Část 1: Echinakosid inhibuje uvolňování glutamátu potlačením napěťově závislého Ca2 plus vstupu a proteinkinázy C v cerebrokortikálních nervových terminálech potkana
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Cheng Wei Lu 1,2, Tzu Yu Lin 1,2, Shu Kuei Huang 1 a Su Jane Wang 3,*
Abstraktní:
Glutamátergní systém se může podílet na účincích neuroprotektivních terapií.Echinakosid, fenylethanoidní glykosid extrahovaný z léčivé čínské bylinyHerba Cistanche, má neuroprotektivní účinky. Tato studie zkoumala účinkyechinakosidna 4-aminopyridinem vyvolané uvolňování glutamátu v cerebrokortikálních nervových zakončeních potkana (synaptosomech). Echinakosid inhiboval uvolňování glutamátu vyvolané 4-aminopyridinem závislé na Ca2 plus, ale ne nezávislé na Ca2 plus, a to způsobem závislým na koncentraci. Echinakosid také snížil 4-aminopyridinem vyvolané zvýšení koncentrace volného Ca2 plus v cytoplazmě, ale nezměnil potenciál synaptosomální membrány. Inhibičnímu účinku echinakosidu na 4-aminopyridinem vyvolané uvolňování glutamátu zabránil o-konotoxin MVIIC, širokospektrální blokátor kanálů Cav2.2 (N-typ) a Cav2.1 (P/Q-typ) , ale byl necitlivý na intracelulární inhibitory uvolňování Ca2 plus dantrolen a 7-chlor-5-(2-chlorfenyl)-1,5-dihydro-4 ,1-benzodiazepin-2(3H)-on (CGP37157). Kromě toho echinakosid snížil 4-aminopyridinem indukovanou fosforylaci proteinkinázy C a inhibitory proteinkinázy C zrušily účinek echinakosidu na uvolňování glutamátu. Podle těchto výsledků předpokládáme, že inhibiční účinek echinakosidu na evokované uvolňování glutamátu je spojen se sníženým napěťově závislým vstupem Ca2 plus a následnou supresí aktivity proteinkinázy C.
klíčová slova:echinakosid; uvolňování glutamátu; cerebrokortikální nervová zakončení; napěťově závislé Ca2 plus kanály; protein kináza C
1. Úvod
Echinakosidje hlavní fenylethanoidový glykosid přítomný vHerbaCistanche, známá tradiční čínská medicína používaná k léčbě zapomnětlivosti, impotence a chronické zácpy [1].Echinakosidmá různé biologické aktivity, jako jsou antioxidační, protizánětlivé, protirakovinné, hepatoprotektivní a imunitní modulace [2–4]. Echinakosid má zejména neuroprotektivní účinky; může například chránit před oxidačním stresem nebo neurotoxinem indukovanou neurotoxicitou v primárních kortikálních neuronech potkana, buňkách lidského neuroblastomu SH-SY5Y a buňkách feochromocytomu (PC12) [5–8]. Kromě toho echinakosid zmírňuje poškození mozku a zlepšuje kognitivní funkce na zvířecích modelech Parkinsonovy choroby, Alzheimerovy choroby a uzávěru střední mozkové tepny [9–12]. Nicméně mechanismus, jehož prostřednictvímechinakosidindukuje neuroprotekci není zcela pochopeno.
Neuroprotekce je komplexní proces zachování neuronální struktury a funkce po toxických inzultech. Snížení excitotoxicity glutamátu je považováno za potenciální mechanismus zapojený do neuroprotekce mozku. Glutamát, neurotransmiter excitačních aminokyselin, má zásadní roli v několika mozkových funkcích [13]. Nadměrná aktivace glutamátových receptorů při vysokých koncentracích glutamátu však způsobuje intracelulární přetížení Ca2 plus, mitochondriální dysfunkci, produkci volných radikálů a smrt neuronů [14,15]. Tento patologický proces se podílí na mnoha poruchách mozku, včetně mozkové ischemie, traumatického poranění mozku, epilepsie a neurodegenerativních onemocnění [16,17]. Proto jsou inhibitory blokující patofyziologický glutamátergní přenos považovány za potenciální neuroprotektivní léky. Jejich pozoruhodnými příklady jsou antagonisté glutamátového receptoru [18,19]; klinické studie těchto léků však selhaly z důvodu nižší účinnosti a nežádoucích či dokonce cytotoxických vedlejších účinků [20,21]. Kromě přímé blokády glutamátového receptoru může být účinnou strategií neuroprotekce inhibice uvolňování glutamátu. Několik neuroprotektiv (např. memantin a riluzol) může snížit uvolňování glutamátu v mozkových tkáních potkana [22–24].
S ohledem na roli glutamátu v excitotoxicitě a neuroprotektivní profil echinakosidu tato studie použila izolované nervové terminály (synaptosomy) purifikované z mozkové kůry potkana ke zkoumání účinku echinakosidu na uvolňování glutamátu a dále zkoumala potenciální mechanismy. Preparát izolovaného nervového zakončení je dobře zavedeným modelem pro studium presynaptické regulace uvolňování neurotransmiterů léky v nepřítomnosti jakýchkoli postsynaptických účinků [25]. Pomocí tohoto modelu jsme hodnotili účinek echinakosidu na uvolňování glutamátu, membránový potenciál, presynaptický Ca2 plus influx a aktivitu proteinkinázy C. Podle našeho přehledu literatury se jedná o první zprávu dokumentující mechanismus, kterým echinakosid inhibuje endogenní uvolňování glutamátu na presynaptické úrovni.
2. Výsledky
2.1. EchinakosidInhibuje 4-aminopyridinem vyvolané uvolňování glutamátu z cerebrokortikálních nervových terminálů potkana snížením vezikulární exocytózy
Obrázek 1 ilustruje na koncentraci závislý účinek echinakosidu na 4-aminopyridinem vyvolané uvolňování glutamátu z purifikovaných cerebrokortikálních synaptosomů potkana. V synaptosomech inkubovaných s 1 mM CaCl2 vyvolal 1 mM 4-aminopyridin uvolňování glutamátu 7,4 ± {{1{2{24}}}}},1 nmol/mg/5 min, které bylo sníženo o 1, 5, 10, 30 a 50 uM echinakosidu na 6,5 ± 0,2, 5,8 ± 0,3, 4,8 ± 0,2,
4,1 ± 0,1, respektive 2,3 ± 0,4 nmol/mg/5 min (F(5,24)=67,1, p=0. 000). Hodnota IC50 pro echinakosidem zprostředkovanou inhibici uvolňování glutamátu vyvolaného 4-aminopyridinem, odvozená z křivky dávka-odpověď, byla 24 uM. Navíc uvolňování glutamátu vyvolané 1 mM 4-aminopyridinu v extracelulárním roztoku bez Ca2 plus obsahujícím 300 uM ethylenglykol bis(-aminoethylether)-N,N,N/,N/-tetraoctové kyseliny (EGTA) byla 2.{30}},2 nmol/mg/5 min (F(2,12)=310,65, p=0.000),
a tato složka Ca2 plus nezávislá na uvolňování glutamátu vyvolaného 4-aminopyridinem nebyla ovlivněna 20 uM echinakosidu (1,8 ± 0,2 nmol/mg/5 min; p {{1 0}}.58; Obrázek 1). V synaptozomech ošetřených 0,1 uM bafilomycinem A1, inhibitorem vezikulárního transportéru [26], bylo uvolňování glutamátu vyvolaného {{17}aminopyridinem významně sníženo (2,2 ± 0},2 nmol/mg/ 5 min; F (2,12)=249,518, p=0.000). V přítomnosti bafilomycinu AI selhalo 20uM echinakosidu při významné inhibici uvolňování glutamátu (2,1 ± 0,2 nmol/mg/5 min; p=0,94; obrázek 1). Naproti tomu 10 uM DL-threo-beta-benzyl-oxyaspartát (DL-TBOA, inhibitor zpětného vychytávání glutamátu) [27] zvýšilo uvolňování glutamátu vyvolané 4-aminopyridinem na 11,8 ± 0,4 nmol/mg/5 min ( t(8)=-11.31, p=0.000). I v přítomnosti DL-TBOA inhibovalo 20 uM echinakosidu 4-aminopyridinem vyvolané uvolňování glutamátu významně (7,7 ± 0,2 nmol/mg/5 min; F(2,12)=87,23, s.=0.000; Obrázek 1).
2.2 Echinakosid snižuje cytosolickou koncentraci Ca2 plus, ale nemění potenciál synaptosomální membrány
Depolarizace synaptozomů způsobená 1 mM 4-aminopyridinem zvýšila koncentraci Ca2 plus (p=0.000; Tabulka 1). Aplikace 20 uM echinakosidu významně neovlivnila bazální koncentraci Ca2 plus (t(8)=0,06, p=0,95), ale významně snížila 4-aminopyridinem indukované zvýšení koncentrace Ca2 plus koncentrace (t(10)=6.16, p=0.000). Kromě toho se 1 mM 4-aminopyridinu zvýšil v 3',3',3'-dipropylthiadikarbocyanin jodidu [DiSC3(5)] fluorescence (p=0.000). Přidání 20 uM echinakosidu nezměnilo klidový membránový potenciál (t(8)=0.976, p= 0.36) ani významně nezměnilo 4-aminopyridinem zprostředkované zvýšení DiSC3 (5) fluorescence (t(8)=-0,014, p=0,99; tabulka 1).
2.3 Snížený přísun Ca2 plus přes kanály Cav2.2 (typ N) a Cav2.1 (typ P/Q) může být spojen s inhibicí uvolňování glutamátu 4-aminopyridinem vyvolaného echinakosidem
Obrázek 2 ukazuje, že 2 uM o-konotoxin MVIIC, blokátor Ca2 plus kanálů typu N- a P/Q, snížil 4-aminopyridinem vyvolané uvolňování glutamátu ze 7,4 ± {{10}}. 2 až 2.{14}} ± 0,1 nmol/mg/5 min (t(9)=25,35, p=0.000). V přítomnosti o-konotoxinu MVIIC byl účinek 20 uM echinakosidu na 4-aminopyridinem vyvolané uvolňování glutamátu nevýznamný (18 2 ± plus 0,2 nmol/mg/5 min; t(8)=1.06,p=0.32). Dantrolen (10 uM), inhibitor intracelulárního uvolňování Ca z endoplazmy
reticulum [28], snížené 4-aminopyridinem vyvolané uvolňování glutamátu (5,6 ± 0,3 nmol/mg/5 min; F(2,14) {{10}}. 95, str.=0.000). V přítomnosti dantrolenu by však 20 uM echinakosidu mohlo stále významně inhibovat uvolňování glutamátu (3,3 ± 0,2 nmol/mg/5 min; p=0.000). Podobné výsledky byly pozorovány při použití 100 uM 7-chlor-5-(2-chlorofeny)-1,5-dihydro-4,1-benzothiazepinu -2(3H)-one (CGP37157), membránově propustný blokátor mitochondriální výměny Na plus /Ca2 plus. V pěti zkoumaných synaptosomálních preparátech 20 uM echinakosidu v kombinaci se 100 uM CGP37157 snížilo 4-aminopyridinem vyvolané uvolňování glutamátu o 48,3 procenta ± 5,2 procenta (F(2,13) = 136,79, p {{ 49}}.000), podobně jako inhibice samotným echinakosidem (46,2 procenta ± 2,3 procenta; p=0,89; obrázek 2).
2.4 EchinakosidInhibuje 4-aminopyridinem vyvolané uvolňování glutamátu prostřednictvím signalizace prostřednictvím proteinkinázy C
Jak je znázorněno na obrázku 3, 10 uM 2-[1-(3-dimethylaminopropyl)indol-3-yl]-3-(indol-3-yl)maleimid (GF109203X), obecný inhibitor proteinkinázy C [29], snížil 4-aminopyridinem vyvolané uvolňování glutamátu (F(2,13) = 19.46, p=0.{{17 }}). V synaptosomech ošetřených GF109203X snížilo 20 uM echinakosidu uvolňování glutamátu vyvolané 4-aminopyridinem pouze o 5,5 procenta ± 1,8 procenta (p=0,89), méně než u samotného echinakosidu (42,4 procenta ± 2,3 procenta). procenta ; p=0.000). Podobné výsledky byly získány s 5,6,7,13-tetrahydro-13-methyl-5-oxo-12H-indolo[2,3-a]pyrrolo[3 ,4-c]karbazol-12-propannitril (Go6976), selektivní pro izoformy proteinkinázy C závislé na Ca2 plus ( , I, II, y) [29]. V přítomnosti 3 uM Go6976 snížilo 20 uM echinakosidu uvolňování glutamátu o 11,9 procenta ± 2,9 procenta (p=0,59), což znamená významné snížení ve srovnání se samotným echinakosidem (42,4 procenta 2,3 procenta; p {{{ 65}}.000; Obrázek 3). Naproti tomu 3 uM rottlerin, inhibitor proteinkinázy C6 nezávislý na Ca2 plus [30], významně nezměnil uvolňování glutamátu vyvolané 4-aminopyridinem (1 mM) (p=0 0,45). Nicméně v přítomnosti rotttlerinu 20 uM echinakosidu účinně způsobilo průměrnou inhibici 37,1 procenta ± 5,6 procenta uvolňování (F(2,13) = 19.72, p=0.{{88 }}), podobně jako u samotného echinakosidu (p=0.41; obrázek 3). Kromě toho mitogenem aktivovaný inhibitor proteinkinázy 2-(2-amino-3-methoxyfenyl)-4H-1-benzopyran-4-on) (PD98059 ) (50 uM) a inhibitor proteinkinázy A N-[2-(p-bromcinnamylamino)ethyl]-5-isochinolinsulfonamid (H89) (100 uM) snížil uvolňování glutamátu vyvolané 4-aminopyridinem (p=0.{110}}). I v přítomnosti PD98059 nebo H89 20 uM echinakosidu účinně snížilo uvolňování (F(2,13) = 52.3, p=0.000; obrázek 3).
Obrázek 4 ukazuje, že 1 mM 4-aminopyridinu zvýšil fosforylaci proteinkinázy C v synaptozomech (t(4)=-6.871, p=0.002). Když byly synaptozomy předem ošetřeny 20 uM echinakosidu po dobu 10 minut před přidáním 4-aminopyridinu, 4-aminopyridinem indukovaná fosforylace protein kinázy C značně poklesla (F(2,6)=29.202 , p=0.001).
2.5 Echinakosidem zprostředkovaná inhibice uvolňování glutamátu nezahrnuje receptor gama-aminomáselné kyseliny typu A (GABAA)
Na obrázku 5 byl porovnán účinek echinakosidu na 4-aminopyridinem vyvolané uvolňování glutamátu v nepřítomnosti nebo přítomnosti SR95531 (antagonista receptoru GABAA). Navíc 100 uM SR95531 významně nezměnilo uvolňování glutamátu vyvolané 4-aminopyridinem (1 mM). U synaptosomů ošetřených SR95531- vedla aplikace 20 uM echinakosidu ke 43procentní inhibici uvolňování glutamátu vyvolaného 4-aminopyridinem (F(2,12)=42.63, p { {18}}.000), která se významně nelišila od inhibice vyvolané samotným echinakosidem (40 procent; p=0.000). Podobný výsledek byl získán s dalším antagonistou receptoru GABAA, bicucullinem (50 uM). Uvolňování měřené v přítomnosti bikukulinu a echinakosidu bylo významně odlišné od uvolňování získaného v přítomnosti samotného bikukulinu (p=0.000).
3. Diskuse
V této studii,echinakosid, aktivní sloučenina v HerběCistanche, inhiboval 4-aminopyridinem vyvolané uvolňování glutamátu v nervových zakončeních mozkové kůry potkana. Možné základní mechanismy proechinakosid-zprostředkovaná inhibice uvolňování glutamátu jsou zde dále zkoumány a diskutovány.
3.1 Mechanismy tvořící základ inhibice uvolňování glutamátu zprostředkovaná echinakosidem
Uvolňování glutamátu vyvolané 4-aminopyridinem se skládá ze dvou složek: fyziologicky relevantní složky závislé na Ca2 plus, která je produkována exocytózou synaptických vezikul obsahujících glutamát; a Ca2 plus-nezávislá složka, která pochází z prodloužené depolarizace způsobující membránovým potenciálem zprostředkovaný posun ustáleného stavu glutamátového transportéru směrem ven, čímž ovlivňuje cytosolický odtok glutamátu [31]. Zde jsme pozorovali, že echinakosid významně neinhibuje uvolňování glutamátu vyvolané {{8}aminopyridinem v přítomnosti média bez Ca2 plus (nezávislé uvolňování Ca2 plus). Kromě toho pozorované echinakosidem zprostředkované inhibici uvolňování glutamátu vyvolaného 4-aminopyridinem účinně zabránil bafilomycin A1 (který vyčerpává obsah glutamátu v synaptických váčcích), ale ne DL-TBOA (který neselektivně inhibuje všechny excitační aminokyseliny podtypy transportérů). Tyto výsledky naznačují, že echinakosid ovlivňuje exocytózu uvolňování glutamátu závislou na Ca2 plus, aniž by ovlivňoval cytosolický výtok glutamátu nezávislý na Ca2 plus prostřednictvím převrácení transportéru glutamátu z plazmatické membrány nervového terminálu. V synaptických zakončeních inhibice Na plus kanálu nebo aktivace K plus kanálu stabilizuje excitabilitu membrány a následně snižuje evokovaný vstup Ca2 plus a uvolňování neurotransmiteru [32,33]. Proto potenciální mechanismus, který je základem inhibice uvolňování glutamátu zprostředkovaného echinakosidem, zahrnuje snížení synaptosomální excitability. Tato možnost je však neudržitelná na základě dvou pozorování: (1) 4-aminopyridinem vyvolaná depolarizace membránového potenciálu, měřená barvivem DiSC3(5) citlivým na membránový potenciál, nebyla přidáním echinakosidu ovlivněna; a (2) echinakosid neovlivnil 4-aminopyridinem vyvolané uvolňování Ca2 plus nezávislého glutamátu, složku uvolňování, která závisí pouze na membránovém potenciálu [31]. Pokud účinek není způsoben supresí synaptosomální excitability, může se projevit snížením aktivity Ca2 plus kanálů Cav2.2 (N-typ) a Cav2.1 (P/Q-typ) spojené s glutamátovou exocytózou v nervových zakončení [34–36]. Použitím fura-2 dokazujeme, že echinakosid významně snižuje 4-aminopyridinem vyvolané zvýšení koncentrace Ca2 plus. Naše data navíc ukazují, že inhibiční účinek echinakosidu na 4-aminopyridinem vyvolané uvolňování glutamátu se po expozici blokátoru Cav2.2 (N-typ) a Cav2 snížil ze 42,4 procenta 2,3 procenta na 12,1 procenta 3,9 procenta .1 (typ P/Q) Ca2 plus kanály. Dále jsme pozorovali, že echinakosid nadále významně inhiboval 4-aminopyridinem vyvolané uvolňování glutamátu v přítomnosti intracelulárních inhibitorů uvolňování Ca2 plus. Tyto výsledky naznačují, že současná suprese Cav2.2 (N-typ) a Cav2.1 (P/Q-typ) aktivity Ca2 plus kanálu je potenciálním mechanismem, který je základem inhibice uvolňování glutamátu zprostředkované echinakosidem. Avšak kombinovaná aktivace Cav2.2 (N-typ) a Cav2.1 (P/Q-typ) Ca2 plus kanálová aktivita nemohla zcela blokovat působení echinakosidu. Na inhibici se tedy mohou podílet další neidentifikované typy Ca2 plus kanálů nebo jiné presynaptické dráhy. Například receptory GABAA jsou přítomny na presynaptické úrovni a bylo prokázáno, že jejich aktivace inhibuje influx Ca2 plus a uvolňování glutamátu [37]. V této studii antagonisté receptoru GABAA SR95531 a bicucullin neblokovali echinakosidy zprostředkovanou inhibici uvolňování glutamátu, což naznačuje, že receptory GABAA se nepodílejí na snížení napěťově závislé aktivity Ca2 plus kanálu a na následné inhibici uvolňování glutamátu. Vstup Ca2 plus přes napěťově závislé kanály Ca2 plus aktivuje několik proteinkináz spojených s uvolňováním glutamátu v nervových zakončeních, včetně mitogenem aktivované proteinkinázy, proteinkinázy C a proteinkinázy A. Zde ukazujeme, že inhibitory proteinkinázy C účinně antagonizovaly echinakosid. -zprostředkovaná inhibice uvolňování glutamátu; nicméně mitogenem aktivovaný inhibitor proteinkinázy PD98059 nebo inhibitor proteinkinázy A H89 byly neúčinné. Kromě toho se 4-aminopyridinem indukovaná fosforylace proteinkinázy C snížila v synaptozomech po předběžném ošetření echinakosidem v koncentraci účinné pro inhibici uvolňování glutamátu. Signální dráha inhibice uvolňování glutamátu zprostředkovaná echinakosidem tedy může zahrnovat proteinkinázu C. Proteinkináza C je důležitý intracelulární signální systém, který je přítomen na presynaptické úrovni a má klíčovou roli v exocytóze neurotransmiterů. Například několik synaptických proteinů zapojených do obchodování se synaptickými vezikulami nebo jejich náboru a exocytózy, jako je myristoylovaný substrát C kinázy bohatý na alanin, je fosforylováno proteinkinázou C [38,39]. Tento proces fosforylace může být zvýšen depolarizací stimulovaným vstupem Ca2 plus, což usnadňuje uvolňování glutamátu [40]. Můžeme tedy důvodně spekulovat, že zde pozorovaný inhibiční účinek echinakosidu na vstup Ca2 plus může snížit aktivitu proteinkinázy C a následně uvolňování glutamátu.
