Část 1: Proteinurické chronické onemocnění ledvin je spojeno se změněnou délkou života, deformovatelností a metabolismem červených krvinek

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Rosi Bissinger a kol

¹Divize endokrinologie, diabetologie a nefrologie, Interní klinika, Fakultní nemocnice Tübingen, Tübingen, Německo;²Ústav biochemie a molekulární genetiky, University of Colorado Anschutz Medical Campus, Aurora, Colorado, USA;³Divize hematologie, University of Colorado Denver, Aurora, Colorado, USA;⁴Institut molekulární a buněčné sportovní medicíny, Německá sportovní univerzita v Kolíně nad Rýnem, Köln, Německo;⁵Institut pro výzkum diabetu a metabolických onemocnění (IDM) Helmholtzova centra Mnichov na univerzitě v Tübingenu, Tübingen, Německo;⁶Německé centrum pro výzkum diabetu (DZD) na univerzitě Tübingen, Tübingen, Německo;⁷Centrum klinické transfuzní medicíny, Univerzitní nemocnice v Tübingenu, Tübingen, Německo;⁸Ústav patologie, Univerzita Eberharda Karla Tübingen, Tübingen, Německo;⁹Dermatologická klinika, Univerzita Eberharda Karla Tübingen, Tübingen, Německo;¹⁰Ústav orální biologie, Fakulta zubního lékařství, University of Oslo, Oslo, Norsko;¹¹Ústav medicíny, Univerzitní lékařské centrum Hamburg-Eppendorf, Hamburk, Německo; a¹²Fakulta zdravotnických věd, Ontario Tech University, Oshawa, Ontario, Kanada

Anémie je častou komplikacíchronické onemocnění ledvinovlivňující kvalitu života pacientů. Mezi různými faktory, jako je nedostatek železa a erytropoetinu, se na patogenezi anémie podílí snížená životnost červených krvinek (RBC). Nicméně mechanistická data o dysfunkci červených krvinek in vivo vnemoc ledvinchybí. Zde popisujeme vývoj anémie související s chronickým onemocněním ledvin u myší s proteinurickým onemocněním ledvin, které je důsledkem buď podávání doxorubicinu, nebo indukovatelného nedostatku podocinu. V obou experimentálních modelech se anémie projevila 10. den a progredovala 30. den navzdory zvýšeným hladinám cirkulujícího erytropoetinu a erytropoéze v kostní dřeni a slezině.

Cirkulující erytrocyty v obou myších modelech vykazovaly změněnou morfologii a sníženou osmoticky citlivou deformovatelnost spolu se zvýšenou externalizací fosfatidylserinu na vnější plazmatickou membránu, což je charakteristický znak smrti RBC. Fluorescenční značení červených krvinek v den 20 u myší indukovanou doxorubicinemnemoc ledvinodhalilo předčasné vymizení z oběhu. Metabolomické analýzy erytrocytů z obou myších modelů prokázaly dočasné změny v redoxních recyklačních drahách a Landsově cyklu, což je proces remodelace membránových lipidů. Anemičtí pacienti s proteinuriínemoc ledvinměli zvýšený podíl cirkulujících červených krvinek pozitivních na fosfatidylserin.

Naše pozorování tedy naznačují, že snížená životnost červených krvinek, zprostředkovaná změněným metabolismem červených krvinek, snížená deformovatelnost červených krvinek a zvýšená buněčná smrt přispívají k rozvoji anémie u proteinurických onemocnění.nemoc ledvin.

Kidney International (2021) 100, 1227–1239; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2021.08.024

KLÍČOVÁ SLOVA:Cistanche, výhody Cistanche,nemoc ledvin, selhání ledvin, chronické onemocnění ledvinanémie, buněčná smrt; deformovatelnost, Landsův cyklus; metabolismus; proteinurie; červené krvinky; redoxní recyklace

Copyright ª 2021, International Society of Nephrology. Vydalo Elsevier Inc. Toto je článek s otevřeným přístupem pod licencí CC BY-NC-ND

Výhody Cistanche funkce ledvin.

Překladové prohlášení

Tato studie prokazuje, že proteinuricnemoc ledvinu myších modelů vede k předčasnému odstranění červených krvinek (RBC), což nakonec způsobí rozvoj anémie. Zvýšená úmrtnost červených krvinek se vyskytuje také u pacientů schronické onemocnění ledvina anémie. Dysfunkce červených krvinek v uremickém prostředí je důležitým mechanismem ztráty červených krvinek a rozvoje anémie související s onemocněním ledvin, bez ohledu na endogenní sekreci erytropoetinu.

Rozvoj anémie je typickou komplikací pokročilýchchronické onemocnění ledvin(CKD) a je spojena se zhoršenou kvalitou života1 a zvýšeným rizikem kardiovaskulárních příhod²a hospitalizace,³stejně jako pokles kognitivních funkcí.4 Závažnost anémie byla považována za nezávislý prediktor mortality u dialyzovaných i nedialyzovaných pacientů s CKD.⁵ Patofyziologie anémie související s onemocněním ledvin je složitá a zahrnuje nedostatek železa a erytropoetinu (EPO) v rámci zánětu nízkého stupně, který zase ohrožuje normální erytropoézu u pacientů s CKD.6 U pokročilého CKD je odpověď EPO nedostatečná nízká ve vztahu ke stupni anémie.^7,8Vysoká prevalence současného deficitu železa u CKD je důsledkem narušené homeostázy železa.⁹ Opomíjeným mechanismem ztráty železa u CKD je proteinurie, která může vést ke ztrátám železa vázaného na transferin močí (až 0,3 mg/d), když proteinurie dosáhne nefrotického rozmezí.¹⁰

Another factor that is thought to contribute to anemia in CKD patients is the shortened lifespan of red blood cells (RBCs), first described >před 60 lety.^6,11,12Nedávná studie využívající dechový test na oxid uhelnatý prokázala, že délka života červených krvinek se progresivně zkracovala ze 120 dnů u pacientů s CKD 1. stupně na 60 dnů u pacientů s 5. stupněm CKD.¹³Pozoruhodné je, že po transfuzi alogenních červených krvinek od zdravých dárců pacientům s CKD následovalo rychlé vymizení transfundovaných červených krvinek bez známek hemolýzy.¹²Pravděpodobným mechanismem pro toto pozorování může být stimulace buněčné smrti podobné apoptóze v bezjaderných červených krvinkách, což označuje vzorec poškození, při kterém není narušena integrita buněčné membrány a obsah cytoplazmy zůstává nedotčen.¹⁴Červené krvinky podstupující buněčnou smrt vykazují různé morfologické změny vyplývající z poškození cytoskeletu, jako je tvorba povrchových váčků, ztráta elasticity membrány a/nebo buněčná dehydratace.¹⁵Na molekulární úrovni je smrt červených krvinek spojena s intracelulární akumulací Ca2+, změněným stavem buněčné energie a rozpadem fosfolipidové asymetrie, což nakonec vede k externalizaci fosfatidylserinu (PS) na vnější plazmatickou membránu.^15,16V důsledku toho makrofágy a specializované dendritické buňky rychle rozpoznávají PS-externalizované RBC, což vede k erytrofagocytóze a jejich katabolismu ve slezině a játrech.¹⁷

Vzhledem k matoucí patofyziologii anémie související s onemocněním ledvin u lidí jsou studie na zvířatech oprávněné, aby přesně určily přispívající mechanismy. Nefropatie vyvolaná doxorubicinem (DIN) u myší 129S1/SvImJ18 a myší s indukovatelným nedostatkem podocinu (Nphs2Dipod)¹⁹jsou 2 modely, které se vyznačují indukcí proteinurie v nefrotickém rozsahu během dnů, progresí doselhání ledvinpo 3 týdnech a smrt za 6 až 7 týdnů.^19–21Oba myší modely účinně rekapitulují všechna stádia lidského CKD. V této studii jsme testovali, zda progresivníselhání ledvinu těchto myší s proteinuriínemoc ledvinovlivňuje životnost červených krvinek a přispívá k anémii. Paralelně jsme zkoumali fenotyp RBC v krvi odebrané pacientům s CKD s proteinurií nefrotického rozsahu.

Cistanche léčí chronické onemocnění ledvin a chrání ledviny

METODY

Podrobné informace o materiálech a metodách jsou uvedeny v Doplňkových materiálech a metodách.

Studie myší

Experimenty byly provedeny na 8-týdenních divokých myších 129S1/SvImJ obou pohlaví (Charles River). DIN byla indukována jedinou injekcí doxorubicinu (14,5 mg/g tělesné hmotnosti), jak bylo popsáno dříve.^18,22Ke kontrole myelotoxického účinku doxorubicinu, který nesouvisí s rozvojem nefropatie, byly myši C57BL/6 rezistentní na doxorubicin také podrobeny stejnému léčebnému protokolu.23 Kromě toho byly podobné experimenty provedeny na 8-týdenních myších s indukovatelná delece myší podocin (B6-Nphs2tm3.1Antc*Tg [Nphs1-rtTA*3G]8Jhm*Tg[tetO-cre]1Jaw) nebo Nphs2Dipod myší, které byly léčeny doxycyklinem po dobu 14 dnů.¹⁹Všechny pokusy na zvířatech byly prováděny v souladu s příručkou Národního institutu zdraví pro péči a používání laboratorních zvířat a německým zákonem o dobrých životních podmínkách zvířat se souhlasem místních úřadů (Regierungspräsidium Tübingen, čísla schválení M12/17 a M17/19G ).

Experimentální design studií na myších je uveden na doplňkovém obrázku S1.

Pacienti

Pacientská studie byla provedena v souladu s Helsinskou deklarací a byla schválena místní etickou komisí Fakultní nemocnice Tübingen (556/2018BO2). Lithium-heparinové vzorky krve a moči byly získány od pacientů s proteinurií v nefrotickém rozsahu a zachovanou rychlostí glomerulární filtrace (GFR; stadia 1–2; n 10) a pacientů se sníženou GFR (CKD stadium 3–5; n 15) na univerzitě Nemocnice Tübingen. Jako kontrolní skupina byla krev od zdravých dobrovolníků stejného věku a pohlaví (n 25) poskytnuta krevní bankou Fakultní nemocnice Tübingen. Všechny lidské vzorky byly odebrány po informovaném souhlasu. Klinické charakteristiky pacientů jsou uvedeny v tabulce 1.

Analýzy průtokovou cytometrií

Různé parametry smrti RBC buněk byly stanoveny průtokovou cytometrií.¹⁴ Ke stanovení životnosti červených krvinek in vivo bylo do retroretro vstřikováno 25 ml 5,6-karboxyfluorescein diacetát sukcinimidylesteru [5(6)-CFDA, SE] barviva v koncentraci 9,96 mM (rozpuštěné v dimethylsulfoxidu). -orbitální plexus myší s injekcí divokého typu 129S1/SvImJ a doxorubicinem, jak bylo popsáno dříve.²⁴ V uvedených časových bodech byla myším odebrána krev z retroorbitálního plexu a procento 5(6)-CFDA, SEþ buněk bylo detekováno analýzou průtokovou cytometrií. Nakonec byla data analyzována pomocí softwaru FlowJo (FlowJo LLC).

Deformovatelnost červených krvinek a osmotická gradientová ektacytometrie Deformovatelnost červených krvinek byla měřena pomocí laserem asistovaného optického rotačního analyzátoru buněk (LORCA MaxSis; RR Mechatronics), který byl podrobně popsán jinde.²⁵ Rovněž byly provedeny analýzy osmotického gradientu ektacytometrie (osmoscan) pomocí LORCA MaxSis a měřena deformovatelnost za různých osmotických podmínek.²⁶

Histologické vyšetření

Pro barvení hematoxylinem a eosinem byly sleziny a stehenní kosti obarveny hematoxylinem a eosinem. Všechna sklíčka byla obarvena primární protilátkou Ter 119 (BD Pharmingen; ředění 1:500). Pro barvení kyselinou jodistou – Schiff, 2,{4}} mm silné plátky ledvin byly obarveny kyselinou jodistou – Schiffovým činidlem (Carl Roth) a hematoxylinem (abcam). Barvení May-Grünwald-Giemsa (Pappenheimova metoda) bylo provedeno za účelem stanovení změn tvaru červených krvinek, jak bylo popsáno dříve.²⁷ Izolace glomerulů byla provedena pomocí biotinylačního přístupu a buněčného třídění.¹⁹ Pro proteinovou detekci podocinu byla aplikována protilátka od Sigma (P0372).¹⁹ K barvení jader byl použit Roti-Mount Fluor Care 40,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI; Carl Roth).

Ultra-výkonná kapalinová chromatografie-hmotnostní spektrometrie metabolomika z myších červených krvinek

Analýzy byly provedeny tak, jak bylo dříve publikováno.²⁸ Stručně řečeno, analytická platforma využívá systém ultra-vysokoúčinné kapalinové chromatografie Vanquish (Thermo Fisher Scientific) připojený online k hmotnostnímu spektrometru Q Exactive (Thermo Fisher Scientific).

Statistické analýzy

Data jsou poskytnuta jako aritmetický průměr SEM nebo jako medián s interkvartilním rozsahem (25.–75. percentil), kde n představuje počet použitých zvířat nebo zahrnutých pacientů. Data byla testována na normalitu pomocí Kolmogorov-Smirnovova testu, D' Ag-ostino testu a Shapiro-Wilkova testu. Odchylky byly analyzovány Bartlettovým testem na stejné odchylky. Tukey nebo Dunn vícenásobný srovnávací posttest, nepárový Student t test nebo Mann-Whitney U test byly provedeny pomocí GraphPad Prism 8 (GraphPad Software). P < 0.05="" s="" 2-tailed="" testováním="" bylo="" považováno="" za="" statisticky="" významné.="" další="" grafy="" byly="" vyneseny="" pomocí="" graphpad="" prism="">

VÝSLEDEK

Experimentální proteinurické onemocnění ledvin indukuje u myší anémii

Po indukci se u myší 129S1/SvImJ s myšmi DIN a Nphs2Dipod vyvinula proteinurie nefrotického rozsahu (obrázek 1a a doplňkový obrázek S2C) a progresivníselhání ledvinvyznačující se vysokými hladinami močoviny v plazmě od 20. dne dále (obrázek 1b a doplňkový obrázek S2D). Během prvních 10 dnů u myší došlo k nárůstu tělesné hmotnosti s ascitem (obrázek 1c a doplňkový obrázek S2E), což odráží retenci sodíku způsobenou vylučováním serinových proteáz nebo proteasurie.¹⁸ Po spontánním zvratu retence sodíku tyto myši neustále hubly. U myší s DIN a u myší Nphs2Dipod odhalily snímky světelné mikroskopie zachycené po 10 dnech typické histomorfologické změny konzistentní s fokální segmentální glomerulární sklerózou (obrázek 1d a doplňkový obrázek S2B). Ty chyběly u myší C57BL/6 s injekcí doxorubicinu (obrázek 1d). Léčba doxorubicinem vyvolala silný pokles hemoglobinu, počtu červených krvinek a hematokritu (obrázek 1e–g) od 10. dne u myší 129S1/SvImJ a C57BL/6, které byly normalizovány ve dnech 20 a 30. 20. a 30. den se u myší s injekcí doxorubicinu 129S1/SvImJ a u myší s deficitem podocinu vyvinula progresivní anémie, charakterizovaná sníženým středním korpuskulárním objemem (obrázek 1h) a sníženým hemoglobinem (doplňkový obrázek S2F), což naznačuje, že anémie je spojena s progresivnímselhání ledvina ne s léčbou doxorubicinem jako takovou.

Anémie u experimentálního proteinurického onemocnění ledvin není způsobena narušenou erytropoézou

Oba modely anemických myší vykazovaly významné zvýšení procenta cirkulujících retikulocytů (obrázek 2a a doplňkový obrázek S3C). Koncentrace EPO v plazmě byly dramaticky zvýšeny v den 10 u 129S1/SvImJ u myší DIN a zdravých C57BL/6, ale byly opět normalizovány ve dnech 20 a 30 (obrázek 2b). U myší s deficitem podocinu se plazmatické koncentrace EPO zvýšily v den 10 a zůstaly zvýšené ve dnech 20 a 30 (doplňkový obrázek S2H). V histologických analýzách z kostní dřeně a sleziny byl počet erytroidních prekurzorových buněk ve srovnání s myeloidními prekurzory zvýšen 30. den (obrázek 2d–g), což ukazuje na stimulovanou erytropoézu u anemických myší 129S1/SvImJ s DIN.

Snížená životnost červených krvinek je primární příčinou anémie u experimentálního proteinurického onemocnění ledvin

Externalizace PS na zevním listu plazmatické membrány červených krvinek je indikátorem buněčné smrti a promotorem erytrofagocytózy.14 Smrt buněk červených krvinek byla kvantifikována pomocí fluorescenčně aktivovaných analýz třídění buněk fluorescenčního annexinu vázaného na povrch PS.¹⁴ In freshly drawn blood, the percentage of PS-exposing cells was >{{0}}krát vyšší 2. den0 u myší s DIN (4,16 procenta T 0.86 procent) ve srovnání se zdravými myšmi (1.{{7} }} procent 0.11 procent ) (obrázek 3a). Podobně myši Nphs2Dipod vykazovaly přibližně 2-násobné zvýšení expozice PS (1,27 procenta T 0,20 procenta) ve srovnání se zdravými myšmi (0,58 procenta 0,05 procenta) v den 30 (doplňkový obrázek S3A). Je známo, že erytrocyty jsou eliminovány z oběhu makrofágy sídlícími ve slezině.¹⁷ Toto pozorování může proto vysvětlit vyšší poměr slezina / tělesná hmotnost myší Nphs2Dipod (doplňkový obrázek S2G), kde je degradováno dvakrát tolik červených krvinek ve srovnání se zdravými myšmi C57BL / 6.

Protože proteinurie nefrotického rozsahu vede k dysproteinémii,²⁹ dále jsme zkoumali, zda zvýšená smrt buněk RBC může být stimulována složkou v plazmě myší s DIN. Jak je znázorněno na obrázku 3b, expozice PS ve dnech 10 a 20 byla dvakrát vyšší po inkubaci (30 minut při 37 °C) zdravých červených krvinek v plazmě myší 129S1/SvImJ s injekcí doxorubicinu ve srovnání s inkubací v plazmě zdravých myší. Příliv Ca2+ do červených krvinek, zprostředkovaný napěťově řízenými a napěťově nezávislými neselektivními kationtovými kanály,30,31 je jedním z klíčových regulátorů smrti červených krvinek. V červených krvinkách odebraných ve dnech 20 a 30 od myší 129S1/SvImJ s DIN byly intracelulární koncentrace Ca2+ zvýšeny (obrázek 3c); tento

tento jev byl rekapitulován u myší Nphs2Dipod v den 20 (doplňkový obrázek S3B).

V obou myších modelech byla signifikantně negativní korelace procenta PS-pozitivních RBC se závažností anémie odráženou hladinami hemoglobinu (obrázek 3d a doplňkový obrázek S3D). Kromě toho existovala významná korelace s poškozením ledvin, které se odráží od koncentrace močoviny v plazmě (obrázek 3e a doplňkový obrázek S3E) a v menší míře s proteinurií (obrázek 3f a doplňkový obrázek S3F). Aby se kompenzovala ztráta RBC při anémii, byla u obou myší stimulována tvorba nových RBC, jak je indikováno zvýšeným procentem cirkulujících retikulocytů, a významně korelovala s velikostí RBC vystavujících PS (obrázek 3g a doplňkový obrázek S3G).

^{KlikněteTADYpro část 2.}