Část 2: echinakosid indukuje apoptotickou buněčnou smrt rakoviny inhibicí enzymu MTh1

echinakosid indukuje apoptotickou buněčnou smrt tím, že inhibuje enzym MTh1 dezinfikující nukleotidový bazén

11-

Cistanche echinakosidmáproti rakoviněaanti-apoptotickéúčinky

Výsledky

Identifikace echinakosidu jako inhibitoru MTh 1

K hledání přírodních sloučenin schopných inhibovat MTH1 jsme použili enzymatickou reakci katalyzovanou MTH1 jako vysoce výkonnou screeningovou zkoušku vitro. Kromě oxidovaných purinových nukleotidů může MTH1 také hydrolyzovat normální deoxyguanosintrifosfát za vzniku deoxyguanosinmonofosfátu a pyrofosfátu. V přítomnosti přebytku anorganické pyrofosfatázy se všechny pyrofosfáty přeměňují na anorganické fosfáty, které lze kvantifikovat pomocí testu absorbance na bázi malachitové zeleně,41 což umožňuje nepřímé měření aktivity MTH1.32 Pro testování zkušebního systému jsme nejprve změřili účinek (S)-krizotinibu, sloučeniny s prokázanou účinností jako inhibitor MTH1.33 Výsledek ukázal, že (S)-krizotinib skutečně silně inhiboval MTH1 (obrázek 1A) s IC50 z500 nM, která byla sedmkrát vyšší než ta, kterou uváděli Huber a kol. (72 nM).33 To bylo pravděpodobně způsobeno rozdíly v detekčních metodách nebo zdrojích chemikálií a enzymů. Přijali jsme méně citlivý chromogenní přístup, zatímco Huber a kol. použili vysoce citlivou bioluminiscenční metodu.33 S ohledem na tuto skutečnost jsme prověřili 12 komerčně dostupných přírodních sloučenin (tabulka S1), z nichž každá je hlavní složkou tradičních bylin s potenciální protinádorovou aktivitou.Echinakosid, sloučenina čištěná z parazitické léčivé rostliny Cistanche salsa (obrázek 1C), významně inhibovala reakci (obrázek 1B) s IC50 7,01±2,13 μM (obrázek 1D). Přidání 50krát více pyrofosfatázy nemělo žádný vliv na výsledek, zatímco přidání pětinásobku více MT1proteinu významně snížilo stupeň inhibice, což naznačuje, žeEchinakosidspecificky inhiboval aktivitu MT1 v enzymatické zkoušce in vitro.

Echinakosid inhiboval buněčný MTh 1 ke zvýšení intracelulárního 8-oxogu

Dále jsme se zeptali, zdaEchinakosidmůže inhibovat intracelulární aktivitu MTH1. Inhibice buněčného MTH1 bude mít za následek zvýšení intracelulárního 8-oxoG. Bylo prokázáno, že Avidin se váže na 8-oxoG s vysokou specificitou;42 proto jsme použili imunofluorescenční barvení avidinem konjugovaným cy3 k porovnání intracelulárních hladin 8-oxoG v různých rakovinných buněčných liniích před a poEchinakosidléčba. Lidský osteosarkom MG-63, SK-HEP-1hepatokarcinom, MCF-7 karcinom prsu a buňky kolorektálního karcinomu SW480 byly léčeny 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM nebo 80 μM echinakosidem po dobu 5 hodin, 12 hodin nebo 24 hodin. Barvení avidinem konjugovaným cy3 odhalilo, že léčba 60 μM echinakosidem po dobu 24 hodin jasně a významně zvýšila hladinu buněčného 8-oxoG (reaktivní látka Cy3-avidin) v těchto rakovinných buňkách (obrázek 2A a B). Vyšší koncentrace (80 μM)Echinakosidvedlo k silnějšímu buněčnému barvení 8-oxoG (obrázek 2B), což naznačuje vztah mezi dávkou a odpovědí. Podobné výsledky byly získány

imunofluorescenčním barvením myší monoklonální anti-8-oxoG protilátkou (obr. S1A).43 KoncentraceEchinakosid(60 μM) potřebné pro významné zvýšení buněčného 8-oxoG bylo mnohem vyšší než IC50 (7,01 μM) ze zkoušky in vitro. To bylo pravděpodobně způsobeno rozdílem v citlivosti obou testů. Imunofluorescenční barvení je mnohem méně citlivé než enzymatický test in vitro; kromě toho je počet inhibičních molekul, které mohou dosáhnout a interagovat s buněčným MTH1, ovlivněn složitými biologickými procesy; navíc v testu in vitro se jako substrát používá méně oblíbený dGTP, a proto může být snazší (užívat méně inhibitorů) inhibovat MTH1, což vede k nižšímu IC50 v testu in vitro.

TenProtinádorovéaantioxidantúčinkyechinakosidodCistanchedeserticola

Buněčný 8-oxoG je generován ROS, který je antagonizován antioxidanty. Zvýšení buněčné ROS nebo potlačení aktivity antioxidantů by tedy také vedlo ke zvýšení buněčné hladiny 8-oxoG.EchinakosidSám o sobě je silným antioxidantem44,45, a proto by měl aktivitu antioxidantů spíše zvyšovat než potlačovat. Chcete-li zjistit, zda byla buněčná hladina ROS změněna pomocíEchinakosidstejné rakovinné buňky byly ošetřeny 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM nebo 80 μM echinakosidem po dobu 5 hodin, 12 hodin nebo 24 hodin a poté analyzovány průtokovou cytometrií po barvení fluorescenční sondou 2′,7′-dichlorfluorescein diacetátem. Výsledky ukázaly, že žádná z těchto léčebných postupů nezměnila buněčné hladiny ROS (obrázek 2C a D). Zvýšená buněčná hladina 8-oxoG tedy s největší pravděpodobností vyplynula z inhibice MTH1 Echinakosidem.

echinakosidzpůsobil rozsáhlé poškození DNA specificky v rakovinných buňkách Začlenění 8-oxoG do DNA bude stimulovat BER a MMR, které generují jednovláknové zlomy DNA (SSB) a mezery.16,17 Za normálních okolností jsou tyto zlomy a mezery utěsněny opravnými mechanismy zahrnujícími vyplňování mezer a ligasaci DNA polymerázami a ligasami.46,47 Rychlý nárůst buněčné SSB však může nasytit kapacitu buněčné opravy, což vede k tvorbě četných dvouřetězcových zlomů DNA (DSB)18 a signalizace DDR. Chcete-li zkontrolovat, zdaEchinakosid-indukované zvýšení buněčného 8-oxoG způsobilo poškození DNA, zkoumali jsme jeden z prvních markerů poškození DNA, 53BP1, který se váže na místa DSB jako nejstarší buněčná odpověď na DSB.48 Rakovinné buněčné linie MG-63, SK-HEP-1, MCF-7 a SW480 a nerakovinné buněčné linie lidských normálních jater L-O2,49 lidské embryonální ledviny HEK 293 a myší fibroblast NIH/3T3 byly léčeny 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM nebo 80 μM Echinakosid po dobu 5 hodin, 12 hodin nebo 24 hodin. Fluorescenční imunobarvení ukázalo, že léčba 60 μM echinakosidem po dobu 24 hodin specificky zvýšila počet buněk s pěti nebo silněji obarvenými jadernými ložisky 53BP1 u všech nádorů, ale ne v žádné z nerakovinných buněčných linií (obrázek 2E a F). Významné zvýšení počtu buněk o 53BP1+ bylo pozorováno již 5 hodin po zahájení léčby echinakosidem (obrázek 2F). Vyšší koncentrace (80 μM) echinakosidu nebo delší doba léčby (12 hodin a 24 hodin) vedly k většímu zvýšení počtu buněk 53BP1+ (obrázek 2F) a počtu buněčných ložisek 53BP1. Společně tyto výsledky naznačují, že inhibice MTH1 echinakosidem způsobila akumulaci 8-oxoG a rozsáhlé poškození DNA u rakoviny, ale ne u nerakovinných buněk.

echinakosid potlačil proliferaci rakovinných buněk

V cyklických buňkách způsobí neopravené přerušení řetězce DNA kolaps replikačních vidlic DNA, což pak povede k zablokování buněčné proliferace indukcí zástavy buněčného cyklu a apoptózy.50 Pro kontrolu účinkůEchinakosidna buněčném růstu a proliferaci jsme nejprve analyzovali růst rakovinných buněk MG-63, SK-HEP-1, MCF-7 a SW480 léčených echinakosidy pomocí testu tvorby kolonií. Výsledky ukázaly, že rakovinné buňky ošetřené 60 μM nebo 80 μMEchinakosidvytvořil mnohem méně kolonií a kolonie, které se vytvořily, byly mnohem menší (obrázek 3A a B), což naznačuje značně potlačený růstový potenciál. Dále jsme analyzovali proliferaci těchto rakovinných buněk spolu s L-O2, HEK 293 a NIH/3T3 nerakovinnými buňkami pomocí MTT testu. Výsledky ukázaly, že echinakosid závislý na dávce inhibuje proliferaci rakoviny, ale ne nerakovinných buněk (obrázek 3C). Studie průběhu léčby rakovinných buněk léčených echinakosidem o velikosti 60 μM ukázala, že po 5 hodinách nebyl žádný významný rozdíl mezi neléčenými a léčebnými skupinami, ale po 12 hodinách byla proliferace rakovinných buněk významně inhibována 60 μMEchinakosid(Obrázek 3D).

stupně buněčného cyklu průtokovou cytometrií odhalily, žeEchinakosidv závislosti na dávce se snížilo procento buněk ve fázi S i G2/M, zatímco procento buněk ve fázi G1 se zvýšilo (obrázek 4C a D). Po 80 μM echinakosidové léčbě buněk MG-63 po dobu 24 hodin se buňky ve fázi G2/M snížily z 15 % na téměř nulu a buňky ve fázi S se snížily z 37 % na 17 %, zatímco buňky ve fázi G0/1 se zvýšily ze 43 % na 80 % (obrázek 4E). Tyto výsledky naznačují, že léčbaEchinakosidvyvolal zástavu buněčného cyklu a zablokoval rakovinné buňky ve fázi G1.

Echinakosidem indukovaná apoptóza v rakovinných buňkách

V souladu s pozorováním buněčné proliferace ukázala analýza Western blot, že léčba 60 μM a 80 μMEchinakosidpo dobu 24 hodin se zvýšily hladiny aktivních proteinů kaspázy-3 a štěpených poly (ADP-ribózových) polymeráz v rakovinných buňkách (obrázek 5A a B), což naznačuje indukci apoptózy závislé na kaspáze. Poté jsme zkoumali několik buněčných markerů apoptózy. Za prvé, jaderná morfologieEchinakosid-léčené rakovinné buňky byly odhaleny barvením barvivem DNA DAPI, které ukázalo, že 24hodinová léčba 60 μM a 80 μMEchinakosidzvýšil počet charakteristických znaků apoptózy, včetně pyknózy a kondenzovaného chromatinu (jasnější jádra) (obrázek 5C). Za druhé, DNA extrahovaná z podobně ošetřených rakovinných buněk byla analyzována elektroforézou na agarózovém gelu, která odhalila typický apoptotický vzor žebříku (obrázek S1B). Nakonec byla buněčná aktivní kaspáza-3 detekována imunofluorescenčním barvením, které odhalilo silné aktivované signály kaspázy-3 vEchinakosid-léčené rakovinné buňky (obrázek S1C).

Dále bylo procento apoptotických buněk měřeno pomocí annexinu V-FITC a PI dvojité barvení a průtokové cytometrie. Analýza buněk ošetřených 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, 80 μM nebo 160 μMEchinakosidpo dobu 2 hodin, 5 hodin, 12 hodin nebo 24 hodin ukázala, že koncentrace 60 μM nebo vyššíEchinakosidindukovala významnou apoptózu v rakovinných buňkách MG-63, SK-HEP-1, MCF-7 a SW480 (obrázek 6A), ale ne v nerakovinných buňkách L-O2, HEK 293 a NIH/3T3 (obrázek S2). Po ošetření MG-63 buněk 60 μM, 80 μM nebo 160 μMEchinakosidpo dobu 24 hodin se procento apoptotických buněk zvýšilo z 8,89% na 33,72%, 39,01% a 48,12% (obrázek 6A). Studie časového cyklu ukázala, že po 5 hodinách nebyl žádný významný rozdíl mezi neléčenými a léčenými skupinami, ale významná apoptóza byla pozorována po léčbě 60 μM nebo vyššími koncentracemi echinakosidu po dobu 12 hodin (obrázky 6B a S3).

Konečně měření mitochondriálního membránového potenciálu fluorescenčním barvivem JC-1 jasně ukázalo výraznou ztrátu mitochondriálního membránového potenciálu po ošetření 60 μMEchinakosidpo dobu 12 hodin (obrázek 6C), ale ne po 5 hodinách, což naznačuje aktivaci vnitřní dráhy apoptózy po poškození DNA způsobeném zvýšeným 8-oxodG.

Phenylethanoid Glycosides in cistanche (2)

Tenproti rakoviněa protizánětlivé účinkycistanche echinakosid

Diskuse

Echinakosidje přírodní sloučenina izolovaná z léčivých rostlin Cistanche a echinacea.51,52 Bylo prokázáno, že má všestranné zdravotní propagační a preventivní vlastnosti, včetně nervové ochrany, hepatoprotekce, protizánětlivosti, antifatigue, antisenescence, antidiabetes a protinádorových aktivit.53–58 Nejznámější a nejuznávanější bioaktivitaEchinakosidje jeho antioxidační a ROS- vychytávací účinek;44,45 bylo však také prokázáno, že způsobuje oxidační poškození DNA v rakovinných buňkách, přičemž základní mechanismy zůstávají nejasné.58 V této studii, s použitím vysoce výkonného screeningového testu vitro, jsme zjistili, žeEchinakosidúčinně inhibuje enzymatickou reakci katalyzovanou MTH1. Zvýšení množství enzymu MTH1 snížilo stupeň inhibice, zatímco zvýšení množství anorganické pyrofosfatázy neovlivnilo inhibici, což naznačuje, že echinakosid specificky inhiboval aktivitu MTH1 v in vitro testu. Léčba různých lidských rakovinných buněčných linií echinakosidem způsobila významné zvýšení buněčné hladiny 8-oxoG bez změny buněčné hladiny ROS. Vzhledem k tomu, že samotný echinakosid je silným antioxidantem, tyto výsledky naznačují, že zvýšená intracelulární hladina 8-oxoG byla pravděpodobně výsledkem inhibice buněčného MTH1 echinakosidem.

Léčba přípravkemEchinakosidzpůsobil rozsáhlé poškození DNA a významnou upregulaci blokátoru G1/S-CDK p21, po nichž následovala výrazná apoptotická buněčná smrt a potlačení buněčné proliferace specificky u rakoviny, ale ne u nenádorových buněk. Dále výrazná ztráta mitochondriálního membránového potenciálu po

Echinakosidléčba ukázala aktivaci vnitřní dráhy apoptózy.Echinakosid-indukované poškození DNA a upregulace p21 byly pozorovány během 5 hodin léčby, zatímco apoptóza rakovinných buněk, narušení potenciálu mitochondriální membrány a inhibice růstu byly pozorovány 12 hodin po zahájení léčby. Tyto údaje potvrzují, že apoptóza rakovinných buněk a inhibice růstu byly výsledkem rozsáhlých poškození DNA způsobených inhibicí MTH1. Nedávné studie ukázaly, že zmenšení velikosti buněčného fondu dNTP by mohlo také vyvolat stres replikace DNA a poškození DNA.59,60 Nicméně 200% zvýšení hladiny 8-oxoG v rakovinných buňkách léčených echinakosidy argumentuje proti možnosti zmenšení velikosti dNTP bazénu a Bcl2, protein, který snižuje velikost dNTP bazénu,60 byl významně snížen v rakovinných buňkách SW480 léčených Echinakosidy;58 navíc, naše data jasně ukázala, že Echinakosid přímo inhibuje MTH1, který by mohl být alespoň částečně zodpovědný za poškození DNA a buněčné účinky způsobené Echinakosidem.

Fond dNTP je kritickým cílem ROS a oxidované dNTP jsou důležitými zdroji oxidačního poškození DNA.3,10 SSB a DSB DNA spojené s opravou mohou vést k buněčné senescenci a apoptóze, které se podílejí na stárnutí a vysokém stupni intratumorální heterogenity a vysoké mutační rychlosti v rakovinných buňkách. Naproti tomu inhibice MT1 se zaměřuje na fenotyp, který odlišuje většinu rakovinných buněk od normálních buněk, a proto představuje novou protinádorovou strategii, která není omezena genetickými adaptacemi. Zajímavé je, že antagonisté malých molekul antiapoptózního proteinu Bcl266,67 a agonisté proapoptózy Bax68 byli vyvinuti a bylo prokázáno, že jsou slibnými novými protinádorovými látkami. Vzhledem k jejich komplementárním mechanismům účinku by kombinace inhibitorů MTH1 a chemikálií podporujících apoptózu vytvořila vzrušující novou generaci protinádorových léků.

Poprvé jsme demonstrovali novou funkci Echinacosidu jako protinádorové přírodní sloučeniny. V in vitro testu Echinacosid inhiboval MTH1 IC50 7,01 μM. Tato hodnota IC50 je vyšší než u dosud hlášených inhibitorů MTH1.32,33,69 Použitím (S)-krizotinibu jako pozitivní kontroly jsme ukázali, že náš test je sedmkrát méně citlivý než test používaný Huberem et al.33 Skutečný IC50 echinakosidu je tedy pravděpodobně nižší. Nicméně, aby se vyvinula jako terapeutické činidlo, účinnost přírodní molekuly Echinacosidu bude pravděpodobně muset být zlepšena. Jako přírodní produkt, který byl po dlouhou dobu používán jako bylinný lék, by Echinakosid mohl sloužit jako dobré chemické lešení pro vývoj účinných a pravděpodobně bezpečných inhibitorů MTH1.37,70 Vzhledem k tomu, že přírodní produkty jsou bohatým zdrojem nových chemických lešení pro racionální konstrukci založené na konstrukci léků,70 přístupy podobné tomu, co jsme zde použili,

spolu s obrovským zájmem o přírodní produkty pro objevování léků budou užitečné při hledání cílených, účinných a bezpečných nových léků.

echinacoside in cistanche (2)