Část 2: Verbascoside chrání pankreatické buňky před ER-stresem
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Alessandra Galli 1, plus , Paola Marciani 1, plus , Algerta Marku 1, Silvia Ghislanzoni 1, Federico Bertuzzi 2, Rafaella Rossi 3, Alessia Di Giancamillo 3, Michela Castagna 1 a Carla Perego 1,*
Pls Klikněte zde zpět na část 1
3.4 Moduláty verbascosidu – mitochondriální aktivita a dynamika buněk
Testy životaschopnosti MTT naznačují možný dopadverbascosidepřímo na mitochondriích, což zajišťuje vazbu sekrece inzulínu na stav výživy a přežití buněk v tomto typu buněk. Tvar a membránový potenciál jsou markery mitochondriálního zdraví [42]. Nejprve jsme hodnotili potenciál mitochondriální membrány tak, že jsme buňky označili pomocí MitoSpyw Orange CMTMRos, propustného barviva, jehož koncentrace závisí na potenciálu vnitřní mitochondriální membrány, zatímco MitoSpyw Green FM byla použita k normalizaci dat na mitochondriální hmotu (obrázek 4A, B). Membránový potenciál mitochondrií vverbascoside-ošetřené buňky se zvýšily ve srovnání s kontrolou v bazálních i stresových podmínkách. Zajímavě,verbascosidemetabolity vykazovaly různé účinky. Cafe acid nezlepšila mitochondriální potenciál, zatímco hydroxytyrosol způsobil na dávce závislé poškození mitochondriální funkce, v souladu s údaji o životaschopnosti buněk byl takový účinek patrnější po expozici H2O2 (obrázek S3).
Protože funkce úzce souvisí s morfologií, měřili jsme Feretův průměr, plochu a kruhovitost mitochondrií. Akutní oxidační stres podporuje rozsáhlé štěpení mitochondrií, což vede k menším cirkulárním mitochondriím [42]. Za podmínek stresu H2O2 byly mitochondrie buněk ošetřených verbascosidem více protáhlé a vykazovaly zvýšený povrch než kontrolní (obrázek 4C, D a obrázek S4). Mitochondriální cirkularita byla nižší u buněk ošetřených verbascosidem než u kontrol a rozdíly byly patrnější u buněk ošetřených H2O2 (obrázek S3), což opět potvrzuje ochrannou roli polyfenolu.
Schopnost těchto organel modifikovat svůj tvar v reakci na nutriční stavy nebo stresové podmínky je pod kontrolou fúzních a štěpných událostí a vyžaduje mitochondriální motilitu [39]. Sledování pohybů mitochondrií nás vedlo k výpočtu kumulativní ušlé vzdálenosti a analýza odhalila významné zvýšení dynamiky mitochondrií v buňkách ošetřených verbascosidem ve srovnání s kontrolou, již v bazálních podmínkách (obrázek 4E, F a videa S1–S4). Účinek byl výraznější po léčbě H2O2, skutečně předléčení verbascosidem téměř úplně vrátilo dopad oxidačního stresu na mitochondriální dynamiku.
Celkově tato data silně podporují klíčovou roli verbascosidu při zajišťování dynamiky mitochondrií, která je zásadní pro podporu rychlé adaptace této organely na stresové podmínky.
3.5 Vliv verbascosidu na přežití a funkci člověka Langerhans
S ohledem na translační potenciálverbascosideaplikací v lidském zdraví jsme ověřili jeho dopad na lidské izolované Langerhansovy ostrůvky, což je relevantnější model pro fyziopatologické a farmakologické studie na buňkách. Izolované ostrůvky byly ošetřeny 16 uM verbascosidem po dobu 5 dnů a byl vyhodnocen potenciál mitochondriální membrány. Jak je uvedeno na obrázku 5A, zatímco potenciál organel byl ohrožen u kontrolních lidských ostrůvků po expozici H2O2, vnitřní membránový potenciál mitochondrií u ostrůvků předem ošetřených verbascosidem se významně nesnížil, což podporuje hypotézu ochranné role verbascosidu proti ROS-indukovaným - buněčná dysfunkce. Analýza exprese ER-stresových markerů ukázala důležitou redukci P-eIF2 frakce ve dvou odlišných ostrůvkových preparátech udržovaných v 16uM verbascosidu, což potvrzuje downregulaci této dráhy také v lidských vzorcích (obrázek 5D). Příznivé účinky léčby polyfenolem byly potvrzeny zvýšeným obsahem inzulínu pozorovaným u ostrůvků ošetřených verbascosidem ve srovnání s kontrolami (obrázek 5B). Rozptyl dat v našich experimentech neumožnil prokázat žádný významný rozdíl v glukózou stimulované sekreci inzulínu (GSIS) u ostrůvků ošetřených verbascosidem, ačkoli se zdá, že pozitivní trend je zřejmý jak za bazálních, tak za stresových podmínek (obrázek 5C).
4. Diskuze
Oxidační stres a zánět jsou základem dysfunkce buněk vyskytující se během T2D [43,44] jako takové, funkční potraviny, nutraceutika a fytochemikálie byly zkoumány jako nástroje k prevenci diabetu 2. typu [45]. V této práci jsme se zaměřili na verbascosid, o kterém je známo, že má protizánětlivé a antioxidační aktivity v neuronech [18]. Navzdory vysoké strukturální složitosti byly verbaskosid a isoverbaskosid nalezeny v krevní plazmě potkanů krmených extraktem z Lippia citriodora spolu s některými metabolity [20]. Kromě toho byla v buněčné linii rakoviny prsu SKBR3 zjištěna buněčná akumulace verbascosidu a je verbascosidem [23] a studie provedené na buňkách Caco{12}} ukazují, že mírná množství verbascosidu a isoverbascosidu zůstávají po in vitro trávení nedotčená a biologicky dostupná. proces. Kromě toho může Caco{13}} absorbovat obě molekuly rychlým a lineárním transportem v rozsahu 10 až 100 uM [22]. Nebyly hlášeny žádné údaje o biologické dostupnosti verbascosidu u lidí, a přesto výše uvedené studie naznačují, že může být proveditelné, aby nemetabolizovaný verbascosid procházel střevní bariérou, cirkuloval v krevní plazmě a měl antioxidační účinky na endokrinní buňky slinivka břišní.
Zjistili jsme na dávce závislou (0,8–16 uM) protektivní roli verbascosidu na klonálních a lidských buňkách, a to jak za bazálních, tak za stresových podmínek. Tento účinek je způsoben samotným verbascosidem a nikoli jeho metabolity kofeinová kyselina a hydroxytyrosol, které se ve skutečnosti jeví jako cytotoxické při koncentraci 16 uM. Koncentrace prokázané jako účinné v našich experimentech jsou v souladu s koncentracemi popsanými u zvířat krmených verbascosidem [20].
Ačkoli nevíme, zda verbaskosid působí extracelulárně vazbou na membránový receptor nebo je internalizován endocytózou a působí intracelulárně, naše údaje potvrzují, že verbaskosid má antioxidační a protizánětlivé vlastnosti a chrání buňky před dysfunkcemi spojenými se stresem ER snížením UPR a podpora mitochondriální dynamiky.
Skutečně jsme detekovali významný pokles obsahu ROS v buňkách ošetřených verbascosidem, což je dále potvrzeno snížením peroxidace lipidů měřené prostřednictvím exprese HNE a akroleinu. Na rozdíl od většiny rostlinných polyfenolů je aktivita verbascoside vychytávání ROS převážně nepřímá (prostřednictvím upregulace enzymů odstraňujících ROS) spíše než přímé cesty. Ve skutečnosti zvyšuje genovou transkripci některých antioxidačních enzymů prostřednictvím aktivace dráhy Nrf2 (NF-E2-příbuzný faktor 2) a prostřednictvím mechanismu závislého na AhR (aryl hydrocarbon receptor) [24,29]. Jako takové jsme zjistili zvýšenou expresi SOD1 v buňkách ošetřených verbascosidem.
Homeostáza ROS je extrémně důležitá v patologii buněk. Kvůli nedostatku antioxidačních enzymů nemůže být zvýšená produkce ROS neutralizována a dochází k indukci chybného skládání proteinů podporujících ER stres. Stres ER vede ke snížení transkripce a translace inzulínu prostřednictvím aktivace UPR [44,46]. Hlavním účelem této dráhy je obnovení funkce ER prostřednictvím přeprogramování genové exprese, avšak při nadměrné stimulaci spouští apoptózu. Naše data naznačují, že důležitým účinkem verbascosidu je zmírnit UPR, což umožňuje úpravy nezbytné k nápravě dysfunkce ER, aniž by došlo k apoptóze. Podle této možnosti byla exprese proteinů BIP, HSP70 a PERK snížena v buňkách ošetřených verbascosidem a aktivace dráhy PERK byla oslabena v reakci na stres ER vyvolaný tunicamycinem. Podobný účinek byl popsán u tyrosolu v inzulinomové NIT-1 buněčné linii [47].
Zvláště zajímavá je schopnost verbascosidu modulovat aktivaci PERK větve UPR. V buňkách je tato dráha nezbytná k udržení bazální sekreční homeostázy a přežití buněk a u diabetu je vážně deregulována [41,48]. Ještě zajímavější je, že běžné varianty u PERK přispívají k riziku prediabetu a recesivní mutace v genu EIF2AK3 (kódující PERK) jsou základem náchylnosti k Wolcott-Rallisonově syndromu charakterizovanému permanentním novorozeneckým diabetem závislým na inzulínu [49,50].
Downregulace IKB -NFKB zánětlivé dráhy byla také detekována v našem systému v přítomnosti verbascosidu. NFKB představuje hlavní zánětlivou dráhu v buňkách a její trvalá aktivace spouští kaskádu událostí, které kulminují smrtí buněk. Ve stresovaných buňkách chrání snížení exprese NFKB pankreatické buňky před diabetogenními agens [27,51], což dále podporuje aplikaci verbascosidu v prevenci diabetu. Je zajímavé, že signalizace PERK aktivuje transkripční faktory NFR2 (účastnící se redoxní homeostázy) a NFKB, což vysvětluje antioxidační a protizánětlivé účinky verbascosidu [40,52].
Naše data také odhalují důležitou roli verbascosidu na mitochondriální aktivitu a dynamiku.
Markerem provozní kvality mitochondrií je jejich dynamika, proces charakterizovaný koordinovanými cykly fúzních a štěpných událostí, které regulují počet, distribuci, morfologii a membránový potenciál mitochondrií [39]. V souladu s touto možností verbascosid zlepšuje tc3 mitochondriální membránový potenciál jak za bazálních, tak za stresových podmínek. Účinek je opět způsoben verbascosidem a nikoli jeho metabolity, protože kyselina kofeinová nezlepšuje mitochondriální funkci a hydroxytyrosol významně snižuje potenciál organel. Sledováním mitochondriálních pohybů byla pozorována zvýšená dynamika mitochondrií a změny v jejich morfologii, což naznačuje, že verbascosid podporuje program mitomorfózy. Přetváření buněčné mitochondriální sítě ovlivňuje sestavení superkomplexů dýchacího řetězce, čímž se mění nejen buněčný metabolismus, ale i jeho redoxní stav a umožňuje buňkám lépe čelit oxidativnímu stresu a zánětům [5,37,39].
Přestože molekulární mechanismus je stále neznámý, můžeme předpokládat, že verbascosid, stejně jako ostatní polyfenoly, chrání mitochondriální DNA snížením koncentrace ROS [53] a zabraňuje otevření přechodového póru mitochondriální permeability [54], čímž zajišťuje fyziologickou mitochondriální aktivitu. Další zajímavou možností je, že modifikace dynamiky a aktivity mitochondrií je opět zprostředkována působením verbascosidu na UPR. Nedávný výzkum v mitochondriální oblasti skutečně ukazuje, že místa interakce ER-mitochondrie hrají klíčovou roli v řízení mitochondriální dynamiky a aktivity v reakci na oxidační stres a PERK je zapojen do tohoto fenoménu [55]. Většina in vitro studií s polyfenoly byla provedena na buněčných liniích, často nádorového původu, které se od původních buněk liší metabolismem a produkcí ROS. Zde poskytujeme důkaz, že verbascosid má ochranný účinek také na lidské izolované Langerhansovy ostrůvky, konečný cíl intervence u diabetu. Je zajímavé, že polyfenol zmírňuje aktivaci signalizace PERK již za bazálních podmínek, čímž zvyšuje obsah inzulínu a zabraňuje mitochondriální dysfunkci zprostředkované oxidativním stresem. Zbývá objasnit, zda polyfenolový efekt na obsah inzulinu odráží schopnost sloučeniny zabránit smrti buněk, zmírnit stres ER nebo přímo řídit expresi genu inzulinu, jak je ukázáno u jiných polyfenolických sloučenin [56]. Tyto údaje jsou zvláště důležité s ohledem na možné použití verbascosidu jako doplňkové terapie při léčbě diabetu.
5. Závěry
Zde uvedené studie in vitro na klonálních a lidských buňkách ukazují, že verbascosid má ochranné účinky proti dysfunkcím spojeným se stresem ER, zmírňuje aktivaci PERK větve UPR a zlepšuje dynamiku mitochondrií. Protože narušení homeostázy ER spouští poškození buněk a diabetes, tato data poskytují zdůvodnění pro možné použití verbascosidu jako nutraceutika v prevenci a léčbě onemocnění. Pro účinnou klinickou aplikaci verbascosidu je však třeba vyřešit mnoho problémů. Navzdory množství laboratorních studií jsou spolehlivé klinické studie potvrzující zdravotní účinky verbascosidu in vivo omezené. Kromě toho je pro budoucí použití této sloučeniny v lidském zdraví povinné zvýšení její stability a biologické dostupnosti. Z tohoto hlediska je verbaskosid zajímavou molekulou, protože jeho skelet má různá reaktivní místa, která lze modifikovat kombinační chemií. Očekáváme, že informace vyplývající z těchto studií otevřou cesty pro terapeutickou modulaci oxidačního stresu a zánětů v patologických stavech pomocí přírodních látek.
Doplňkové materiály: Následující materiály jsou k dispozici online na adrese http://www.mdpi.com/2227-9059/8/12/582/s1. Obrázek S1: Účinky kyseliny kofeinové a hydroxytyrosolu na životaschopnost buněk. Obrázek S2: Účinky verbascosidu na tunicamycinem indukovaný ER stres. Obrázek S3: Účinky kyseliny kofeinové a hydroxytyrosolu na potenciál mitochondriální membrány. Obrázek S4: Kvantitativní obrazové analýzy mitochondrií v buňkách ošetřených kofeinovou kyselinou a hydroxytyrosolem. Video S1, S2 Videa: Dynamika mitochondrií zaznamenaná za bazálních podmínek, v nepřítomnosti (S1) nebo přítomnosti (S2) verbascosidu. Video S3, S4: Dynamika mitochondrií zaznamenaná za podmínek oxidačního stresu, v nepřítomnosti (S3) nebo přítomnosti (S4) verbascosidu.
Autorské příspěvky: Konceptualizace, AG, PM a CP; správa dat, AG a PM; formální analýza, AG a PM; získávání finančních prostředků, CP; vyšetřování, MC; metodika, AM a SG; zdroje, FB, RR a ADG; dohled, CP; validace, AM, SG a MC; vizualizace, AG a AM; psaní—originální návrh, AG; psaní – recenze a úpravy, PM, AM, FB, RR, ADG, MC a CP Všichni autoři si přečetli a souhlasí s publikovanou verzí rukopisu.
Financování: Tento výzkum neobdržel žádné externí financování.
Poděkování: Rádi bychom poděkovali Carlo Corino a Mario Dell'Agli za reagencie a užitečnou diskusi.
Konflikt zájmů: Autoři neprohlašují žádný střet zájmů.
Reference
1. Cho, NH; Shaw, JE; Karuranga, S.; Huang, Y.; da Rocha Fernandes, JD; Ohlrogge, AW; Malanda, B. Diabetes Atlas IDF: Globální odhady prevalence diabetu pro rok 2017 a projekce pro rok 2045. Diabetes Res. Clin. Praxe. 2018, 138, 271–281. [CrossRef]
2. Leslie, RD; Palmer, J.; Schlott, NC; Lernmark, A. Diabetes na rozcestí: Význam klasifikace onemocnění pro patofyziologii a léčbu. Diabetologie 2016, 59, 13–20. [CrossRef] [PubMed]
3. Tokarz, VL; MacDonald, PE; Klip, A. Buněčná biologie systémové funkce inzulínu. J. Cell Biol. 2018, 217, 2273–2289. [CrossRef] [PubMed]
4. Perego, C.; Da Dalt, L.; Pirillo, A.; Galli, A.; Catapano, AL; Norata, GD Metabolismus cholesterolu, funkce pankreatických buněk a diabetes. Biochim. et Biophys. Acta (BBA) Mol. Basis Dis. 2019, 1865, 2149–2156. [CrossRef] [PubMed]
5. Galli, A.; Alžírsko, M.; Marciani, P.; Schulte, C.; Leonardi, C.; Milani, P.; Mafoli, E.; Tedeschi, G.; Perego, C. Tvarování diferenciace a fungování pankreatických buněk: Vliv mechanotransdukce. Buňky 2020, 9, 413. [CrossRef]
6. Ashcroft, FM; Rorsman, P. Diabetes Mellitus a buňka: posledních deset let. Cell 2012, 148, 1160–1171. [CrossRef] [PubMed]
7. Rosengren, AH; Braun, M.; Mahdi, T.; Andersson, SA; Travers, ME; Shigeto, M.; Zhang, E.; Almgren, P.; Ladenvall, C.; Axelsson, AS; a kol. Snížená exocytóza inzulínu v lidských pankreatických buňkách s genovými variantami spojenými s diabetem 2. typu. Diabetes 2012, 61, 1726–1733. [CrossRef] [PubMed]
8. Polonsky, KS Dynamika sekrece inzulínu u obezity a diabetu. Int. J. Obes. 2000, 24, S29–S31. [CrossRef]
9. Roden, M.; Shulman, GI Integrativní biologie diabetu 2. typu. Příroda 2019, 576, 51–60. [CrossRef]
