Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Pls klikněte zde pro část 1

Pls klikněte sem pro část 3

Cistanche může zlepšit paměť

Vzhledem k těmto zjištěním jsme dále zkoumali, zda upregulovaná hipokampální exprese miR-466f{1}}p u myší při prostorovém učení aPaměťtvorba také ovlivnila morfologii neuronů in vivo. Významně jsme zjistili, že průměrná hustota páteře hipokampálních neuronů myší GLN byla vyšší než hustota PLN myší, jak odhalila Golgiho impregnace pyramidy

Obrázek 3. Účinky změny úrovní exprese hipokampální miR-466f-3p na výkonnost myši MWM

(A) Experimentální časová osa úlohy MWM, analýza exprese nebo elektrofyziologické měření mozků myší po injekci lentiviru.

(B) Levé panely: exprese dsRed v myším hipokampu. Reprezentativní snímky hippocampu s nízkým a vysokým zvětšením od myší infikovaných rekombinantními lentiviry vyjadřujícími dsRed-only jako kontrolu (levý sloupec obrázků) nebo miR-466f-3p plus dsRed (vpravo sloupec obrázků). Oblasti v rámečku dvou horních obrázků jsou zvětšeny a zobrazeny níže. Měřítko, 100 mm. Tečkované čáry označují hranice DG. Jádra byla obarvena DAPI. GCL, vrstva granulárních buněk; ML, molekulární vrstva. Pravý histogram, relativní úrovně exprese miR-466f-3p v myším hipokampu infikovaném lentivirem exprimujícím kontrolu nebo miR-466f{10}}p, jak bylo stanoveno pomocí RT-qPCR ( n=16 na skupinu).

(C) Výkony MWM myší infikovaných různými rekombinantními lentiviry, zabalenými s použitím pěti různých plazmidů exprimujících dsRed-only, miR-466f-3p, mut-miR-466f{ {5}}p, respektive miR/SCR-houby do jejich hipokampu (n=13, 26, 16, 19 a 11 na skupinu, v tomto pořadí). Levý panel: úniková latence během tréninku. Pravý panel: individuální úniková latence na 6. relaci.

Data uvedená v (B) jsou uvedena jako průměr ± SD a data uvedená v (C) jsou uvedena jako průměr ± SEM. Statistická významnost byla hodnocena nepárovým t testem (B), dvoucestnou ANOVA s Bonferroniho post hoc srovnáním (C, levý panel) nebo jednou ANOVA s Tukeyho post hoc testem (C, pravý panel). Statistické rozdíly: #p < 0.05,="" **/##p="">< 0,01="" a="" ****p="">< 0,0001;="" *mir-466f-3p="" oproti="" ostatním;="" #mir-houba="" versus="">

neurony v GLN a PLN myším hipokampu (obrázek S3). Tato zjištění ukazují, že upregulace hipokampální miR-466f{2}}p podporuje růst neuritů a tvorbu dendritické páteře, což je podobné indukci hustoty páteře pozorované v hipokampu GLN myší ve srovnání s PLN myší.

miR-466f{1}}p pozitivně moduluje prostorové učení myši aPaměťvýkon, stejně jako synaptická plasticita

Chcete-li zjistit, zda miR-466f{1}}p pozitivně reguluje prostorové učení myši aPaměťK nadměrné expresi miRNA v myším hipokampu jsme použili přístup rekombinantní lentivirové infekce. Myši byly analyzovány 7 dní po injekci lentiviru do DG (obrázek 3A). Reprezentativní snímky úrovní exprese kyčle miR-466f{4}}p byly skutečně zvýšené ve skupině s nadměrnou expresí miR-466f-3p ve srovnání s kontrolní skupinou (pravý histogram na obrázku 3B). Zjistili jsme, že myši s hipokampální nadměrnou expresí miR-466f- 3p a podrobené úloze MWM vykazovaly únikové latence 88 ± 5 s v 1. relaci a 19 ± 1 s v 6. relaci (červená tečkovaná čára, obrázek 3C), které byly lepší než u myší vektorové kontroly (černá čára) nebo mutantních kontrolních myší (čára s červeným kroužkem) a podobné únikovým latencím u myší GLN popsaných na obrázku 1A. Paralelně jsme zkoumali vliv ztráty funkce miR-466f-3p na prostorové učení aPaměťinhibicí miR-466f-3p pomocí miR-houby. Je pozoruhodné, že výkon MWM myší, u kterých byl hipokampální miR-466f{4}}p zachycen miR-houbou, byl podobný jako u myší PLN, tj. nenaučily se najít platformu ani po poslední relace (plná zelená čtvercová čára,

Obrázek 3C). Kromě toho se nezdálo, že by myši injikované lentivirem narušily homeostatickou plasticitu, protože některé myši v každé skupině se během posledního sezení naučily nebo alespoň byly v procesu učení (obrázek 3C, pravý histogram).

Vzhledem k tomu, že nadměrná exprese miR-466f{1}}p v myším hippocampu zlepšila jejich učení aPaměťjsme analyzovali srovnávací elektrofyziologii kultivovaných hipokampálních neuronů exprimujících různé úrovně miR-466f{1}}p. Miniaturní excitační postsynaptický proud (mEPSC) z hipokampálních neuronů DIV14 nadměrně exprimujících miR-466f-3p nebo mut-miR-466f-3p, miR-houbu nebo kontrolu zaznamenané pomocí celobuněčných patch svorek. Zatímco mezi čtyřmi sadami vzorků nebyly žádné významné rozdíly v amplitudě mEPSC, vzestupu Tau nebo poklesu Tau, frekvence mEPSC neuronů nadměrně exprimujících miR-466f-3p byla významně vyšší ve srovnání s jiné skupiny (obrázek 4A), což ukazuje, že postsynaptické glutaminergní receptory byly silněji aktivovány po nadměrné expresi miR-466f{15}}p.

Poté jsme měřili dlouhodobou potenciaci (LTP), abychom přímo určili roli miR-466f-3p v synaptické plasticitě in vivo. Do hippocampu myší jsme vstříkli rekombinantní lentivirus, jak je popsáno na obrázku 3, a poté jsme indukovali řezy LTP hippocampals tetanickou stimulací (tři řady vysokofrekvenční stimulace [3xHFS]) Schafferovy kolaterální dráhy. Zjistili jsme, že náš protokol indukoval LTP ve všech skupinách, jak dokazuje přetrvávající nárůst polních excitačních postsynaptických potenciálů (fEPSP) v oblasti cornu ammonis 1 (CA1) (obrázek 4B, levý panel). LTP byl silnější u řezů s nadměrnou expresí miR-466f{10}}p (188 procent ± 2 procenta výchozí hodnoty 40–50 minut po stimulaci, průměr ± SEM) ve srovnání s mutanty (169 procent ± 1 procento výchozí hodnoty), houba SCR (173 procent ± 3 procenta výchozí hodnoty) a řezy infikované kontrolním virem (159 procent ± 2 procenta výchozí hodnoty), jako inhibice miR-466f-3p miR-houba snížila LTP (128 procent ± 1 procento výchozí hodnoty) ve srovnání s kontrolami (obrázek 4B, pravý panel). Také jsme měřili LTP skupin GLN a PLN po tréninku. Příslušná data také odhalila významné rozdíly ve sklonu fEPSP v oblasti CA1 mezi skupinami GLN a PLN (obrázek 4C). Zvýšená hladina miR-466f-3p tedy zvyšuje LTP a synaptickou plasticitu, což zase může podporovat učení aPaměťschopnost myší. Údaje uvedené na obrázcích 2, 3 a 4 společně ukazují, že miR-466f-3p hraje zásadní pozitivní roli v prostorovém učení aPaměťformace, pravděpodobně zvýšením tvorby páteře, LTP a síly synaptické plasticity.

Mef2a mRNA je regulačním cílem miR-466f-3p

Provedli jsme bioinformatickou analýzu, abychom identifikovali potenciální cílové mRNA regulované vazbou miR-466f{1}}p na jejich 30 UTR. Mezi kandidáty, které jsme identifikovali, byla Mef2a mRNA kódující MEF2A. Je zajímavé, že dříve bylo zjištěno, že exprese MEF2A je po tréninku MWM downregulována a nadměrná exprese tohoto faktoru měla negativní vliv na výkonnost myší (Cole et al., 2012). Proto jsme použili luciferázový reportérový test ke zkoumání, zda miR-466f-3p reguluje translaci mRNA Mef2a vazbou na její 30 UTR. Vložili jsme divoké nebo mutantní sekvence Mef2a 30 UTR downstream od cDNA luciferázy řízené SV40-promotorem (Luc), což vedlo k reportérovému plazmidu psiCHECK2-MEF2A 30 UTR nebo psiCHECK2- mut-MEF2A 30 UTR (obrázek 5A). Jak je znázorněno na levém histogramu na obrázku 5B, koexprese miR-466f-3p zeslabila expresi luciferázy řízenou Mef2a 30 UTR. Zdá se, že tento účinek závisí na interakci mezi miR-466f-3p a Mef2a 30 UTR, protože mutace buď předpokládaného vazebného místa miR-466f-3p na Mef2a 30 UTR (50-UGU-GUAU-30) nebo seed oblast miR-466f-3p (50-AUACACA-30) rozpoznání Mef2a 30 UTR zrušilo inhibiční účinek miR-466f-3p na aktivitu luciferázy (obrázek 5B, střední histogram). Kromě toho koexprese miR-houby, ale ne CR houby, také eliminovala represivní účinek miR-466f-3p na aktivitu luciferázy (obrázek 5B, histogram vpravo). Pozoruhodné je, že ani nadměrná exprese miR-466f-3p ani miR-houba neměly žádný vliv na hladiny Mef2a mRNA v primárních hipokampálních neuronech (obrázek 5C), ale snížily nebo zvýšily, resp. hladina proteinu MEF2A (obrázek 5D). Zjistili jsme také, že nadměrná exprese miR-466f{63}}p nebo miR-houby, v tomto pořadí, downregulovala nebo upregulovala hladinu mRNA aktivně regulovaného cytoskeletálního asociovaného proteinu (Arc) v primárních hipokampálních neuronech (obrázek 5C) , což byl známý downstream cíl pozitivně regulovaný MEF2A (Flavell et al., 2006)

Provedli jsme také fluorescenční in situ hybridizaci (FISH) k detekci miR-466f{1}}p a zkombinovali jsme ji s IF značením MEF2A v primárních hipokampálních neuronech DIV14 bez léčby forskolinem nebo s ním. Je známo, že forskolin indukuje chemický LTP a aktivuje adenylylcyklázu, čímž zvyšuje intracelulární hladiny cAMP. Pozorovali jsme jadernou kolokalizaci MEF2A pomocí miR-466f- 3p, jak ilustrují reprezentativní obrázky na obrázku 5E. Po stimulaci forskolinem se však signál miR-466f-3p zvýšil v soma i dendritech, zatímco signál MEF2A v

nucleus se zmenšil, jak ukazují reciproční změny intenzit signálů MEF2A a Fast Red jednotlivých neuronálních buněk (obrázek 5E). V souhrnu data na obrázcích 5A–5E naznačují, že miR-466f{5}}p negativně reguluje expresi proteinu MEF2A vazbou na 30 UTR mRNA Mef2a a následně potlačuje její translaci.

V souladu s výše popsanými výsledky jsme zjistili, že hipokampální hladiny proteinu MEF2A byly downregulovány u myší GLN po tréninku MWM, ale ne u myší PLN (obrázek 5F). Kromě toho relativní hladiny MEF2A u jednotlivých myší GLN (tečky) a myší PLN (čtverečky) nepřímo korelovaly s hladinami miR-466f-3p (R=0.60, Obrázek 5G). Tedy heterogenní vzorce prostorového učení aPaměťschopnosti jsou modulovány stochastickým zvýšením hipokampální miR- 466f{1}}p u jednotlivých myší a následným snížením MEF2A po stimulaci neuronální aktivity.

Stochastická aktivace hipokampálního CREB a následná transkripční upregulace klastru miR- 466-669 během tréninku MWM

Zkoumali jsme mechanismy, pomocí kterých by mohla být miR-466f{1}}p v myším hipokampu stochasticky zvýšena pomocí úlohy MWM. Existují tři prekurzory miRNA kódující miR-466f{3}}p, z nichž všechny patří do klastru miR-466-669 specifického pro hlodavce, který se nachází v intronu 10 jeho hostitelského genu, mSfmbt2 (Inoue et al. ., 2017) (obrázek 6A). Zajímavé je, že na rozdíl od miR-466f{11}}p nebyl mezi skupinami GLN a PLN žádný významný rozdíl v hladinách exprese mSfmbt2 (obrázek 6B), což naznačuje, že klastr miR-466-669 by mohl kódovat samostatný transkript místo toho, aby byl součástí primárního přepisu mSfmbt2. V souladu s tím jsme navrhli několik sad primerů k identifikaci domnělého primárního transkriptu miR-466-669 klastru pomocí RT-qPCR. Jak je znázorněno na obrázku 6A, dlouhý fragment PCR (plus 282 až 2 381) spolu se sérií překrývajících se pásů qPCR, jmenovitě A (plus 282 až 115), B (131 až 406), C (388 až 686), D ( 662 až 1 028), E ( 1 004 až 1 299), F ( 1 242 až 1 629), G ( 1 605 až 2 029) a H ( 2 005 až 2 381), bylo možné detekovat v myším hippocampu, ale ne část I ( 2, 3) ) (data nejsou uvedena). Tato data podporují, že miR-466-669 klastr kódoval dlouhý transkript blízko přibližně 2 388 bp upstream od prvního miRNA prekurzoru (tj. pre-mir-466}m, označený plus 1 na obrázku 6A). Je pozoruhodné, že podobně jako u miR-466f-3p, byla průměrná hladina tohoto transkriptu v hipokampu myší GLN vyšší než u myší PLN (obrázek 6C). Tak, lepší učení aPaměťschopnost GLN myší je způsobena transkripční aktivací miR-466-669 klastru.

Aktivace jaderného CREB fosforylací během úkolů MWM nebo v jiných formách učení je kritickým krokem pro přeměnu krátkodobého na dlouhodobé.Paměť(Lisman a kol., 2018; Rogerson a kol., 2014). Zkoumali jsme proto, zda mohou různé úrovně miR-466f{4}}p mezi jednotlivými myšmi, které podstoupily úlohu MWM, korelovat se stavem aktivace CREB. Abychom tuto myšlenku prozkoumali, nejprve jsme zkoumali hladiny fosforylace hipokampálního CREB u jednotlivých myší. Jak je znázorněno na obrázku 6D, aktivace CREB (fosforylací na zbytku S-133) byla zvýšena u myší GLN vzhledem k myším PLN a HC. Také jsme potvrdili, že miR-466f{8}}p byl skutečně koexprimován s pCREB v neuronech provedením miRNA ISH v kombinaci s IF barvením pCREB a MAP2 v primárních hipokampálních neuronech (obrázek S2A). Kromě toho hladiny primárních transkriptů klastru miR- 466-669 pozitivně korelovaly s pCREB u myší GLN (R=0.52), zatímco s pCREB u myší PLN (R=0) negativně korelovaly 71) (obrázek 6E). Zkontrolovali jsme korelaci mezi hladinami dalšího aktivního faktoru, fosfo-extracelulárním signálem regulované kinázy (pERK), a hladinami primárních transkriptů miR-466-669 klastru. Zjistili jsme, že oba typy myší trénovaných MWM vykazovaly pozitivní korelace mezi miR-466-669 clusterovým signálem a pERK (R=0,59 a 0,48, v tomto pořadí; obrázek S4A) a nebyl žádný rozdíl v pERK/ Exprese tERK mezi těmito dvěma skupinami (obrázek S4B). Abychom dále objasnili dopad aktivace CREB na transkripční lupregulaci jejich R-466-669klastru a následně,

indukce miR-466f{1}}p, použili jsme specifický inhibitor CREB,666- 15 (Xie et al., 2015), v kombinaci s forskolinem léčbou primárních hipokampálních neuronů DIV14. Je známo, že forskolin aktivuje fosforylaci CREB (Malhotra et al., 2015). Zjistili jsme, že předběžné ošetření primárních hipokampálních neuronů pomocí 666-15 blokovalo forskolinem indukovanou aktivaci CREB (obrázek 6F) a snížilo hladiny miR-466f{10}}p a miR-466-669 klastru přepis (obrázky 6G a 6H). Současně byly po léčbě 666-15 také sníženy hladiny mRNA známých cílových genů pCREB nurr1 a homer1a (Bridi et al., 2017; Jensen et al., 2017) (obrázek 6H). Celkem vzato, Obrázek 6 ukazuje, že stochastická aktivace CREB v hipokampu subpopulace inbredních myší podstupujících úkol MWM indukuje transkripci klastru miR-466-669 a následně indukci miR-466f{{23 }}p, čímž se zlepší jejich prostorové učení aPaměťschopnost lépe plnit daný úkol.

DISKUSE

Zkoumali jsme možnou roli miRNA při modulaci různé schopnosti prostorového učení aPaměťmezi inbredními myšmi C57BL/6J. Navrhujeme, aby stochastická aktivace CREB a následná upregulace hipokampální miR-466f{3}}p odpovídala za větší prostorové učení aPaměťschopnost podskupiny našich testovacích myší, pravděpodobně díky miR-466f{1}}p zprostředkujícím translační inhibici mRNA Mef2a, která kódujePaměťnegativní regulátor MEF2A. Naše zjištění poskytují scénář demonstrující funkční a evoluční roli specifické miRNA při regulaci kognice prostřednictvím stochastické indukce osy CREB-pCREB-miR-466f-3p-MEF2A podněty z prostředí.

Úloha MWM byla široce používána ke zkoumání různých schopností prostorového učení aPaměťpro hlodavce. Za normálních podmínek používají hlodavci k orientaci distální narážky, které jim umožňují naučit se a zapamatovat si polohu skryté plošiny v úkolu. Většina našich testovaných inbredních myší C57BL/6J (62 procent) vykazovala normální vzorec únikové latence, přičemž platformu nalezly do 30 s od 3.-6 relací (obrázek 1A, GLN). Naproti tomu skupina myší (38 procent) se úkol nenaučila ani do 6. sezení (PLN). Pozoruhodně jsme také podrobili myši dvěma dalším rozpoznávacím testům. Prvním byl test rozpoznávání nových objektů (NOR), což je jediná zkouška založená na vrozeném zkoumání bez posilování nebo stresu k motivaci chování (Leger et al., 20}13). Korelace mezi úkoly NOR a MWM, pokud jde o výkon myší, je špatná (R {{1{{20}}}}.13), což je podobné korelaci mezi výkonem NOR a úrovněmi exprese v hipokampu miR-466f-3p (R=0.01; data nejsou uvedena). Test NOR také neodhalil žádné rozdíly v diskriminačním indexu mezi skupinami MWM GLN a PLN (0,36 ± 0,25 oproti 0,29 ± 0,18; obrázek S1B). Ostatní prostorové učení aPaměťzávislým úkolem, který jsme použili, je Barnesovo bludiště (BM), které je podobné MWM. Vychází z předpokladu, že hlodavci umístění do averzního prostředí by se měli naučit a zapamatovat si umístění únikového boxu umístěného pod povrchem plošiny. Jak je znázorněno na obrázku S1C, zjistili jsme, že výkony myší ve studiích sondy BM také pozitivně korelují s hladinami hipokampální exprese miR-466f-3p. Indukce osy CREB-pCREB-miR-466f-3p-MEF2A v hipokampu během učení aPaměťformace je prostorově závislá na kontextu.