Část 2: Proteinurické chronické onemocnění ledvin je spojeno se změněnou délkou života, deformovatelností a metabolismem červených krvinek

Pro část 1 klikněte prosímTADY.

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Poškození ledvin vyvolané doxorubicinem mění životnost, morfologii a biofyzikální vlastnosti myších červených krvinek

Dvacet dní po indukci DIN se shoduje s rozvojem sníženéfunkce ledvin(Obrázek 1b), fluorescenční barvivo 5(6)-CFDA, SE,24, které se rychle absorbuje do červených krvinek, bylo iv injikováno, aby se vyhodnotila rychlost clearance červených krvinek v uvedených časových bodech in vivo. Reprezentativní histogramy zobrazené na obrázku 4a ukazují odstranění značených erytrocytů z oběhu a jejich nahrazení neznačenými erytrocyty. Zvýšená ztráta červených krvinek byla zřejmá již 3 dny po podání barviva a clearance červených krvinek byla výrazně rychlejší u myší 129S1/SvImJ s DIN až do dne 37. V den 41 bylo u těchto myší odstraněno z oběhu o 17 procent více červených krvinek. se zdravými myšmi (obrázek 4b).

Cistanchezlepšitfunkce ledvinavýhodledviny

Obrázky pořízené z krevního nátěru odhalily morfologické změny v červených krvinkách odebraných z myší 129S1 / SvImJ s myší DIN (obrázek 4c) a Nphs2Dipod (doplňkový obrázek S4A). U zdravých myší mají červené krvinky bikonkávní tvar disku. U myší 129S1/SvImJ s DIN jsme pozorovali zvýšený počet stomatocytů (červené hvězdy), slzných buněk (černý trojúhelník), schistocytů (černé body) a mikrocytických buněk (černá šipka) (obrázek 4c). Myši Nphs2Dipod vykazovaly zvýšený podíl schistocytů (černé body, doplňkový obrázek S4A, spodní obrázek, levá strana) a buňky byly polychromatické (doplňkový obrázek S4A, spodní obrázek, pravá strana).

Pro další zkoumání funkčních změn červených krvinek byla provedena měření deformovatelnosti v den 30 pomocí ektacytometrie.³²Deformovatelnost červených krvinek byla významně snížena u myší 129S1 / SvImJ s DIN a také u myší Nphs2Dipod, jak je indikováno sníženým indexem maximálního prodloužení (EImax) (obrázek 4d a doplňkový obrázek S4B). Smykové napětí pro 50 procent (SS1/2) EImax (obrázek 4e) a tedy poměr SS1/2 EImax (obrázek 4f) byly významně zvýšeny u 129S1/SvImJ myší s DIN, což ukazuje na tužší červené krvinky. SS1/2 EImax byla podobná u myší Nphs2Dipod (doplňkový obrázek S4C). Poměr SS1/2 EImax měl tendenci být zvýšen u myší Nphs2Dipod ve srovnání se zdravými myšmi C57BL/6; rozdíl však nedosáhl statistické významnosti (P ​​¼ 0,06) (doplňkový obrázek S4D).

Vzhledem k tomu, že vystavení červených krvinek hypertonickým extracelulárním podmínkám in vitro napodobuje osmotické prostředí vyskytující se v dřeni ledvin, lze kosmos provést 30. den a bylo stanoveno několik osmosenzitivních parametrů, jak bylo popsáno dříve.³³ Omin představuje osmolalitu při minimální deformovatelnosti červených krvinek, za kterou by červené krvinky lyzovaly s dalším poklesem osmolarity. Hodnoty Omin byly vyšší u 129S1/SvImJ myší s DIN a posunuty doprava (obrázek 5a a d). Podobná tendence k vyššímu Omin byla pozorována u myší Nphs2Dipod (doplňkový obrázek S4E). Hodnoty Ohyper, odrážející stav hydratace buněk, byly významně vyšší u myší 129S1 / SvImJ s DIN (obrázek 5b), ale byly podobné u myší Nphs2Dipod a jejich příslušných kontrolních myší (doplňkový obrázek S4F). Maximální deformovatelnost (EImax) při izotonicitě je bod, ve kterém buňky dosáhly maximální elipticity. EImax při izotonicitě byl významně snížen u myší 129S1 / SvImJ s DIN (obrázek 5c), ale nevykazoval žádné rozdíly u myší Nphs2Dipod ve srovnání se zdravými myšmi C57BL / 6 (doplňkový obrázek S4G). Celkově tyto výsledky naznačují sníženou integritu a elasticitu membrány, ale také změny tvaru u myší 129S1/SvImJ a Nphs2Dipod a také vyšší osmotickou křehkost červených krvinek z myší 129S1/SvImJ s DIN.

Červené krvinky jsou metabolicky přeprogramovány během proteinurického onemocnění ledvin u myší

Abychom lépe porozuměli molekulárním adaptacím spojeným se změnami v množství a morfologii červených krvinek jako funkce poškození ledvin, byly erytrocyty z myší 129S1 / SvImJ s myší DIN a Nphs2Dipod analyzovány metabolomikou založenou na hmotnostní spektrometrii (obrázek 6a a doplňkový obrázek S5A). Pomocí tohoto přístupu byly stanoveny relativní hladiny 256 metabolitů pro myši 129S1/SvImJ a myši Nphs2Dipod. Aby bylo možné tato data analyzovat systematickým způsobem, byly provedeny vícerozměrné analýzy, včetně diskriminační analýzy částečných nejmenších čtverců a analýzy hierarchického shlukování. Je zajímavé, že diskriminační analýza parciálních nejmenších čtverců metabolomů RBC z obou modelů odhalila podobné vzorce shlukování.

Konkrétně, ačkoli se vzorky v době modelové indukce seskupovaly spolu se zdravými vzorky ze všech časových bodů, vzorky z nefrotických myší se shlukovaly nezávisle na zdravých kontrolních vzorcích spolu se složkou 1 (obrázek 6b a doplňkový obrázek S5B). V souladu se shlukovacími vzory patrnými ve 2 modelech, hierarchická shluková analýza metabolomických dat pro každý model zdůraznila podobné trendy pro metabolity zapojené do řízení oxidačního stresu, stejně jako nukleotidy, aminokyseliny, acylkarnitiny a mastné kyseliny (obrázek 6c a doplňkové obrázky S5C, S6 a S7). Například hladiny alantoinu, purinového katabolitu a markeru oxidačního stresu v červených krvinkách,³⁴ a redukovaný glutathion, oba se významně akumulovaly v průběhu času v obou nefrotických myších modelech, což ukazuje na pokračující tvorbu reaktivních forem kyslíku a aktivaci antioxidačního glutathionového systému (obrázek 6d a doplňkový obrázek S5D). Podobně se v průběhu času nahromadily hladiny prekurzoru pantothenátu koenzymu A (CoA) (obrázek 6e a doplňkový obrázek S5E).

Podobné vzorce byly patrné v hladinách volných mastných kyselin kyseliny hexadecenové (C16:1), kyseliny oktadecenové (C18:1) a kyseliny dokosapentaenové (C22:5), ačkoli každý model měl jedinečné časové vzorce (obrázek 6f a doplňkový obrázek S5F).

Kromě mastných kyselin reagovaly také acylkarnitiny, včetně hydroxyoktanoylkarnitinu (AC C{1}}OH), hydroxydekanoylkarnitinu (AC C10-OH) a dodekanoylkarnitinu (AC C12:1). k indukci proteinurické nefropatie v obou modelech (obrázek 6g a doplňkový obrázek S5G).

Celkově vzato tato zjištění naznačují, že při indukci proteinuricnemoc ledvinve 2 podobných myších modelech může zvýšená hladina oxidačního stresu způsobit poškození acylových řetězců na membránových lipidech. Protože červené krvinky nemají schopnost syntetizovat nové lipidy, využívají systém, který závisí na odstranění poškozených acylových řetězců zprostředkovaném fosfolipázou a nahrazení nepoškozenými mastnými kyselinami. Tento systém, označovaný jako Landsův cyklus,35 závisí na aktivaci acylového řetězce konjugací s CoA, která vytváří rovnováhu s acylkarnitinem pro náhradu membrány36 (obrázek 6h a doplňkový obrázek S5H).

Proteinuričtí pacienti s CKD s anémií vykazují zvýšenou smrt červených krvinek

To confirm that PS-exposing RBCs occur also in human CKD, as described earlier,37 we analyzed blood samples from 25 patients treated by our outpatient clinic. To match the mouse models that represent nephrotic syndrome with preserved GFR during the first 10 days, and then advanced CKD with reduced GFR from day 20 onwards (Figure 1 and Supplementary Figure S2), we analyzed 10 patients with primary nephrotic syndrome representing proteinuric CKD with preserved GFR (>60 ml/min na 1,73 m2) a 15 pacientů s CKD s proteinurií nefrotického rozsahu a GFR<60 ml/min="" per="" 1.73="">². Charakteristiky pacienta jsou uvedeny v tabulce 1. Anémie spojená s onemocněním ledvin, jak je definována koncentrací hemoglobinu<13.5 g/dl="" in="" men="" and=""><12 g/dl="" in="" women,="" was="" observed="" in="" 4="" of="" the="" 10="" primary="" nephrotic="" patients="" (red="" triangles="" in="" figure="" 7),="" whereas="" 14="" of="" 15="" ckd="" patients="" with="" nephrotic-range="" proteinuria="" and="" reduced="" gfr="" were="" anemic="" (figure="" 7a).="" in="" the="" latter="" group,="" plasma="" epo="" concentrations="" and="" reticulocyte="" production="" index="" were="" not="" increased="" (figure="" 7b="" and="" c),="" consistent="" with="" reduced="" erythropoiesis.="" in="" fluorescence-activated="" cell="" sorting="" analysis,="" primary="" nephrotic="" patients="" and="" patients="" with="" advanced="" ckd="" had="" a="" higher="" rate="" of="" ps-exposing="" cells="" (mean,="" 1.0%="" 0.3%="" and="" 1.4%="" 0.7%,="" respectively)="" compared="" with="" healthy="" subjects="" (mean,="" 0.6%="" 0.1%;="" figure="" 7d).="" rbc="" cell="" death="" in="" patients="" with="" primary="" nephrotic="" syndrome="" and="" advanced="" ckd="" was="" triggered="" by="" higher="" levels="" of="" reactive="" oxygen="" species="" (figure="" 7e)="" and="" increased="" ceramide="" levels="" (figure="" 7f).="" augmented="" intracellular="" calcium="" concentration="" was="" found="" in="" patients="" with="" advanced="" ckd="" (figure="">

Lidské červené krvinky od pacientů s primárním nefrotickým syndromem a pokročilým CKD vykazovaly morfologické změny, jak bylo pozorováno na myších modelech (obrázky 4c a 7j–l a doplňkový obrázek S4A). Ačkoli morfologie červených krvinek byla u kontrol normální, anemičtí pacienti s primárním nefrotickým syndromem a pacienti s pokročilým CKD měli zvýšený počet slzných buněk (černé trojúhelníky) a echinocytů (černé křížky) (obrázek 7k a l). Kromě toho se cílové buňky vyskytly u primárních nefrotických pacientů s anémií au pacientů s pokročilým CKD (červené křížky; obrázek 7k a l). Všechny skupiny pacientů, včetně primárně nefrotických pacientů bez anémie, měly zvýšený podíl sférocytů (modré šipky; obrázek 7j–l). Pro analýzu deformovatelnosti lidských červených krvinek byla provedena ektocytometrie. Ve srovnání se zdravými kontrolami byla maximální deformabilita (EImax) snížena u pacientů s pokročilým CKD (obrázek 7h); EImax měl tendenci být nižší u pacientů s primárním nefrotickým syndromem, aniž by dosáhl statistické významnosti (obrázek 7h). Parametry SS1/2, Omin, Ohyper a EImax při izotonicitě se mezi zdravými kontrolami, primárními nefrotickými pacienty a pacienty s pokročilým CKD významně nelišily (doplňkový obrázek S8A–D).

Výhody Cistancheledvin a pomoci při CKD.

DISKUSE

Tato studie odhaluje nové patofyziologické mechanismy vedoucí k anémii spojené s onemocněním ledvin na 2 myších modelech proteinurickénemoc ledvins těžce postiženýmfunkce ledvin. Naše studie ukazuje, že v těchto modelech je anémie výsledkem zkrácené životnosti červených krvinek vyvolané expozicí PS a zrychlenou fagocytární clearance. Je zajímavé, že se anémie u těchto myší vyvinula navzdory stimulované erytropoéze, což naznačuje, že zkrácená životnost červených krvinek prostřednictvím zvýšené smrti buněk červených krvinek může být alternativním vysvětlením těchto zjištění. Na rozdíl od pacientů s CKD s anémií (obrázek 77) byly oba myší modely charakterizovány zvýšenou plazmatickou koncentrací EPO. To lze usuzovat na základě zachování schopnosti vylučovat EPO v těchto modelech, které pravděpodobně šetří buňky vylučující EPO umístěné v intersticiu ledviny. Zvýšená sekrece EPO v těchto modelech však nevyvrací závěr, že smrt červených krvinek je hlavním hráčem v patogenezi anémie související s onemocněním ledvin. Naopak stimulaci erytropoézy zvýšenou sekrecí EPO lze považovat za kompenzační mechanismus ke zvýšenému odumírání červených krvinek vyvolanéselhání ledvinv těchto modelech. V tomto směru byla nedávno pozorována zvýšená extramedulární erytropoéza se zvýšeným objemem sleziny u jiného modelu proteinurických myší s anémií.³⁸

U pacientů s proteinurickým CKD a současnou anémií jsme také pozorovali zvýšené procento RBC exponujících PS spolu s vyššími hladinami reaktivních forem kyslíku a ceramidu. To naznačuje, že zrychlená smrt červených krvinek by se mohla podílet na patogenezi anémie spojené s onemocněním ledvin u lidí s CKD. Koncentrace EPO v plazmě a index produkce retikulocytů nebyly u anemických pacientů s CKD zvýšeny, což ukazuje na sníženou erytropoézu, u níž se očekává, že ve shodě s úmrtím RBC zhorší anémii spojenou s onemocněním ledvin. Důvody ztráty sekrece EPO ledvinami u lidského CKD zůstávají nejasné. Je pozoruhodné, že ačkoli ne všichni pacienti s normální GFR měli anémii, ti se sníženou GFR byli všichni anemičtí, což ukazuje na účinek dlouhodobého a pokročilého CKD. Je pozoruhodné, že relativní deficit EPO u CKD lze překonat použitím nové třídy inhibitorů prolylhydroxylázy,³⁹což naznačuje narušené snímání kyslíku jako možnou příčinu hyposekrece EPO.

Cistanchezlepšitfunkce ledvins a pomoc s ČKD.

Naše data prokazují sníženou deformovatelnost červených krvinek v obou myších modelech proteinurické nefropatie, která může přímo souviset se zvýšenými hladinami cytoplazmatického Ca2þ.⁴⁰ Společně by tyto mechanismy mohly působit ve shodě, aby usnadnily indukci smrti červených krvinek a odstranění senescentních a zraněných červených krvinek z krevního oběhu.¹⁵Dále jsme pozorovali metabolické přeprogramování v těchto buňkách, svědčící o oxidačním stresu a remodelaci membránových lipidů. Ačkoli CoA a acyl-CoA nebyly v těchto vzorcích přímo měřeny, jsou aktivně konvertovány v červených krvinkách na acylkarnitiny karnitin palmitoyl transferázou.³⁶Hromadící se hladiny posledně jmenované třídy sloučenin indikují aktivaci těchto mechanismů u nefropatie, protože tyto metabolity nejsou snadno transportovány přes membrány červených krvinek.⁴¹ Jako další podporu jsme pozorovali akumulaci v obou modelech prekurzorů CoA, včetně pantotenátu, který je přijímán⁴²a metabolizovány⁴³RBC, souběžně se zvyšováním volných mastných kyselin a snižováním volného karnitinu. Je zajímavé, že jsme dříve zjistili, že tyto změny se vyskytují ve spojení se suprafyziologickými hladinami intracelulárního Ca2þ.¹⁶Ačkoli tyto výsledky byly generovány ex vivo, uvádíme zde podobné reakce in vivo. Kromě toho jsou acylkarnitiny schopné přímo modulovat vlastnosti membrány⁴⁴a korelují s deformovatelností červených krvinek^,45stejně jako osmotická a oxidativní hemolýza.⁴⁶Nekonjugovaný volný karnitin podporuje deformovatelnost membrány prostřednictvím interakcí mezi membránovými proteiny.⁴⁷ Naše pozorování významně snížených hladin karnitinu v červených krvinkách od myší s nefropatií, pravděpodobně kvůli zvýšené spotřebě pro tvorbu acylkarnitinů, může přispět ke zhoršeným reologickým parametrům, které jsme pozorovali paralelně.

Naše zjištění naznačují společné mechanismy vedoucí k smrti červených krvinek u myší s deficitem DIN i podocinu, což může souviset jak s proteinurií nefrotického rozsahu, tak, což je důležitější, s rozvojem těžkéselhání ledvinna myších modelech pozorovaných ode dne 20. U lidí je pokročilé CKD se sníženou GFR silným prediktorem anémie,⁴⁸a stimulace smrti RBC by mohla souviset s uremickým prostředím. Je třeba uznat, že u pokročilého CKD může do hry vstoupit mnoho faktorů a odchylek a podpořit anémii spojenou s onemocněním ledvin. Příspěvek těžké proteinurie ke stimulaci smrti červených krvinek zůstává nejasný, ale ačkoli není prokázán, může zahrnovat faktory, které se ztrácejí v moči, jako je transferin nebo jiné regulující metabolismus červených krvinek.⁴⁹Současná léčba anémie související s onemocněním ledvin se zatím zaměřuje na zvýšení erytropoézy substitucí železa nebo EPO,⁵⁰aplikací perorálních stabilizátorů proteinů faktoru indukovaného hypoxií,⁵¹nebo perorálním nebo iv podáváním železa.⁵²Tato léčba však nebere v úvahu zvýšenou smrt červených krvinek. V předchozí průřezové studii u pacientů na hemodialýze a peritoneální dialýze jsme zjistili, že pacienti s vyšším procentem RBC exponujících PS byli léčeni vyššími dávkami EPO.¹⁴ Zlepšení odumírání červených krvinek proto slibuje, že bude možným terapeutickým přístupem při léčbě anémie související s onemocněním ledvin. V této souvislosti vyžaduje inhibiční účinek různých farmakologických činidel na smrt červených krvinek53 další studie na lidech a zvířatech.

Závěrem lze říci, že změněný buněčný metabolismus přispívá k dysfunkci červených krvinek, zvýšené smrti červených krvinek, a tedy anémii u myších modelů proteinurického CKD, navzdory zvýšeným hladinám EPO v séru. Zjištění této studie mohou částečně vysvětlit mechanismy anémie spojené s CKD u lidí.

Cistanche výhodfunkce ledvin a pomoc při CKD.

ZVEŘEJNĚNÍ

Ačkoli to nesouvisí s obsahem článků, ADA a TN jsou zakladateli společnosti Omix Technologies, Inc. Všichni ostatní autoři prohlásili, že nemají žádné konkurenční zájmy.

DATOVÝ VÝKAZ

Údaje budou zpřístupněny na základě přiměřené žádosti.

PODĚKOVÁNÍ

Autoři oceňují odbornou technickou pomoc Andrey Janessy. Tyto studie byly podpořeny grantem Německé výzkumné nadace pro RB (BI 2149/2-1) a FA (AR 1092/2-2). LS byla podpořena grantem Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung (IZKF) lékařské fakulty Univerzity v Tübingenu. SMQ byl podporován zdroji od Canadian Blood Services. Jako podmínku kanadského vládního financování musí tato zpráva obsahovat prohlášení "Názory zde vyjádřené nemusí nutně představovat názor federální vlády Kanady."

AUTORSKÉ PŘÍSPĚVKY

Studii navrhly RB a FA. Sběr dat provedly RB, TN, MG, TD, DE, MW, LS, MX, JMB, MZK, KO, LK, IG-M a BF.

Statistické analýzy byly provedeny pomocí RB, TN, MG, TD, LS, JMB, LK, IG-M a ADh; a obrázky byly generovány pomocí RB, TN, MZK, IG-M, LQ-M, BF a ADh. RB, TN, ADA, MG, BNB, LS, AS, TB, MS, ALB, FG, SMQ,

a FA interpretovala data. Rukopis napsali, zkontrolovali a upravili RB, TN, ADA, MG, BNB, TB, ALB, FG, SMQ a FA.

DOPLŇKOVÝ MATERIÁL

Doplňkový soubor (PDF)

Doplňkové materiály a metody.

Obrázek S1. Experimentální návrh studií na myších 129S1/SvImJ a Nphs2Dipod.

Obrázek S2. Vymazání exprese podocinu a charakteristických znaků nefrotického syndromu u myší Nphs2Dipod.

Obrázek S3. Snížená míra přežití červených krvinek u experimentálního nefrotického syndromu u myší Nphs2Dipod.

Obrázek S4. Změněná morfologie a snížená deformovatelnost červených krvinek u myší Nphs2Dipod.

Obrázek S5. Metabolomika ukazuje na akumulaci oxidačního stresu a aktivaci remodelace membránových lipidů v červených krvinkách u myší Nphs2Dipod.

Obrázek S6. Metabolomika ukazuje na změněný metabolismus v červených krvinkách získaných z myší 129S1/SvImJ.

Obrázek S7. Metabolomika ukazuje na změněný metabolismus v červených krvinkách získaných od myší Nphs2Dipod.

Obrázek S8. Smykové napětí na polovině maximální deformovatelnosti červených krvinek (RBC) a osmotická citlivost červených krvinek se významně neliší u primárního nefrotického syndromu a u pokročilých pacientů s chronickým onemocněním ledvin (CKD).

REFERENCE

1. Finkelstein FO, Story K, Firanek C, et al. Kvalita života související se zdravím a hladiny hemoglobinu u pacientů s chronickým onemocněním ledvin. Clin J Am Soc Nephrol. 2009;4:33–38.

2. Efstratiadis G, Konstantinou D, Chytas I, et al. Syndrom kardio-renální anémie. Hippokratie. 2008;12:11–16.

3. Staples AO, Wong CS, Smith JM, et al. Anémie a riziko hospitalizace u dětského chronického onemocnění ledvin. Clin J Am Soc Nephrol. 2009;4: 48–56.

4. Kurella Tamura M, Vittinghoff E, Yang J, et al. Anémie a riziko kognitivního poklesu u chronického onemocnění ledvin. BMC Nephrol. 2016;17:13.

5. Toft G, Heide-Jørgensen U, van Haalen H, et al. Anémie a klinické výsledky u pacientů s těžkým chronickým onemocněním ledvin nezávislým na dialýze nebo závislým na dialýze: dánská populační studie. J Nephrol. 2020;33:147–156.

6. Geddes CC. Patofyziologie renální anémie. Transplantace nefrolového číselníku. 2018;34:921–922.

7. Artunc F, Risler T. Koncentrace erytropoetinu v séru a reakce na anémii u pacientů s chronickým onemocněním ledvin nebo bez něj. Transplantace nefrolového číselníku. 2007;22:2900–2908.

8. Erslev AJ, Besarab A. Erytropoetin v patogenezi a léčbě anémie chronického selhání ledvin. Kidney Int. 1997;51:622–630.

9. Wish JB, Aronoff GR, Bacon BR a kol. Pozitivní bilance železa u chronického onemocnění ledvin: kolik je příliš mnoho a jak to zjistit? Am J Nephrol. 2018;47:72–83.

Howard RL, Buddington B, Alfrey AC. Močový albumin, transferin a vylučování železa u diabetických pacientů. Kidney Int. 1991;40:923–926.

Atd.