Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Pls klikněte zde pro část 1

Bylina Cistanche má velmi dobrý neuroprotektivní účinek

2.6. Antiapoptotické účinky cytokininů stanovené měřením aktivity kaspázy-3/7

Jak ukazují testy barvení PI popsané výše, SAL indukoval zvýšení úmrtnosti buněk SH-SY5Y. Protože SAL je spojena s apoptózou i nekrózou [51], zkoumali jsme také aktivaci kaspázy-3 a 7 (kasp{5}}/7) jako specifického markeru apoptózy (fáze provádění) [52] po vystavení buněk CK. Aktivity kaspázy-3/7 zaznamenané po léčbě každou z testovaných sloučenin byly normalizovány s ohledem na aktivity zaznamenané po léčbě 50{{30}} uM SAL (nastaveno jako 100 procento ). Jak je znázorněno na obrázku 4, dobře známý inhibitor kaspázy Ac-DEVD-CHO (zahrnutý jako specifická kontrola související s apoptózou) silně inhiboval aktivitu kaspázy-3/7 v submikromolárních koncentracích (na 36,3 ± 2,66 a 25,2 ± 2,69 procent hladin v buňkách ošetřených samotnou SAL v 0,05 a 0,5 uM, v daném pořadí). Podobné úrovně inhibice byly již dříve pozorovány [53] v různých in vitro modelech neurodegenerace založených na buňkách SH-SY5Y. Pozitivní kontrola NAC také významně snížila aktivitu kaspázy-3/7 na 88,7 ± 1,87 procenta a 78,5 ± 2,56 procenta hladin indukovaných SAL při 100 uM a 1000 uM, v daném pořadí. Testované CK měly širokou škálu účinků na aktivity kaspázy{50}/7. Je zajímavé, že pokud jde o CK ribosidy, pouze cZR měl významný vliv na aktivity při 0,1 uM (snížil je na 83,3 ± 4,33 procent hladin vyvolaných SAL), zatímco iPR v 1 uM neměl signifikantní snížení kasp{60}} ,7. Nakonec K3G snížila aktivitu kaspázy-3/7 s maximálním účinkem při 10 uM (na 81,7 ± 4,31 procent hladiny indukované SAL). Celkově SAL indukoval 1,{73}}násobný nárůst aktivity kaspázy-3/7 ve srovnání se zdravými kontrolními buňkami (CTR, obrázek 4), v souladu s výsledky dřívější studie, ve které byla podobná Byla použita koncentrace SAL (400 uM) a stejná buněčná linie [54]. Je známo, že NAC ovlivňuje aktivitu kaspázy{79}/7 v několika modelechneuronálnísmrt [55–58]. Zde prezentované výsledky však poskytují první demonstraci jejich kaspázy-3/7 na SH-SY5Y buněčném modelu indukovaném SALneuronálnísmrt. Pozitivní kontrola snižovala aktivitu kaspázy{0}/7 indukovanou 500 uM SAL podobným způsobem jako CK, ale cZR a K3G byly účinné i při submikromolárních nebo mikromolárních koncentracích. Další studie se stresovými modely souvisejícími s PD (inhibitor proteazomu MG 132- nebo H2O{7}}indukovaný toxicitou v buňkách SH-SY5Y [17] a fibroblastech [15]) a Huntingtonovou chorobou (model hladovění v séru Buňky PC12 [19]) také ukázaly, že CK K a tZR mohou mít antiapoptotické (kaspázové-3) aktivity [17] a že K i tZR mohou mít antisenescence [17,19]. . Navíc spojení mezi klesající aktivací casp{21}},7 aneuroprotektivníaktivity byly hlášeny pro SAL a modely související se SAL [54,59,60].

Obrázek 4. Aktivita kaspázy-3/7 v modelu PD indukovaném SAL. Triplikáty za alespoň čtyři nezávislé dny. * P ve srovnání s vozidlem s 500 uM SAL, # P ve srovnání s vozidlem bez 500 uM SAL.

2.7. Identifikace cytokininové neuroprotektivní aktivity v modelu buněčné smrti indukované glutamátem

Jelikož buňky SH-SY5Y neexprimují všechny podjednotky NMDA receptoru [61], nejpravděpodobnějším mechanismem toxicity glutamátu (Glu) je blokáda cystin/glutamátového Xc-antiporteru s masivní indukcí oxidačního stresu [62]. Předchozí autoři již prokázali souvislost mezi glutamátem indukovanou buněčnou smrtí a nekroptózou v buňkách SH-SY5Y [63] a důležitost aktivace kaspázy-3 v toxicitě vůči nim vyvolané glutamátem [62,64]. Několik studií také prokázalo výskyt železem řízené buněčné smrti (ferroptózy) po intoxikaci glutamátem [62,65,66] a ukázaly výskyt tří typů buněčné smrti (nekropóza, apoptóza a ferroptóza) po blokádě Xc. - antiportérový systém. Aby bylo možné dokončit komplexní hodnoceníneuroprotektivnípotenciál testovanéhocytokininyglutamátem indukovaný testovací systém buněčné smrti byl zahrnut do analytického panelu se známýmineuroprotektivníchelátor železa deferoxamin (DFO) a inhibitor nekroptózy nekrostatin-1 (NEC-1) [67] jako pozitivní kontroly. Zde byly buňky SH-SY5Y diferencovány po dobu 48 hodin, poté byly ošetřeny 160 mM Glu nebo společně s různýmicytokininkoncentrace ({{0}}.1–10 uM) po dobu 24 hodin a obarveny PI. V tomto modelu byl účinek Glu na buněčnou smrt 100% PI signál, takže bylo hodnoceno snížení buněčné smrti testovanými sloučeninami. Glu vyvolal téměř 4-násobný nárůst buněčné smrti ve srovnání se zdravými kontrolami SH-SY5Y (26,1 ± 0,42 procent). Screening pozitivních kontrol acytokininyodhalili, že obě pozitivní kontroly NEC-1 (50 uM, 76,6 ± 2,51 procenta) a DFO (10 uM, 84,2 ± 4,54 procenta) snížily buněčnou smrt vyvolanou glutamátem. Jak je znázorněno na obrázku 5A, z panelucytokininy, jen třicytokininydokázali ochránitneuron-jako buňky SH-SY5Y podobným způsobem jako pozitivní kontroly. Nejaktivnějšícytokininybyly trans-zeatin (tZ) (0,1 uM, 79,5 ± 2,91 procenta; 1 uM, 81,3 ± 2,77 procenta) a cis-zeatin (CZ) (0,1 uM, 82,1 ± 3,29 procenta ; 1 uM, {{20}},2 ± 2,89 procenta) a kinetin (K) (1 uM, 88.0 ± 3,76 procenta; 10 uM, 79,9 ± 3,44 procenta). K potvrzení jejich slibné aktivity byl k podrobnějšímu objasnění biologických účinků CK v tomto modelu použit ortogonální test: Test uvolňování laktátdehydrogenázy (LDH) [68], který také ukázal dramatický (4-násobek) zvýšení toxicity po léčbě Glu. Je zajímavé, že stanovení uvolňování LDH nám umožnilo rozlišit mezi aktivitami CK a pozitivními kontrolami (NEC-1 a DFO). CK měly mírnou, ale významnou ochrannou aktivitu (tZ snížil úmrtnost na 91,9 ± 1,40 procenta při 0,1 uM; cZ je snížil na 92,3 ± 1,15 procenta při 0,1 uM a 91,7 procenta ± 1,56 procenta při 1 uM; K2 ± 92. 1,06 procenta při 1 uM). Pozitivní kontroly NEC-1 a DFO měly silnější ochranné účinky, ale byly účinné při mnohem vyšších koncentracích (snížení míry na 76,9 ± 2,94 procent a 81,6 ± 3,74 procent při 50 a 10 uM, v daném pořadí) (obrázek 5B). Test LDH potvrdil indikace získané barvením PI a pozorované účinky pozitivních kontrol byly v souladu s publikovanými údaji [69,70]. Zjištění týkající se účinků K v modelu buněčné smrti indukované Glu v buňkách HT22 [18] a naše pozorování účinků reprezentativních CK, jako jsou tZ, cZ a K, ukazují, že CK jsou slibnými kandidáty pro léčbu neurodegenerativních onemocnění spojených s oxidačním stresem [18] 71]. Nakonec byly preferovány tZ a cZ, protože byly účinné při nižších koncentracích a byly vybrány spolu s K pro další studie jejich účinků na hladiny oxidačního stresu a aktivaci kaspázy-3,7.

cistancherecenzeo účincíchneuroprotekce

2.8. Účinky cytokininů na oxidační stres indukovaný Glu v buňkách SH-SY5Y

Na rozdíl od předchozího modelu může Glu vyvolat oxidační stres v buňkách SH-SY5Y různými cestami. Jedna je založena na blokádě antiporteru Cystin/glutamát (Xc-), což vede k depleci glutathionu (GSH) a negativním účinkům na aktivitu superoxiddismutázy (SOD) [62]. Buněčná smrt zprostředkovaná Glu také pravděpodobně zahrnuje tvorbu ROS (zejména superoxidového radikálu) řízenou Rac-NADPH-oxidázou v buňkách SH-SY5Y [72]. Tato zjištění ukazují, že primární příčinou buněčné smrti v Glu-indukovaném modelu je OS. V rámci modelu,neuronbuňky podobné Glu byly společně ošetřeny Glu a testovanými sloučeninami, obarveny DHE a pozorovány fluorescenční mikroskopií. Jak je vidět na obrázku 6A, v buňkách ošetřených Glu byl pozorován dramatický nárůst červené fluorescence DHE, který byl zlepšen pozitivními kontrolními látkami a testovanými CK. Na základě mikroskopického pozorování byla kvantifikace hladin superoxidu provedena v buňkách indukovaných Glu podobným způsobem, pomocí testu DHE, jako v buňkách indukovaných SAL. Výsledky byly normalizovány s ohledem na hladiny indukované samotným Glu (nastaveno jako 100 procent), což způsobilo dramatický, téměř 3-násobný nárůst hladin superoxidu během pouhých 4 hodin vneuron-jako buňky SH-SY5Y vzhledem k hladinám ve zdravých kontrolních buňkách (CTR: 33,79 ± 1,45 procenta). Jak je znázorněno na obrázku 6B, CK jako tZ, cZ a K významně snížily hladinu superoxidu v buňkách intoxikovaných Glu: 0,1 uM tZ, 0,1 uM cZ, 1 uM a 10 uM K ji snížil na 81,0 ± 4,03, 80,6 ± 3,89, 81,8 ± 3,39 a 83,8 ± 2,32 procent hladin v buňkách ošetřených samotným Glu. Tyto hladiny jsou srovnatelné s hladinami získanými s inhibitorem nekroptózy NEC-1 (80,5 ± 3,19 procent při 5 uM a 80,4 ± 2,70 procenta při 50 uM) a chelátoru železa DFO (80,2 ± 3,80 procent při 10 uM). Výsledky získané pomocí modelu buněčné smrti indukované Glu, zejména účinky pozitivních kontrol, jsou v souladu s předchozími zprávami [70,73]. Předchozí důkazy, že CK mají účinky na snížení OS v Glu-indukovaných nebo podobných modelech, se omezují na prokázání, že K je silné činidlo snižující OS (přibližně 23 uM) v modelu buněčné smrti indukované Glu na HT22 buňkách [18] ]. Zjistili jsme, že K měl účinek na snížení OS při nižších koncentracích (1–10 uM) v našich buňkách SH-SY5Y. Kromě toho byly pozorovány příznivé dlouhodobé účinky tZ na lidské fibroblasty, včetně aktivity rozkladu peroxidu vodíku [15], což naznačuje, že tZ a cZ mohou mít nepřímé účinky na snížení OS v modelech buněčné smrti indukované Glu. Další zprávy navíc poukazovaly na souvislosti mezi účinkem na snížení OS zprostředkovaným CK a ochrannou aktivitou [22,74–76]. Celkově vzato, tZ, cZ a K vykazovaly překvapivě silné účinky na snížení OS, srovnatelné s účinky pozitivních kontrol, a to i přes rozdílné síly celkověneuroprotektivníúčinek.

Obrázek 5. (A) Úmrtnostneuron-jako SH-SY5Y buňky v glutamátem (Glu)-indukovaném modelu buněčné smrti; (B) Glu-indukovaná toxicita (uvolňování LDH).neuron-jako buňky SH-SY5Y. Triplikáty v alespoň třech nezávislých dnech.* P ve srovnání s vehikulem se 160 uM Glu, # P ve srovnání s vehikulem bez 160 uM Glu.

Obrázek 6. (A) Glu-indukovaný oxidační stres (OS) a aktivita indikovaných sloučenin na snížení OS u člověkaneuron-jako buňky SH-SY5Y vizualizované fluorescenční mikroskopií po značení dihydroethidiem (DHE). Pruhy=50 um. Obrázky ukazujíneuron-jako buňky SH-SY5Y ošetřené DMSO (kontrola), 160 mM glutamátem (Glu) samotným a společně s: 10 uM deferoxaminem (plus DFO), 50 uM nekrostatinem{{6} } ( plus NEC -1), 0,1 uM tZ ( plus tZ) a 0,1 uM cZ ( plus cZ) po dobu 4 hodin, poté obarveno DHE. (B) Glu-indukovaná tvorba superoxidových radikálů vneuron-jako buňky SH-SY5Y po ​​4 hodinách. Graf zobrazuje kvantifikaci buněk obarvených DHE pomocí čtečky mikrodestiček Infinite M200 Pro (Tecan, Rakousko). Triplikáty za pět nezávislých dnů.

* P ve srovnání s vehikulem se 160 uM Glu, # P ve srovnání s vehikulem bez 160 uM Glu.

2.9. Účinky cytokininů na aktivitu kaspázy-3/7 v modelu buněčné smrti indukované Glu

Glu má podobné toxické účinky na buňky SH-SY5Y jako dříve uváděné účinky na buňky HT22 spojené s blokádou Xc-antiporteru. V obou případech se tedy účastní mechanismy neapoptotické buněčné smrti (ferroptóza, nekroptóza atd.) [62], i když exprese kaspázy-3 a do určité míry i NMDA podjednotka NR1 se může vyskytovat silněji u SH -SY5Y buňky [61]. Proto se konečná stádia buněčné smrti v těchto dvou buněčných liniích mohou lišit. V mnoha studiích na Glu-indukovaném modelu buněčné smrti buněk SH-SY5Y byla pozorována spoluúčast aktivity kaspázy{11}} [62,77–79]. V tomto testuneuronBuňky podobné SH-SY5Y zde byly ošetřeny 160 mM Glu, což vede ke zvýšení aktivity kaspázy-3/7. Ve snaze objasnit roli apoptózy v Glu-indukované smrti buněk SH-SY5Y byl aplikován specifický inhibitor kaspázy-3/7, Ac-DEVD-CHO, a bylo zjištěno, že má silný inhibiční účinek: Při 50 nM snížilo aktivitu kaspázy-3,7 na 23,70 ± 1,01 procenta hladiny v ošetřených buňkách

se samotným Glu a při 0,5 uM téměř úplně zablokoval aktivitu (snížil ji na normalizovanou úroveň pouze 7,22 ± 1,05 procenta; srovnatelné s hladinou pozorovanou u zdravých buněk:

7,8 ± 0,39 procenta), jak je znázorněno na obrázku 7. Aplikace pozitivních kontrol vedla k postupnému na dávce závislému poklesu aktivity kaspázy-3,7. Je zajímavé, že NEC-1 měl mírný účinek s maximálním účinkem při 50 uM a DFO měl silnější inhibiční aktivitu při 10 uM (snížení aktivity na 80,5 ± 1,85 a 75,8 ± 3 .00 procent). Na druhou stranu jen nepatrných, ale významných účinků na casp-3,7 bylo dosaženo pomocí tZ při 1 uM (89,5 ± 2,50 procenta), cZ při 0,1 uM (87,4 ± 1,62 procenta) a K při 1 uM ( 91,0 ± 2,06 procenta). Celkově výsledky ukazují, že obě pozitivní kontroly měly silnější aktivitu snižující aktivitu kaspázy-3/7 než testované CK, ale CK měly účinky při mnohem nižších koncentracích. Celkově výsledky naznačují, že modulace aktivity kaspázy{40}/7 hraje klíčovou roli v účinnémneuroprotektivníaktivita činidel, jako je DFO [58] v Glu-indukovaném modelu buněčné smrti [79,80]. Jak je však uvedeno v této části, NEC-1 také mělneuroprotektivníaktivity, což naznačuje, že na Glu-indukované smrti buněk SH-SY5Y podobných neuronu by se mohly podílet i jiné typy buněčné smrti [63,67,81]. V analýzách účinků NEC-1 [70], DFO [69] a K [18] na buňky HT22 byly také získány náznaky, že mechanismy nezávislé na kaspáze se podílejí na buněčné smrti indukované Glu.

Obrázek 7. Aktivita kaspázy-3/7 v Glu modelu oxidačního poškozeníneuron-jako buňky SH-SY5Y. Triplikáty za alespoň čtyři nezávislé dny. * P ve srovnání s vehikulem se 160 uM Glu, # P ve srovnání s vehikulem bez 160 uM Glu.

3. Závěry

Stručně řečeno, naše studie odhalila, že CK a jejich metabolity majíneuroprotektivníaktivity v modelu indukovaném SALParkinsonova chorobaa Glu-indukované oxidační poškození u lidských diferencovaných SH-SY5Yneuronálníbuňky. Bylo zjištěno, že K3G, cZR a iPR jsou biologicky významnéneuroprotektivníčinnosti. Kromě toho byly aktivní CK účinné při nižších (submikromolárních a mikromolárních) koncentracích než pozitivní kontrolní látka NAC. K3G, cZR a iPR měly také pozitivní účinky na životaschopnost, cytotoxicitu, oxidační stres a aktivitu kaspázy-3,7 (kromě iPR). Ortogonální demonstrace silně ukazují, že aktivita antioxidačního stresu hraje klíčovou roli v ochranných účincích CK v modelu buněčné smrti indukované SAL. Pouze tři metabolity v testovaném panelu CK (tZ, cZ a K) byly chráněnyneuron-jako SH-SY5Y buňky v Glu-indukovaném modelu oxidativního poškození podobným způsobem jako u chelátoru železa NEC1 a inhibitoru nekroptózy DFO. Abychom potvrdili jejich slibnou aktivitu, testovali jsme jejich účinky v testu uvolňování ortogonální laktátdehydrogenázy (LDH). CK měly mírnou, ale významnou protektivní aktivitu. To bylo slabší než odpovídající aktivity kontrolních látek, ale navzdory rozdílům v modulacineuronálnízdraví všechny tři testované CK stimulovaly silné snížení tvorby superoxidových radikálů, podobně jako pozitivní kontrolní látky. CK měly také srovnatelné účinky na oxidační stres indukovaný Glu v buňkách SH-SY5Y jako NEC1 a DFO, ale tyto sloučeniny měly silnější inhibiční účinky na aktivitu kaspázy-3/7 než CK. Vzhledem k tomu, že buněčná smrt indukovaná Glu se nespoléhá na dráhu závislou na kaspáze, jak ukazují studie účinků DFO a NEC-1 na HT-22 buňky [70], mohou CK zjevně modulovat obě kaspázové závislá a nezávislá buněčná smrt snížením oxidačního stresu [18,82]. V probíhajících studiích je podrobně popsán mechanismus působení CK a/nebo jejich mitochondriální účinky naneuronálnínebo astrocytární buňky budou zkoumány.

cistancheZkušenostiproPDaPaměť

4. Materiály a metody

4.1. Chemikálie a činidla

Cytokininstandardy byly získány od OlChemIm (Olomouc, Česká republika). Calcein AM (1 mg/ml roztok) a souprava pro uvolňování LDH a souprava pro růst Neurite byly zakoupeny od společnosti ThermoFisher. Propidium jodid, dihydroethidium, složky kaspázového - 3/7 testovacího pufru, médium DMEM/F12 1:1, fetální bovinní sérum, trypsin, ATRA, salsolinol hydrobromid, glutamát monosodná sůl, deferoxamin, N-acetylcystein Ac-DEVD-CHO a DMSO pro buněčné kultury byly zakoupeny od Sigma Aldrich (Merck). Substrát Ac-DEVD-AMC dodal Enzo Life Science.

4.2. ORAC Radical Scavenging Activity Assays

Schopnost sloučenin pohlcovat volné radikály in vitro byla stanovena testem Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC). Stručně, fluorescein (100 ul, 500 mM) a 25 ul roztoku testované sloučeniny byly přidány do 96-jamkové mikrodestičky předem inkubované při 37 °C. Dále 25 ul 250 mM 2,2<-azobis(2-amidino-propane)dihydrochloride (aaph)="" was="" quickly="" added,="" the="" microplate="" was="" shaken="" for="" 5="" s="" and="" red="" fluorescence="" (with="" 485="" and="" 510="" nm="" excitation="" and="" emission="" wavelengths,="" respectively)="" was="" measured="" every="" 3="" min="" over="" 90="" min="" using="" an="" infinite="" 200="" microplate="" reader="" (tecan,="" männedorf,="" switzerland).="" nauc="" (net="" area="" under="" curve)="" values="" were="" used="" to="" express="" antioxidant="" activities="" relative="" to="" that="" of="" trolox="" (a="" synthetic="" hydrophilic="" analog="" of="" α-tocopherol,="" vitamin="" e).="" substances="" with="" orac="" values="" greater="" than="" zero="" are="" deemed="" to="" actively="" trap="" free="">

4.3. Buněčná kultura SH-SY5Y

Lidská neuroblastomová buněčná linie SH-SY5Y zakoupená od ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) byla pěstována v Dulbeccově modifikovaném Eagle's Medium a Ham's F12 Nutrient Mixture (DMEM: F-12, 1:1 ), doplněné 10 procenty fetálního bovinního séra (FBS) a 1 procentem penicilinu a streptomycinu při 37 °C ve zvlhčené atmosféře 5 procent CO2. Buňky byly pasážovány až 20krát a média byla měněna dvakrát nebo třikrát týdně. Hustota buněk byla nastavena jako vhodná pro plánovaný test (5000, 7{18}}, 10 000 nebo 20 000 buněk na jamku) v 96-vícejamkových destičkách v celkových 100 ul objemu média pro každou experiment. Den po naočkování byla k buňkám přidána ATRA v 1% médiu FBS DMEM/F12 na konečnou koncentraci 10 uM a inkubace pokračovala dalších 48 hodin, aby se vyvolala diferenciace, umožnila se tvorba delších neuritů a snížilo se proliferace.

4.4. Mikroskopie

Mikrofotografieneuron-jako buňky SH-SY5Y byly získány pomocí fluorescenčního mikroskopu DM IL LED (Leica Microsystems, Mannheim, Německo) s vhodným excitačním filtrem pro test nebo nastavením pro světlé pole s vysoce výkonným digitálním fotoaparátem DP73 (Olympus, Tokio, Japonsko ). Protože poměr signálu k šumu pro barvení byl mírný, kontrast byl mírně upraven v softwaru ImageJ (Fiji), aniž by to ovlivnilo výsledné pozorování. Originální obrázky jsou součástí doplňkových materiálů.

4.5. Barvení buněčné membrány (Neurite Outgrowth kit, Invitrogen™)

NeuronBuňky podobné SH-SY5Y (5000 buněk na jamku) získané 48 hodinovým diferenciačním postupem byly obarveny soupravou Neurite outgrowth kit (Invitrogen™) podle doporučení výrobce s menšími úpravami. Buňky byly promyty PBS, označeny roztokem barviva pro barvení membrán dodaným se soupravou (podle protokolu pro 96 vícejamkové destičky) v PBS po dobu 20 minut při 37 °C, znovu promyty PBS a pozorovány pod fluorescenčním mikroskopem ( s excitačními a emisními vlnovými délkami 533 nm a 585 nm).

4.6. Buněčná léčba

Po diferenciační proceduře bylo diferenciační médium vyměněno za 1% médium DMEM/F12 doplněné testovanými sloučeninami v koncentracích 0.1, 1 a 10 uM (se 7000 buněk na jamku pro testy cytotoxicity), nebo spolu s toxinem SAL v koncentraci 500 uM (se 7000–10 000 buňkami na jamku) nebo 160 mM Glu (s 20 000 buňkami na jamku) po dobu vhodnou pro daný typ testu (životaschopnost, buněčná smrt atd.). Kontrolní buňky byly ošetřeny médiem obsahujícím 0,0,1 procenta DMSO.

4.7. Buněčná životaschopnost a buněčná smrt

ŽivotaschopnostneuronBuňky podobné SH-SY5Y rostoucí v 96-jamkových mikrotitračních destičkách (s cca 7000 buněk na jamku) po 24 hodinách působení byly hodnoceny testem Calcein AM s menšími úpravami [31]. Použitý roztok Calceinu AM v PBS měl koncentraci 0,75 uM a inkubační doba byla nastavena na 50 minut. Počet živých buněk v každé jamce byl stanoven pomocí čtečky mikrodestiček Infinite M200 Pro (Tecan, Rakousko) s excitačními a emisními vlnovými délkami 495 nm a 517 nm.

Buněčná smrtneuron-podobné buňky (SAL model: 10,000 buněk na jamku; Glu-model: 20,000 buněk na jamku) byl stanoven PI testem, jak uvádí Stone et al. 2003 s malou úpravou [83]. Stručně řečeno, médium modelu indukovaného SAL bylo odsáto a změněno na roztok 1 ug/ml PI v PBS, ale buňky podrobené indukci Glu mají slabší adherenci, takže se do roztoku přidal 1 mg/ml roztok PI v PBS. poskytují konečnou koncentraci 1 ug/ml. V obou případech byly buňky inkubovány dalších 15–25 minut při pokojové teplotě, poté byla PI fluorescence měřena čtečkou Infinite M200 Pro (Tecan, Grödig, Rakousko) s excitačními a emisními vlnovými délkami 535 a 617, v daném pořadí. Výsledná PI fluorescence získaná se samotnými toxiny byla nastavena jako 100% buněčná smrt.

4.8. Měření oxidačního stresu testem Dihydroethidium (DHE).

Buňky byly diferencovány a ošetřeny tak, jak je popsáno v předchozí části pro indukci SAL (10, 000 buněk na jamku, 24 h nebo indukce Glu (20, 000 buněk na jamku, 4 h). Po při ošetření byly buňky centrifugovány při 500 xg po dobu 330 s, poté bylo kultivační médium nahrazeno (po aspiraci) 10 uM roztokem DHE v PBS. 96-vícejamkové destičky s buňkami byly inkubovány ve tmě po dobu 30 minut při pokojové teplotě teplota, pak byla fluorescence DHE měřena čtečkou mikrodestiček Infinite M200 Pro (Tecan, Grödig, Rakousko) s excitační a emisní vlnovou délkou 500 nm a 580 nm. Výsledná fluorescence DHE získaná se samotným SAL nebo Glu byla nastavena jako 100% superoxidový radikál Ilustrativní fluorescenční mikrofotografie buněk obarvených DHE byly získány po měření DHE pomocí čtečky mikrodestiček.

Rostlina Cistanche má velmi dobrý neuroprotektivní účinek

4.9. Měření aktivity kaspázy-3/7

Jednokrokové testy kaspázy-3/7 byly provedeny podle dříve publikovaného postupu [84]. U kultur podrobených SAL-indukci a Glu-indukci byly reakční směsi (kaspázový-3,7 pufr a složky s buňkami v 96-vícejamkových destičkách) inkubovány 2 h a 3 h při 37 oC, respektive. Aktivita kaspázy-3/7 byla poté měřena pomocí čtečky mikrodestiček Infinite M200 Pro (Tecan, Rakousko) s excitačními a emisními vlnovými délkami 346 nm a 438 nm.

4.10. Statistická analýza

Experimenty byly provedeny v triplikátech a opakovány ve třech až pěti (n {{0}}–5) nezávislých dnech. Všechna data jsou vyjádřena jako průměr ± SEM. Hodnoty pro všechny měřené proměnné jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM, které byly vypočteny pomocí Prism 8.4.3 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA), který byl také použit pro generování obrázků. Statistická analýza byla provedena pomocí softwarového balíku PAST (ver. 1.97) [85]. Pro diferenciační experiment byl použit Studentův t-test. Zbytek experimentů byl vyhodnocen neparametrickým Kruskal–Wallisovým testem s Mann–Whitney post hoc testem se sekvenční Bonferroniho korekcí. Hodnota p < 0,05="" byla="" považována="" za="">

Doplňkové materiály: Originální obrázky jsou k dispozici online.

Příspěvky autorů: Příspěvky autorů byly následující: Výzkum, metodologie, validace, analýza dat, GG, CWD a JG; psaní – příprava původního návrhu GG, CWD a MS; kurátorství dat, získávání finančních prostředků, dohled, psaní – recenze a úpravy, CWD, MS a PK Všichni autoři si přečetli publikovanou verzi rukopisu a souhlasí s ní.

Financování: Tato práce byla částečně finančně podpořena granty Interní grantové agentury Univerzity Palackého v Olomouci, Česká republika (IGA{{0}}PrF_2020_021), České grantové agentury ({{ 2}}S) a Evropský fond pro regionální rozvoj – projekt ENOCH (č. CZ.02.1.01/0.0/0.0/ 16_019/ 0000868) a studentský grant Nadačního fondu Univerzity Palackého.

Prohlášení institucionální revizní komise: Neuplatňuje se.

Prohlášení o informovaném souhlasu: Neuplatňuje se.

Prohlášení o dostupnosti dat: Data jsou obsažena v článku nebo doplňkovém materiálu.

Poděkování: Autoři děkují Ditě Jordovd, Janě Hrubešovd a Lucii Koplikovd za vynikající technickou pomoc. Autoři navíc děkují Sees-editing Ltd., Spojené království za anglickou úpravu rukopisu.

Konflikt zájmů: Autoři neprohlašují žádný střet zájmů.

Dostupnost vzorků: Vzorky sloučenin nejsou u autorů k dispozici.