci CREB a ERK v amygdale, hippocampu a mPFC ve fázích rekonsolidace, přechodu a zániku a zkoumali jsme role aktivace ERK v těchto paměťových procesech.

Materiály a metody

Myši Všechny experimenty byly prováděny podle Příručky pro péči a použití laboratorních zvířat (Japan Neuroscience Society a Tokyo University of Agriculture). Všechny pokusy na zvířatech provedené v této studii byly schváleny Výborem pro péči o zvířata a použití Tokijské zemědělské univerzity (autorizace č. 280037). Všechny chirurgické zákroky byly prováděny v anestezii Nembutal a bylo vynaloženo veškeré úsilí k minimalizaci utrpení. Samci myší C57BL/6N byli získáni od Charles River. Myši byly umístěny v klecích po pěti nebo šesti, udržovány v cyklu světlo/tma 12/12 hodin a byl jim umožněn přístup k potravě a vodě ad libitum. Při testování byly myši staré nejméně osm týdnů. Testování bylo prováděno během světelné fáze cyklu. Všechny experimenty byly prováděny naslepo k léčebným podmínkám myší.

IA test Průchozí IA přístroj (OHARA Pharmaceutical) sestával z krabice s oddělenými světlými a tmavými oddíly (obě 15,5 12,5 11,5 cm). Světelný prostor byl osvětlen fluorescenčním světlem (2500 luxů; Fukushima et al., 2008, 2014; Zhang et al., 2011; Ishikawa et al., 2016). Před zahájením IA tréninku se s myšími manipulovalo individuálně po dobu 2 minut každý den po dobu jednoho týdne. Během tréninku bylo každé myši umožněno přivyknout si na světlý oddíl po dobu 30 s a gilotinová dvířka byla zvednuta, aby umožnila přístup do tmavého oddílu. Latence vstupu do tmavého kompartmentu byla považována za měřítko akvizice. Jakmile myš vstoupila do temného prostoru, dvířka gilotiny se zavřela. Po 5 s byl aplikován šok do nohy (0,2 mA) po dobu celkem 2 s (trénink). 24 hodin po tréninku byla myš umístěna zpět do světlého prostoru, dokud nevstoupila do tmavého prostoru (průměr 459 6 15,49 s). Ihned poté, co myš vstoupila do tmavého oddělení, byla dvířka gilotiny zavřena a myš zůstala v tmavém oddělení po různou dobu (0, 1 nebo 10 minut) bez šoku do nohy (reaktivace). Paměť byla vyhodnocena o 48 hodin později [test dlouhodobé paměti po aktivaci (PR-LTM)] jako zkřížená latence pro myš vstoupit do tmavého oddílu, když je umístěna do světlého oddílu, jako při reaktivaci.

V prvním experimentu jsme zkoumali účinek inhibice syntézy proteinů po reaktivaci (opětovné vystavení tmavému kompartmentu po dobu 0, 1 nebo 1 0 min; obr. 1). Inhibitor syntézy proteinů anisomycin (ANI; Wako) byl rozpuštěn ve fyziologickém roztoku (pH upraveno na 7.0–7,4 pomocí NaOH). Myši byly trénovány, jak je popsáno výše, a o 24 hodin později dostaly vehikulum (VEH) nebo ANI (150 mg/kg, ip) ihned po opětovné expozici tmavému oddělení po dobu 0, 1 nebo 10 minut bez šoku do nohou. (reaktivace). Při této dávce ANI inhibuje 0,90 procent syntézy proteinů v mozku během prvních 2 hodin (Flood et al., 1973). 48 hodin po reaktivační relaci byly jednotlivé myši znovu umístěny do lehkého kompartmentu a byla hodnocena zkřížená latence.

Pro druhý experiment [fosforylovaný CREB (pCREB) a fosforylovaný ERK (pERK) imunohistochemie; Obr. 2–5] jsme zkoumali oblasti mozku, které byly aktivovány po opětovném vystavení světlu (dokud myši nevstoupily do tmavého kompartmentu, znovu se vystavily tmavému kompartmentu po dobu 0 min) nebo tmavého kompartmentu (re- vystavení tmavému prostoru po dobu 1 nebo 1 0 min). Myši byly rozděleny do čtyř Fukushima et al. · Transition of Fear Memory Phases after Retrieval J. Neurosci., 10. února 2021, • 41(6):1288–1300 • 1289groups. 24 hodin po tréninku byly jednotlivé myši znovu vystaveny světlému kompartmentu a poté zůstaly v tmavém kompartmentu po svém vstupu z tmavého kompartmentu [reaktivace: 0 min v tmavém kompartmentu, skupina pro rekonsolidaci (Recon); 1 min, přechodová (Tran) skupina; 10 min, extinkce (Ext) skupina]. Další skupina myší nebyla vrácena do kompartmentu světlo/tma [nereaktivovaná (NR) skupina]. Myši byly poté anestetizovány Nembutalem (750 mg/kg, ip) 5, 15 nebo 30 minut po reaktivaci.

Pro třetí experiment (mikroinfuze U0126; obr. 6, 7) jsme zkoumali účinky inhibice ERK v amygdale, hippocampu nebo mPFC naPaměťznovukonsolidace/posílení, přechod a zánik. Inhibitor MEK U0126 (Sigma-Aldrich) byl rozpuštěn v umělém mozkomíšním moku obsahujícím tři kapky Tween 80 (Sigma) ve 2,5 ml 7,5% dimethylsulfoxidu (Wako) a upraveno na pH 7,4 s NaOH. Myši byly trénovány, jak je popsáno výše, a o 24 hodin později byly umístěny zpět do světelné komory (reaktivace). Myším byla okamžitě poté podána mikroinfuze U0126 (1 mg) nebo VEH do různých oblastí mozku (obr. 6A, C, E–H, 7A–C) nebo 30 minuty po (obr. 6B, D) reaktivace. 48 hodin po reaktivaci byly jednotlivé myši znovu umístěny do světlého kompartmentu a byla hodnocena zkřížená latence (PR LTM). Mikroinfuze do hipokampu a mPFC (0,5 ml) byly prováděny rychlostí 0,25 ml/min. Mikroinfuze do amygdaly (0,2 ml) byly prováděny rychlostí 0,1 ml/min. Injekční kanyla byla ponechána na místě po dobu 2 minut po mikroinfuzi a myši byly poté vráceny do svých domovských klecí. Inhibitor MEK SL327 (Santa Cruz Biotechnology) byl rozpuštěn v dimethylsulfoxidu a zředěn fyziologickým roztokem. Myši byly trénovány, jak je popsáno výše, a o 24 hodin později byly jednotlivé myši umístěny zpět do světelné komory (reaktivace). Myším byl systémově injikován SL327 (10 nebo 20 mg/kg) nebo VEH ihned po reaktivaci (obr. 7D–F). 48 hodin po reaktivaci byly jednotlivé myši znovu umístěny do světlého kompartmentu a byla hodnocena zkřížená latence (PR-LTM).

Imunohistochemie byla provedena tak, jak bylo popsáno dříve (Mamiya et al., 2009; Suzuki et al., 2011; Zhang et al., 2011; Fukushima et al., 2014; Ishikawa et al., 2016; Hasegawa et al., 2019). Po anestetizaci byly všechny myši perfundovány 4% paraformaldehydem. Mozky byly vyjmuty, fixovány přes noc, přeneseny do 30% sacharózy a skladovány při 4 stupních. Koronální řezy (30 mm) byly řezány v kryostatu.

Pro barvení pCREB a pERK byly volně plovoucí řezy ošetřeny 1 procentem H2O2 a inkubovány přes noc s králičí polyklonální anti-fosfo-CREB (serin 133; S133) protilátkou (1:1000; #{{10 }}, Millipore) a/nebo králičí monoklonální anti-fosfo-ERK1/2 (T202/Y204) protilátka (1:300; #4370; Cell Signaling Technology) v blokovacím roztoku (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok plus 1 procento kozího sérového albuminu, 1 mg/ml hovězího sérového albuminu a 0,05 procenta Tritonu X-100). Řezy byly promyty fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem a inkubovány s křenovou peroxidázou konjugovaným oslím anti-králičím IgG (1:500; Jackson ImmunoResearch) pro pCREB nebo kozím anti-králičím IgG konjugovaným s křenovou peroxidázou pro pERK po dobu 1 h při teplotě místnosti. Signály pCREB byly amplifikovány biotinovým tyramidem a vizualizovány pomocí Alexa Fluor-konjugovaného streptavidinu (Invitrogen). Signály pERK byly amplifikovány pomocí TSA-FCM (Invitrogen). Sekce byly namontovány na sklíčka a zakryty krycím sklíčkem pomocí montážního média (Millipore).

Kvantifikace byla provedena tak, jak bylo popsáno dříve (Frankland et al., 2006; Fukushima et al., 2014; Mamiya et al., 2009; Zhang et al., 2011; Suzuki et al., 2008). Struktury byly definovány anatomicky podle atlasu Franklina a Paxinose (1997). Všechny imunoreaktivní neurony byly spočítány experimentátorem slepým k léčebnému stavu

Výsledek

Charakterizace paměťových fází po vyhledání v úloze IA

Úloha IA nám umožňuje rozlišit fáze rekonsolidace a extinkce v okamžiku, kdy myš vstoupí do tmavého prostoru ze světlého prostoru (Fukushima et al., 2014). Abychom porozuměli mechanismu, který je základem přepínání paměťových fází od opětovné konsolidace k zániku, charakterizovali jsme IA paměťové fáze po načtení paměti zkoumáním účinků inhibice syntézy proteinů, která je nezbytná pro opětovné konsolidaci a zánik paměti IA (Fukushima et al., 2014). Myši byly nejprve umístěny do světelné komory. Za 5 s poté, co vstoupili do tmavého prostoru, došlo ke krátkému elektrickému šoku (trénink). Myši byly znovu vystaveny světlému kompartmentu 24 hodin po tréninku (reaktivační relace; obr. 1A) a byla hodnocena jejich zkřížená latence ke vstupu do tmavého kompartmentu (obr. 1B). Myši byly vráceny do svých domovských klecí ihned poté, co vstoupily do tmavého oddělení ze světlého oddělení (0-min. opětovné vystavení tmavému oddělení; fáze rekonsolidace) nebo zůstaly v tmavém oddělení 1, 3 nebo 10 min bez zásahu do nohou (fáze extinkce; obr. 1C–E). Bezprostředně po reaktivační relaci myši dostaly systémovou injekci VEH nebo inhibitoru syntézy proteinů ANI. O 48 hodin později byla zkřížená latence hodnocena PR-LTM.

V souladu s naší předchozí studií (Fukushima et al., 2014) vyvolala opětovná expozice lehkému kompartmentu (skupina 0 min) opětovné konsolidace a posílení paměti IA. Dvoucestná ANOVA odhalila významné účinky času (F(1,24)=10.433, p=0.{{20}}036), lék (F(1 ,24)=23,197, p, 0,0001) a časová léková interakce (F(1,24)=25,022, p, 0,0001; obr. 1B). Post hoc Bonferroniho test a párový t-test odhalily, že skupiny VEH a ANI vykazovaly významně zvýšenou, respektive sníženou crossover latenci při PR-LTM ve srovnání s reaktivační relací (ps , 0,05; VEH, t(6) {{28 }} 5,134, p=0,0021, ANI, t(6)=4,804, p=0,003; obr. 1B). Tato pozorování naznačují, že získávání paměti IA ve světlém prostoru zlepšilo paměť, zatímco inhibice syntézy proteinů narušila získanou paměť, což potvrzuje předchozí pozorování, že získávání paměti IA zlepšuje paměť prostřednictvím opětovné konsolidace způsobem závislým na syntéze proteinů.

Naproti tomu opětovná expozice tmavému kompartmentu vyvolala dlouhodobou extinkci [dvoucestná ANOVA, čas (obr. 1C, F(1,28)=9.575, p=0.{101} {50}}04; obr. 1D, F(1,36)=11.699, p=0.0016), lék (Obr. 1C, F(1,28)=4,674, p=0,039; Obr. 1D, F(1,36)=12,285, p {{29 }}.0012), časová léková interakce (obr. 1C, F(1,28)=7.916, p=0.009; obr. 1D, F(1,36) {{41 }}.915, p=0.0079)], jak bylo pozorováno dříve (Fukushima et al., 2014). Skupiny VEH, které zůstaly v tmavém kompartmentu po dobu 3 nebo 10 minut, vykazovaly významně sníženou zkříženou latenci při PR-LTM ve srovnání s reaktivací, zatímco skupiny ANI vykazovaly srovnatelnou zkříženou latenci v PR-LTM ve srovnání s reaktivací a reaktivací. VEH skupiny (post hoc Bonferroniho test, ps , 0,05; párový t test, obr. 1C, VEH, t(7)=4,976, p=0,0016, ANI, t(7) { 0,05 ). Tato pozorování naznačují, že opětovné vystavení tmavému kompartmentu po dobu 3 nebo 10 minut uhasilo paměť IA a že inhibice syntézy proteinů blokovala dlouhodobou extinkci. Vyhledání IA paměti v temném prostoru tedy uhasí IA paměť způsobem závislým na genové expresi.

Důležité je, že skupina VEH vykazovala srovnatelnou zkříženou latenci při PR-LTM ve srovnání s reaktivační relací a se skupinou ANI, když zůstali v tmavém kompartmentu po dobu 1 minuty [dvoucestná ANOVA, čas (F(1,36) {{ 5}}.03, str. 0.05), droga (F(1,36)=0.019, str . 0.05), časová léková interakce (F(1,36)=0.011, s. 0,05); post hoc Bonferroniho test, ps . 0,05; párový t-test, VEH, t(9)=0.091, s . 0,05, ANI, t(9)=0,328, p . 0,05; Obr. 1E]. Tato pozorování naznačují, že skupina VEH nevykazovala ani posílení, ani zánik paměti IA a že skupina ANI nevykazovala žádné narušení paměti IA. Proto opětovné vystavení tmavému kompartmentu po dobu 1 minuty zablokovalo jak zesílení, tak narušení reaktivované IA paměti vyvolané ANI, ale nevyhaslo IA paměť, což naznačuje, že tato 1-min reexpozice ruší indukci opětovné konsolidace , ale nestačí k uhašení paměti IA.

V souhrnu tyto výsledky ukázaly, že opětovné vystavení světlému kompartmentu indukuje fázi rekonsolidace, zatímco delší reexpozice tmavému kompartmentu (3 nebo 10 minut) indukuje fázi extinkce. Ještě důležitější je, že pobyt po dobu 1 minuty v temném prostoru indukuje přechodnou fázi od opětovné konsolidace k zániku, což inhibuje opětovné konsolidaci paměti strachu, aniž by vyvolalo zánik.

Molekulární podpisy fází rekonsolidace, přechodu a zániku v amygdale, hippocampu a mPFC po načtení paměti IA

Rekonsolidace a zánik kontextové paměti strachu ukazuje zvýšení fosforylace CREB na S133, markeru aktivace genové exprese potřebného pro opětovné konsolidaci a dlouhodobé vymírání, ale vykazuje zřetelnou dynamiku fosforylace CREB (Mamiya et al., 2009 ). Je zajímavé, že nedávné studie ukázaly, že nedochází k žádnému zvýšení fosforylace ERK, upstream regulátoru CREB (Impey et al., 1998; Wu et al., 2001), v bazolaterální oblasti amygdaly na přechodu z rekonsolidace. k zániku paměti vyvolaného strachu, ačkoli tato fosforylace je zvýšena v bazolaterální oblasti, když je paměť vyvolaného strachu znovu konsolidována a uhasena (Merlo et al., 2014, 2018). Jiná studie ukázala, že hipokampální ERK se aktivuje pouze tehdy, když kontextová paměť strachu vyhasne, ale není znovu konsolidována (Tronson et al., 2009). Tato zjištění naznačují, že fáze rekonsolidace, přechodu a zániku vykazují odlišné molekulární a buněčné podpisy. Proto jsme pomocí imunohistochemie měřili a porovnávali hladiny pCREB a pERK ve fázi rekonsolidace, přechodu a extinkce. Provedli jsme podobná experimentální schémata jako na obrázku 1B, D, E za použití čtyř experimentálních skupin. Myši byly znovu vystaveny světlému kompartmentu 24 hodin po tréninku a poté zůstaly v tmavém kompartmentu [reaktivace: 0 min v tmavém kompartmentu, rekonsolidační (Recon) skupina; 1 min, přechodová (Tran) skupina; 10 min, extinkce (Ext) skupina]. Další skupina myší nebyla vrácena do komory světlo/tma (nereaktivovaná, skupina NR). Spočítali jsme pCREB-pozitivní (pCREB1) neurony, pERK-pozitivní (pERK1) neurony a dvojitě pozitivní (pCREB1/pERK1) neurony v amygdale, hippocampu a mPFC 30 minut po reaktivaci.

Amygdala (laterální oblast) CREB byla aktivována ve fázi extinkce a rekonsolidace, zatímco ERK byla aktivována pouze ve fázi extinkce (obr. 2A–C). Jednosměrná ANOVA odhalila významný účinek skupiny (obr. 2B, F(3,29)=14.85, p, 0.0001). Podobně jako u předchozích zjištění (Mamiya et al., 2009) post hoc Newman-Keulsův test odhalil, že skupiny Recon a Ext vykazovaly významně více neuronů pCREB1 než ostatní skupiny (p, 0,05). Tato pozorování ukázala, že podobně jako pozorování na úrovních chování (obr. 1), vystavení tmavému kompartmentu po dobu 1 minuty (přechodná fáze) ruší "zapnutí" fosforylace CREB, která by se zvýšila ve fázi rekonsolidace. Naproti tomu ve skupině Ext bylo pozorováno významně více neuronů pERK1 než v ostatních skupinách, ačkoli ve skupině Ext bylo mnohem méně neuronů pERK1 než neuronů pCREB1 (F(3,29)=3.793, p { {23}}.0207, obr. 2C).

Důsledně bylo pozorováno významně více dvojitě pozitivních neuronů (pCREB1/pERK1) ve skupině Ext (F(3,29)=6.698, p=0.00 14; obr. 2D), zatímco významně více neuronů pCREB1/ pERK– (pCREB single positive) bylo pozorováno ve skupinách Recon a Ext (F(3,29)=13.689, p, 0 .0001; obr. 2E). Rekonsolidační fáze tedy ukázala pouze jednu populaci neuronů pCREB1/pERK–. Naproti tomu fáze extinkce ukázala dvě populace neuronů pCREB1/pERK– a pCREB1/pERK1, což naznačuje, že ERK je aktivována pouze v podskupině neuronů pCREB1. Důležité je, že podobné výsledky byly pozorovány v bazolaterální oblasti amygdaly (obr. 2G, F(3,29)=13,042, p, 0,0001; obr. 2H, F(3,29) {{32} },824, p=0,0201; Obr. 2I, F(3,29)=12,633, p, 0,0001; Obr. 2J, F(3,29)=12 0,505, p, 0,0001).

Dvoufázová aktivace ERK ve fázi extinkce ERK je upstream aktivátorem CREB, a proto je aktivace ERK nutná pro konsolidaci a opětovnou konsolidaci paměti strachu (Schafe et al., 200{{31 }}; Duvarci a kol., 2005). Nekonzistentně však nebyla pozorována žádná aktivace ERK v amygdale, hippocampu nebo mPFC ve fázi rekonsolidace, když byl pERK měřen 30 min po reaktivační relaci (obr. 2-4). Proto jsme zkoumali časové průběhy fosforylace ERK a CREB. Provedli jsme podobný experiment jako na obrázcích 2-4 s tím rozdílem, že hladiny pCREB a pERK byly měřeny 5, 15 a 3 0 min po reaktivaci (opětovné vystavení tmavému prostoru po dobu {{ 66}}, 1 nebo 1 0 min, obr. 5A). V souladu s údaji zobrazenými na obrázcích 2-4 bylo pozorováno významné zvýšení neuronů pCREB1 po 30 minutách, ale ne po 5 minutách, po reaktivaci v Recon (amygdala, mPFC a hippocampus) a Ext (amygdala a mPFC ) skupiny, ale ne skupina Tran (obr. 5E, jednosměrná ANOVA, amygdala, 5 min, F(3,23)=0,346, s. 0,05, 30 min, F(3,23)=15,272, p, 0,0001; mPFC, 5 min, F(3,23)=1,169, p. 0,05, 30 min, F(3,23)=32. 346, p, 0,0001; hippocampus, 5 min, F(3,23)=0,154, p. 0,05, 30 min, F(3,23)=16,197, p, 0,0001; nepárový t test, amygdala, rekonsolidace, 5 vs 30 min, t(12)=7,807, p , 0,0001, zánik, 5 vs 30 min, t(12)=5,405, p { {73}}.0002; mPFC, rekonsolidace, 5 vs 30 min, t(12)=5,727, p , 0,0001, zánik, 5 vs 30 min, t(12)=4,188 , p=0.0013; oblast hippocampu CA1, rekonsolidace, 5 vs 30 min, t(12)=2.339, p=0.0374).

Je zajímavé, že významné zvýšení neuronů pERK1 bylo pozorováno v amygdale, mPFC a hippocampu skupin Recon, Tran a Ext 5 minut po reaktivaci ve srovnání se skupinou NR (obr. 5F, amygdala, F(3,23)).=10.961, p=0.{28}}001; mPFC, F(3,23)=7,525, p { {13}}.0011; hippocampus, F(3,23)=6.924, p=0.0017). Tato pozorování ukázala, že ERK je aktivován okamžitě po reaktivaci ve všech fázích paměti. Tato zvýšení počtu neuronů pERK1 se však vrátila na bazální hladiny (srovnatelné se skupinou NR) 15 minut po reaktivaci (obr. 5F, amygdala, F(3,20)=2.676, s. 0,05; mPFC, F(3,23)=0,683, p. 0,05; hippocampus, F(3,20)=0,74, p. 0,05). Kromě toho, v souladu se zjištěními uvedenými na obrázcích 2-4, významně více neuronů pERK1 bylo pozorováno v amygdale, mPFC a hippocampu 30 minut po reaktivaci pouze ve skupině Ext (obr. 5F, amygdala, F( 3,23)=6.616, p=0.022; mPFC, F(3,23)=8.012, p=0.0008; hippocampus, F( 3,23)=6.206, p=0.003). Rekonsolidační a přechodové fáze tedy vykazují přechodnou aktivaci ERK pouze v časném časovém bodě (5 minut), zatímco fáze extinkce ukazuje bifázickou aktivaci ERK v časných (5 minut) a pozdních (30 minut) časových bodech po reaktivaci. zasedání. Tato pozorování ukázala, že mechanismy regulace aktivace ERK se liší ve fázích rekonsolidace/přechodu a zániku. Naše pozorování společně prokázala, že fáze rekonsolidace, přechodu a zániku vykazují odlišné molekulární podpisy.

Role aktivace ERK ve fázích rekonsolidace a zániku paměti IA

Fáze rekonsolidace/přechodu a extinkce vykazovaly monofázickou a bifázickou aktivaci ERK, v daném pořadí. Dále jsme zkoumali a porovnávali roli časné (5 min) a pozdní (30 min) aktivace ERK v mPFC ve fázi rekonsolidace a extinkce zkoumáním účinků inhibice ERK (obr. 6).

Diskuse

V této studii jsme zkoumali mechanismy pro přechod paměti z fáze rekonsolidace do fáze extinkce po získání paměti IA. Nejprve jsme charakterizovali behaviorální podpisy fází paměti IA po vyhledání. V souladu s naší předchozí studií (Fukushima et al., 2014) obnovením a zánikem paměti vyvolaným IA opětovným vystavením světlu (0 min v tmavém prostoru) a tmě ( 3 nebo 10 min) oddělení. Zajímavé je, že paměť IA nebyla ani zesílena, ani zhasnuta a vykazovala odolnost vůči inhibici syntézy proteinů, když byly myši znovu vystaveny tmavému kompartmentu pouze na 1 minutu. Tato pozorování tedy naznačují, že 1-min opětovné vystavení tmavému kompartmentu ruší indukci opětovné konsolidace, ale nestačí k uhašení paměti IA. Dále jsme zjistili, že ERK byla aktivována v amygdale, hippocampu a mPFC v časném časovém bodě (5 minut) po opětovné expozici tmavému kompartmentu po dobu 0, 1 nebo 10 minut. V souladu s tím inhibice ERK v těchto oblastech mozku blokovala rekonsolidaci/posílení a zánik IA paměti. Nejdůležitější je, že inhibice ERK v amygdale, hippocampu a mPFC po 1-min reexpozici tmavému kompartmentu dezinhibovala rekonsolidaci zprostředkované posílení paměti IA, což naznačuje, že aktivace ERK po krátkých (1 min) reexpozicích do tmavého kompartmentu je vyžadována pro inhibici opětovné konsolidace paměti IA. Naopak, 1-minutová reexpozice tmavému prostoru byla nedostatečná k uhašení paměti IA, ačkoli prodloužená reexpozice do tmavého oddílu (3 nebo 10 minut) tuto paměť uhasila. Naše výsledky proto naznačují, že 1-min opětovné vystavení tmavému kompartmentu indukuje proces přechodu paměti, který ruší rekonsolidaci/vylepšování, ale neiniciuje učení extinkce. Společně navrhujeme, že proces přechodu paměti přispívá k přepnutí fází paměti od opětovné konsolidace k zániku prostřednictvím ERK-zprostředkované prevence opětovné konsolidace.

Podobně jako u našich současných pozorování nedávná studie využívající podmiňování sluchového strachu ukázala, že jednotlivé (1) nebo prodloužené (10) prezentace CS indukují rekonsolidaci paměti a extinkci prostřednictvím zvýšení hladin pERK v bazolaterální oblasti amygdaly. Naproti tomu střední (4–7) CS prezentace nemění hladiny pERK v bazolaterální oblasti amygdaly. Důležité je, že inhibice ERK při středních prezentacích CS neovlivnila paměť strachu. Tato studie naznačila, že po obnovení paměti strachu dochází k přechodu fáze paměti od opětovné konsolidace k zániku (Merlo et al., 2018). V této studii jsme toto zjištění rozšířili a navrhli, že přechodná fáze aktivně přepíná paměťové fáze od opětovné konsolidace k zániku prostřednictvím aktivace dráhy přenosu signálu ERK. Na rozdíl od předchozích zjištění (Merlo et al., 2018) jsme zjistili, že přechodná fáze zahrnuje fosforylaci ERK v amygdale, hippocampu a mPFC. Tyto nesrovnalosti mohou být způsobeny rozdílem časových bodů zkoumajících fosforylaci ERK; předchozí studie měřila hladiny pERK 12 minut po prezentaci CS (Merlo et al., 2018), zatímco naše studie ukázala, že zvýšené hladiny pERK se vrátily na bazální úroveň přibližně v tomto časovém bodě (15 minut po opětovné expozici). Kromě toho je důležité poznamenat, že úloha IA umožňuje pozorování zlepšení paměti IA prostřednictvím opětovné konsolidace, což vede k našemu zjištění, že inhibice ERK v přechodné fázi deinhibuje zlepšení paměti IA.

Předchozí studie ukázaly, že fosforylace ERK je zvýšena v bazolaterální oblasti amygdaly za 20–60 minut po zánikovém učení paměti vyvolaného strachu (Herry et al., 2006; Merlo et al., 2014, 2018), zatímco hippocampus ukazuje tato aktivace v 1 hodině po extinkčním učení kontextové paměti strachu (Fischer et al., 2007; Tronson et al., 2009). V této studii jsme získali podobná pozorování, že pERK se zvyšuje 30 minut po reaktivaci ve fázi extinkce. Tato zjištění naznačují, že fosforylace ERK je běžným molekulárním podpisem fáze pozdní extinkce (20–60 minut).

Dále jsme pozorovali, že k aktivaci ERK dochází bifázicky v časných a pozdních časových bodech (5 a 30 minut) po reaktivační relaci ve fázi extinkce, zatímco tato aktivace nastává monofázicky v časném časovém bodě ve fázi rekonsolidace (obr. 5). . Důsledně inhibice ERK v oblastech mozku v těchto časových bodech fáze rekonsolidace a extinkce blokovala opětovné konsolidaci/posílení a dlouhodobé vymírání (obr. 6A, C–H). Tato pozorování naznačují, že pro posílení a zánik IA paměti je nutná monofázická a dvoufázová aktivace ERK. Je důležité poznamenat, že ERK funguje jako upstream regulátor fosforylace CREB. Přechodná aktivace ERK v rané paměťové fázi tedy může alespoň částečně přispívat k této fosforylaci CREB, která aktivuje expresi genů potřebných pro rekonsolidaci a dlouhodobé vymírání.

Podobně jako v našich předchozích zjištěních využívajících kontextové podmiňování strachu (Mamiya et al., 2009) byl CREB aktivován ve fázi rekonsolidace (amygdala/hippocampus/mPFC) a extinkce (amygdala/mPFC), zatímco ERK byl aktivován pouze ve fázi extinkce 30 minut po reaktivaci. V souladu s tím byla ve fázi rekonsolidace pozorována pouze jediná populace neuronů pCREB1/pERK–, zatímco ve fázi extinkce byly pozorovány odlišné populace neuronů: neurony pCREB1/pERK– a pCREB1/pERK1 v amygdale (obr. 2); neurony pCREB– /pERK1 v hipokampu (obr. 3); a neurony pCREB1/pERK–, pCREB– /pERK1 a pCREB1/pERK1 v mPFC (obr. 4). Tato pozorování, zejména kontrastní pozorování neuronů pCREB–/ pERK1 a pCREB1/pERK–, naznačují, že aktivace CREB a ERK je regulována odlišně v každé oblasti mozku, když paměť vyhasne, a že pozdní fáze aktivace ERK hraje specifickou a odlišnou Role pro zánik paměti strachu ve srovnání s jinými paměťovými procesy, jako je konsolidace a znovukonsolidace, jak je diskutováno níže. Je zajímavé, že jsme pozorovali, že neurony pERK1 byly hojnější v mPFC ve srovnání s hipokampem a amygdalou, protože mPFC vykazoval vyšší poměr neuronů pERK1 (fáze extinkce) a neuronů pCREB1 (fáze rekonsolidace) ve srovnání s hipokampem a amygdalou, což naznačuje, že aktivace ERK v mPFC hraje specifičtější roli při extinkci paměti.

Zůstává nejasné, zda jsou ve fázích paměti rekonsolidace, přechodu a zániku aktivovány stejné nebo různé populace neuronů. Předchozí studie identifikovala aktivaci „neuronů strachu“ a „neuronů zániku“ v amygdale, když je paměť vyvolaná strachem reaktivována nebo uhasena (Herry et al., 2008). Proto je možné, že ERK a CREB jsou aktivovány v různých populacích neuronů s různými časovými profily (tj. „neurony rekonsolidace“ a neurony zániku). Jak bylo diskutováno výše, neurony pCREB1, včetně neuronů pCREB1/pERK1, mohou regulovat znovukonsolidaci a dlouhodobé vymírání paměti IA prostřednictvím aktivace genové exprese jako rekonsolidačních a zánikových neuronů. Naopak aktivace ERK v neuronech pCREB–/pERK1 může přispět ke zrušení aktivace transkripce zprostředkované CREB, která by byla nutná pro rekonsolidaci, protože tato aktivace ERK je specificky pozorována v pozdní fázi extinkce; ERK se aktivoval v rekonsolidačních neuronech, aby zrušil aktivaci genové exprese ve fázi extinkce. Je zajímavé, že předchozí studie ukázala, že aktivace hipokampální ERK blokuje indukci c-fos, když je kontextová paměť strachu uhasena (Guedea et al., 2011), což zvyšuje možnost, že tato aktivace ERK antagonizuje signální dráhu CREB. Je důležité identifikovat neuronální populace, které regulují rekonsolidaci, přechod a zánik, a prozkoumat molekulární podpisy a funkční význam těchto neuronů. Navíc interakce mezi neurálními populacemi identifikovanými v této studii zůstávají neznámé. Je možné, že „extinkční (přechodové) neurony“ modulují funkci rekonsolidačních neuronů tak, aby rušily a bránily opětovné konsolidaci prostřednictvím interakcí mezi nimi (Eisenberg et al., 2003; Merlo et al., 2014). Proto je také důležité zkoumat tyto interakce v amygdale, mPFC a hippocampu a mezi nimi.

Dříve jsme ukázali, že hipokampus nevykazuje žádnou změnu fosforylace CREB a exprese Arc po extinkčním učení kontextuálního strachu, a konzistentně inhibice syntézy proteinů v hipokampu ve fázi extinkce neblokuje dlouhodobé vymírání (Mamiya et al. , 2009). Tato pozorování zvýšila možnost, že hipokampus není nutný pro dlouhodobé vyhynutí. Ukázali jsme však, že ERK se aktivuje v hipokampu po extinkčním učení paměti IA a důsledně blokování aktivace ERK v hipokampu zhoršuje dlouhodobé vymírání. Naše současná pozorování proto naznačují zásadní roli hipokampu při zániku paměti. Společně s našimi předchozími zjištěními navrhujeme, že hippocampus je nutný pro zánik paměti, ale ne pro proces podobný konsolidaci ke stabilizaci "paměti zániku" prostřednictvím aktivace genové exprese.