Část 1: Identifikace dopaminergních neuronů, které mohou jak vytvořit asociativní paměť, tak akutně ukončit její behaviorální projev
Mar 19, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Michael Schleyer, 1* Alice Weiglein, 1 Juliane Thoener, 1 Martin Strauch, 2 Volker Hartenstein, 3
Melisa Kantar Weigelt,1 Sarah Schuller,1 Timo Saumweber,1 Katharina Eichler,4,5,6 Astrid Rohwedder,4,7 Dorit Merhof,2 Marta Zlatic,5,7 Andreas S. Thum,4,8 a Bertram Gerber1,9 ,10*
1Leibnizův ústav pro neurobiologii, oddělení genetiky učení aPaměť, 39118 Magdeburg, Německo, 2Institute of Imaging & Computer Vision, RWTH Aachen University, 52056 Aachen, Německo, 3Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, California 90095-1606, 4University of Konstanz, Institute pro biologii, 78464 Konstanz, Německo, 5HHMI Janelia Research Campus, Ashburn, Virginia 20147, 6Institut neurobiology, University of Puerto Rico Medical Science Campus, Old San Juan, Puerto Rico 00901, 7Department of Zoology, University of Cambridge, Cambridge, CB{ {12}}EJ, Spojené království, 8University Leipzig, Institute for Biology, 04103 Leipzig, Německo, 9Centre for Behavioral Brain Sciences, 39108 Magdeburg, Německo, a 10Institute for Biology, Otto von Guericke University Magdeburg, 39106 Magdeburg, Německo
Adaptivní přechod od zkoumání prostředí při hledání životně důležitých zdrojů k využívání těchto zdrojů, jakmile bylo hledání úspěšné, je důležitý pro všechna zvířata. Zde studujeme neuronální obvody, které umožňují larvě Drosophila melanogaster obou pohlaví vyjednat tento přechod mezi průzkumem a využíváním. Činíme tak kombinací Pavlovova podmiňování se sledováním chování s vysokým rozlišením, optogenetickou manipulací individuálně identifikovaných neuronů a analýzami synaptické organizace na základě dat EM. Zjistili jsme, že optogenetická aktivace dopaminergního neuronu DAN-i1 může nastat oběPaměťběhem výcviku a akutně ukončit naučené vyhledávací chování v následném přivolávacím testu. Jeho aktivace však ponechává vrozené chování nedotčené. Konkrétně aktivace DAN-i1 může vytvořit asociativní paměti opačné valence po spárovaném a nepárovém tréninku se zápachem a její aktivace během testu vyvolání může ukončit vyhledávací chování vyplývající z kterékoli z těchto pamětí. Naše výsledky dále naznačují, že ve svém behaviorálním významu se aktivace DAN-i1 podobá, ale nerovná se odměně za cukr. Dendrogramové analýzy všech synaptických spojení mezi DAN-i1 a jeho dvěma hlavními cíli, Kenyonovými buňkami a výstupním neuronem houbového těla MBON-i1 dále naznačují, že signály DAN-i1 během tréninku a během testu vyvolání by mohly být doručeny do Kenyonovy buňky a MBON-i1 v rámci dříve nerozpoznaných, lokálně omezených větvících struktur. To by poskytlo elegantní motiv obvodu k ukončení hledání po jeho úspěšném dokončení.
Klíčová slova: dopamin; průzkum-vykořisťování; tělo houby; optogenetika; zesílení; Vyhledávání
Prohlášení o významu
V boji o přežití musí zvířata při hledání potravy prozkoumat své prostředí. Jakmile je však jídlo nalezeno, je adaptivní upřednostnit jeho zneužívání před pokračováním v hledání, které by nyní bylo stejně zbytečné jako hledání brýlí, které nosíte. Tento kompromis mezi průzkumem a exploatací je důležitý pro zvířata a lidi, stejně jako pro technická vyhledávací zařízení. Zkoumáme, které z pouhých 10000 neuronů larvy ovocné mušky mohou naklonit rovnováhu v tomto kompromisu, a identifikujeme jeden dopaminový neuron nazvaný DAN-i1, který to dokáže. Vzhledem k podobnosti ve funkci dopaminových neuronů napříč živočišným králem
dom, může to odrážet obecný princip, jak je vyhledávání ukončeno, jakmile je úspěšné.
Úvod
Zvíře, které prozkoumává své prostředí, může využít minulé zkušenosti k vedení svého hledání potravy. Když je však potrava nalezena, je adaptivní ukončit hledání a místo toho využít zdroj potravy. Zde studujeme okruhy, které umožňují larvě Drosophila melanogaster vyjednat tento přechod mezi průzkumem a exploatací. Numerická jednoduchost mozku larev v kombinaci s buněčně specifickou expresí transgenu a znalost jeho synaptické konektivity (Pfeiffer et al., 2010; Li et al., 2014; Eichler et al., 2017; Saumweber et al., 2018; Eschbach et al., 2020), umožňuje toto zkoumat na úrovni individuálně identifikovaných neuronů.
Larvy D. melanogaster snadno spojují pachy s odměnou za jídlo (Scherer a kol., 2003; Gerber a Hendel, 2006; Schipanski a kol., 2008; Rohwedder a kol., 2012; Apostolopoulou a kol., 2014; Kudow a kol. , 2017, 2019). Je kritické, že naučené chování založené na těchto asociacích pach-potrava ustane, pokud je během testu vyvolání odměny přítomna (obr. 1A). Naučené chování lze tedy chápat jako hledání, které je adaptivně ukončeno hledaným výsledkem (tj. odměnou) (Schleyer et al., 2011, 2013, 2015a). Vrozené čichové chování není rovněž ovlivněno (obr. 1B), což naznačuje, že takové vrozené chování je organizováno reflexně (Schleyer et al., 2011, 2013, 2015a,b). Přirozené odměny tedy mohou vyvolat dva efekty: během tréninku poskytují signál odměny, který může být spojen s podněty, které následně vedou hledání odměny; a během testu stažení mohou toto naučené hledání akutně ukončit, čímž zabrání tomu, aby se zvířata vzdalovala od zdroje, jakmile je nalezen. Tento přechod tedy odráží změnu strategie získávání odměny, nikoli změnu motivace (tj. nikoli ztrátu zájmu o odměnu).
Bezobratlí i bezobratlí poskytují dopaminergní neurony (DAN) posilující signály pro asociativní učení (Waddell, 2013; Schultz, 2015; Kaun a Rothenfluh, 2017). U D. melanogaster různé sady DAN zprostředkovávají apetitivní a averzivní posílení (larvy: Schroll et al., 2006; Rohwedder et al., 2016; Saumweber et al., 2018; Eschbach et al., 2020; dospělé mouchy: Schwaerzel et al., 2003; Claridge-Chang et al., 2009; Liu et al., 2012) (podobný scénář mohou mít i objevující se bezobratlí: Lammel et al., 2012; Groessl et al., 2018; Menegas et al. al., 2018). Tyto DAN vytvářejí kompartmentovou strukturu a protínají paralelní vlákna Kenyonových buněk (KC), vnitřních neuronů čichového centra nejvyššího řádu hmyzu, nazývaného houbové tělo. Respektujíce stejnou kompartmentální strukturu, výstupní neurony houbového těla (MBON) shromažďují informace napříč KC a posílají je do eferentních obvodů (viz obr. 2A–D) (larvy: Selcho et al., 2009; Pauls et al., 2010 ; Eichler et al., 2017; Saumweber et al., 2018; Eschbach et al., 2020; dospělí: Sejourne et al., 2011; Places et al., 2013; Aso et al., 2014a,b; Oswald a Waddel , 2015; Takemura a kol., 2017). Nedávná rekonstrukce elektronového mikroskopu odhalila, že DAN mají dva hlavní cíle: KC a MBON (viz obr. 2B) (larvy: Eichler et al., 2017; dospělí: Takemura et al., 2017).
U larvy D. melanogaster může aktivace DAN z klastru pPAM vykazovat odměňující účinek během tréninku (Rohwedder et al., 2016). Ze čtyř dnů tohoto shluku mohou dva jednotlivě poskytnout takový odměňující účinek (DAN-h1 a DAN-i1) (Saumweber et al., 2018). Zde jsme se rozhodli zaměřit
Obrázek 1. Cukr může poskytnout odměnu a signály ukončení hledání. Larvy byly vycvičeny tak, že zápach byl prezentován buď v páru, nebo nepárový s cukrem. V následném vybavovacím testu byly testovány na preferenci vůně buď v nepřítomnosti nebo v přítomnosti cukru (náčrt směrem nahoru). Testování v nepřítomnosti cukru odhalilo asociativní čichPaměť, kvantifikováno jako pozitivní PI. Behaviorální projev tohotoPaměťbyla ukončena v přítomnosti cukru. Cukr tedy může poskytnout dva druhy signálu: během tréninku poskytuje signál odměny, který může být spojen s vůní, aby zvířata později vedla při hledání odměny; a během testu odvolání dává cukr jako hledaná odměna signál k ukončení tohoto naučeného hledání. Velikosti vzorků: N=29, N =28. B, Larvy byly testovány na vrozenou preferenci pachu, buď v nepřítomnosti nebo v přítomnosti cukru (náčrt směrem nahoru). Cukr neovlivňoval vrozené čichové chování, což naznačuje jeho reflexní organizaci. Velikosti vzorků: N=20 každý. Různá písmena nad rámečkovými grafy označují párovou významnost (Mann–Whitney U test, p, 0.05, opraveno podle Bonferroni-Holma). *Významnost od nuly (jednovýběrový znaménkový test, p, 0,05, korigováno podle Bonferroni-Holma). ns, není významné. Všechny statistické testy a jejich výsledky jsou uvedeny spolu se zdrojovými daty na obrázku rozšířených dat 1-1. Hodnoty preference vůně, které jsou základem PI skóre tohoto experimentu, viz obrázek 9A.
Obrázek 2. Obvod matice DAN-KC-MBON. Chiasma středního laloku. Informace o pachu se zpracovávají tak, aby vyvolaly vrozený přístup, stejně jako směrem k oblasti kalichu těla houby KCs (fialová; úplně zobrazen je jeden příklad KC na pravé straně). Informace o odměně za chuť jsou rovněž zpracovávány k vedení vrozeného chování, stejně jako prostřednictvím převážně aminergních modulačních neuronů (zobrazeno je DAN-i1, tyrkysová/černá) směrem k jednotlivým oddílům tělních laloků houby (na levé straně jsou označeny oddíly). Každý ze čtyř kompartmentů mediálního laloku (hk) přijímá vstup z jednoho DAN, který také inervuje stejný kompartment v kontralaterální hemisféře. MBON mediálního laloku čerpají z jednotlivých kompartmentů, typicky z obou hemisfér (zobrazený je MBON-i1, purpurová/žlutá), a dodávají svůj výstup v konfiguracích, které se mezi kompartmenty liší, napříč hemisférickým předělem. Společně jsou za to zodpovědní MBONovéPaměťchování při vyhledávání. Data jsou založena na Eichler et al. (2017) a Saumweber et al. (2018). B, Matice DAN-KC-MBON v i-oddělení. DAN-i1 a většina KC vytváří vzájemné chemické synapse a jak DAN-i1, tak KC poskytují výstup do MBON-i1. Pro jednoduchost jsou detailně zobrazeny pouze synapse s levými neurony DAN-i1 a MBON-i1. Stejná konektivita se nachází ve většině, ne-li ve všech, dalších kompartmentech (Eichler et al., 2017; Saumweber et al., 2018). C, DAN-i1 (tyrkysová) přijímá vstup z vnějšku těla houby (tmavě šedá) ipsilaterálně k tělu buňky (oblast označená 1) a poté inervuje i-kompartment v obou hemisférách (označení 2 a 3). MBON-i1 (purpurová) dvakrát protne střední čáru; přijímá vstup v i-kompartmentu obou hemisfér a poskytuje výstup v oblastech sousedících s houbovým tělem obou hemisfér. D, Stejné jako v C, ale v mírně nakloněném pohledu, ukazující rekonstrukce skeletu levých neuronů DAN-i1 a MBON-i1 a jeden příklad KC (černý). Data jsou založena na Eichler et al. (2017). E, Dendrogram levého neuronu DAN-i1. Barevné tečky představují výstupní synapse z DAN-i1. Trojúhelníky představují vstupní synapse k DAN-i1. Barvy představují partnerský neuron příslušné synapse. Všechny ostatní synapse v těle houby jsou označeny jako „Jiné“. Nejsou zobrazeny synapse, které DAN-i1 tvoří s neurony mimo tělo houby, zejména v oblasti 1 (Eschbach et al., 2020). Tečkované čáry označují oblasti, kde neuron protíná střední čáru mozku. F, Stejné jako v E, ale pro levý neuron MBON-i1. Nejsou zobrazeny synapse, které MBON-i1 tvoří s neurony mimo tělo houby. Verze s vysokým rozlišením neuronů DAN-i1 a MBON-i1 obou hemisfér, stejně jako všechny zralé KC, viz obrázky rozšířených dat 2-1, 2-2 a 2-3, v tomto pořadí .
na DAN-i1, protože byl dříve podrobněji analyzován (Saumweber et al., 2018) a protože přináší robustnější odměňovací efekt než DAN-h1 (Saumweber et al., 2018; nepublikovaná data). Nejprve poskytujeme podrobný popis prostorového uspořádání všech synapsí mezi DAN-i1 a oběma jeho hlavními výstupními partnery, MBON-i1 a KC. Poté se ptáme, zda optogenetická aktivace DAN-i1 může zprostředkovat nejen signál odměny během tréninku, ale také signál k akutnímu ukončení naučeného hledat odměnu během testu odvolání.
cistanche kulturistika
Materiály a metody
Experimentální model a detaily předmětu. Po celou dobu byly použity larvy ve stadiu krmení třetího instaru obou pohlaví (D. melanogaster), staré 5 dní po snesení vajíček. Mouchy byly udržovány na standardním médiu, v masové kultuře při 25 stupních, 60 procentech -70 procent relativní vlhkosti a 12/12 h cyklu světlo/tma. Odebrali jsme lžíci živného média z lahvičky s krmivem, náhodně vybrali požadovaný počet larev, krátce je opláchli vodou z vodovodu a zahájili experiment.
Použili jsme transgenní larvy k expresi ChR2-XXL světelně řízeného iontového kanálu v DAN. Za tímto účelem byl efektorový kmen UAS-ChR2-XXL (Dawydow et al., 2014) (laskavě poskytnutý R. Kittelem, University Leipzig) zkřížen s jedním ze dvou řídících kmenů: buď 58E{{6 }}Gal4 (Pfeiffer et al., 2008; Liu et al., 2012; Rohwedder et al., 2016) (Bloomington Stock Center č. 41347) nebo split-Gal4 driver kmen SS00864 (Eichler et al., 2017; Saumweber; et al., 2018) k získání dvojitě heterozygotních potomků. Ovladač řídí, že kmeny ovladačů byly zkříženy na místní kopii w1118 (Bloomington Stock Center #3605, #5905, #6326). Jako efektorové kontroly byl zkřížen kmen nesoucí místa přistání použitá pro Gal4 (attP2) nebo split-Gal4 (attP40/attP2), avšak bez vložené domény Gal4 ("prázdná") (Pfeiffer et al., 2010). UAS- ChR2-XXL. Potvrdili jsme expresní vzorec 58E02 a SS00864 jejich křížením do pJFRC-10xUAS-IVS-mCD8::GFP (Pfeiffer et al., 2010) (Bloomington Stock Center #32185). Protože ChR2-XXL je dostatečně citlivý na to, aby mohl být aktivován denním světlem (nezobrazeno), mouchy byly chovány v lahvičkách neustále zatemněných černým kartonovým obalem. Pro experiment uvedený na obrázku 8E byl UAS-ChR2 (Schroll et al., 2006) zkřížený na 58E02-Gal4.
Experimentální nastavení. Pro behaviorální experimenty byly larvy cvičeny v Petriho miskách o vnitřním průměru 9 cm a testovány v Petriho miskách o vnitřním průměru 9 nebo 15 cm (obě od Sarstedt), jak je uvedeno v legendách obrázků, ve všech případech naplněných 1 procentem agarózy (stupeň elektroforézy Roth). Stejně jako zápach jsme použili n-amylacetát zředěný 1:20 v parafinovém oleji (AM; CAS: 628-63-7; Merck) a v některých případech navíc neředěný 1-oktanol (OCT; CAS: {{ 9}}; Merck).
Experimenty byly prováděny uvnitř 43 43 73cm obklopujícího boxu vybaveného na zakázku vyrobeným světelným stolem s 24 12 LED polem (470nm; Solarox) a 6-mm silnou difuzní deskou z matného plexiskla nahoře, aby bylo zajištěno jednotné modré světlo pro aktivaci ChR2-XXL (120 mW/cm2). Petriho misky byly umístěny přímo na horní část difuzní desky. Petriho misky byly obklopeny polyetylenovým difúzním prstencem; za difúzním prstencem bylo namontováno 30 infračervených LED (850nm; Solarox), které poskytovaly osvětlení, které bylo pro larvy neviditelné, a přesto umožňovalo záznam a sledování jejich chování pro offline analýzu. Za tímto účelem byla nad Petriho misku umístěna kamera (Basler acA204090umNIR; Basler) vybavená infračerveným filtrem. Další podrobnosti týkající se experimentálního uspořádání viz Saumweber et al. (2018).
cistanche kulturistika
Asociativní pachově-cukrové učení. Experimenty s učením se řídily zavedenými protokoly (Michels et al., 2017). Pachové nádoby byly připraveny přidáním 10 ml vonné látky do zakázkově vyrobených teflonových nádobek (vnitřní průměr 5 mm s víčkem perforovaným 7 otvory o průměru 0,5 mm každý). Petriho misky byly zakryty upravenými víčky perforovanými ve středu 15 otvory o průměru 1 mm, každý pro zlepšení provzdušňování.
Pro trénink vůně-cukr bylo 20 larev umístěno doprostřed Petriho misky naplněné agarózou, která obsahovala 2mol/l D-fruktózy (CAS: 57-48-7; Roth) jako odměnu (1) a vybavena dvěma vůněmi nádoby na opačných stranách, obě naplněné AM (AM1). Po 2,5 minutách byly larvy přemístěny na čerstvou Petriho misku s obyčejnou agarózou bez chuti, vybavené dvěma prázdnými nádobami (EM), kde také strávily 2,5 minuty. Byly provedeny tři takové „párové“ tréninkové cykly, v každém případě s použitím čerstvých Petriho misek. V polovině případů začal trénink s Petriho miskami obsahujícími odměnu, jak je uvedeno (AM1/EM), zatímco ve druhé polovině případů bylo pořadí obrácené (EM/AM1). Pro každou kohortu larev trénovaných AM1/EM (nebo EM/AM1) byla druhá kohorta trénována recipročně, to znamená „nespárovanými“ prezentacemi pachu a odměny (AM/EM1, resp. EM1/AM).
Po tréninku byly larvy přeneseny doprostřed testovací Petriho misky a testovány na jejich pachovou preferenci. Důležité je, že k posouzení byl test vyvolání proveden buď na obyčejné Petriho miscePaměťna základě vyhledávacího chování nebo na Petriho misce obsahující odměnu, aby se zjistilo, zda přítomnost odměny ukončilaPaměť-založené vyhledávání. V obou případech byla jedna strana testovací Petriho misky vybavena nádobou AM a druhá strana nádobou EM. Počet larev na každé straně byl stanoven ze snímku kamery 3 minuty po zahájení testu. Z těchto čísel byla preference vůně vypočtena následovně:
Hodnoty PI se tedy mohou pohybovat od 1 do 1, přičemž kladné hodnoty indikují, že larvy preferovaly pach více po párovém tréninku než bez páru. Pozitivní hodnoty PI tedy indikují apetitivní asociativPaměťto se nejlépe vykládá jakoPaměťchování při vyhledávání. Negativní hodnoty PI naopak indikují averzivní asociativníPaměť.
Asociativní učení optogenetickou aktivací DAN. Pro optogenetické experimenty byly trénování a test prováděny analogicky. Všechny Petriho misky však byly naplněny čistou agarózou (tj. nebyly použity žádné obohacující ochucovadla). Místo toho byl pro párový trénink AM spárován s nepřetržitou stimulací modrým světlem, aby se aktivovalo buď 58E02-DAN nebo 864-DAN po dobu 2,5 minuty, poté následovalo 2,5 minuty tmy bez zápachu (AM1/EM). U nepárového tréninku probíhala prezentace pachu a světelná stimulace odděleně (AM/EM1). Pro experiment prezentovaný na obrázku 8E byly vůně a světlo prezentovány po dobu 5 minut; tento experiment jinak sledoval postupy popsané Rohwedderem et al. (2016).
Po třech takových tréninkových cyklech byl proveden test odvolání a byly vypočteny preference pachu a PI, jak je popsáno. Důležité je, že test odvolání byl proveden buď bez aktivace modrého světla, aby se zjistilo, zda DAN zprostředkovávají signál odměny během tréninku, nebo s aktivací modrého světla, aby se zjistilo, zda navíc mohou DAN zprostředkovat signál k ukončení vyhledávání.
Varianty tohoto protokolu jsou uvedeny v legendách obrázků.
Vrozené čichové chování. Zápachové nádoby a Petriho misky byly připraveny tak, jak je popsáno výše. Z lahvičky byly odebrány kohorty 20 larev, krátce promyty vodou z vodovodu a umístěny na Petriho misku s AM nádobou na jedné straně a prázdnou nádobou na druhé straně. Po 3 minutách byla preference přirozeného zápachu stanovena podle rovnice 1. Tento preferenční test byl proveden buď v nepřítomnosti nebo v přítomnosti cukru, nebo v nepřítomnosti nebo v přítomnosti aktivace modrého světla, aby se zjistilo, zda se tyto testovací podmínky mění. vrozené čichové chování.
Analýza modulací chování po tréninku s 864-aktivací DAN. Chování larev bylo sledováno na videu a analyzováno, jak je podrobně popsáno v Paisios et al. (2017). Stručně řečeno, byly analyzovány dva aspekty larvální chemotaxe. Nejprve byla vypočtena modulace kastrátů hlavy (HC za sekundu) (HC/s) následovně:
V tomto měření úhel směru (HA) popisuje orientaci hlavy zvířete vzhledem k pachu, přičemž absolutní úhly směru (abs (HA)) například 0 stupňů nebo 180 stupňů označují, že pach je na přední nebo zadní straně larev. Toto měření tedy dává kladné skóre pro přitažlivost (tj. když HC nasměruje larvy spíše k cíli pachu než pryč od něj), zatímco dává záporné skóre pro averzi.
Imunohistochemie. Mozky larev byly vypreparovány ve fyziologickém roztoku bez Ca{0}}a fixovány v Bouinově roztoku zředěném 1:2 s fyziologickým roztokem bez Ca21- po dobu 7 minut. Po třech promývacích krocích (každých 10 minut) v PBST (0,3 procenta Triton-X 100 v PBS) následovala inkubace s primárními protilátkami přes noc při 4 stupních. Po třech promytích (každých 10 minut) v PBS byla tkáň inkubována se sekundárními protilátkami po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Po třech závěrečných promývacích krocích v PBS (každých 10 minut) byly vzorky upevněny ve Vectashield (Vector Laboratories). Preparáty byly zkoumány pod konfokálním mikroskopem DM 6000 CS (Leica Microsystems).
cistanche kulturistika
Jako protilátky jsme použili buď monoklonální anti-FASII myší protilátku (DSHB, zředěná 1:50 v blokovacím roztoku obsahujícím 4 procenta normálního kozího séra) a anti-GFP králičí protilátku (A11122, Invitrogen, zředěná 1:1{ {28}}00 v blokovacím roztoku obsahujícím 4 procenta normálního kozího séra) jako primární protilátky a Cy3 anti-myší protilátka (715-165-150, Jackson ImmunoResearch Laboratories) a Alexa-488 anti-králičí protilátka (A11034, Invitrogen), obě zředěné 1:200 v PBS, jako sekundární protilátky; nebo jsme jako primární protilátku použili monoklonální anti-ChR2 myší protilátku (ProGen Biotechnik) zředěnou 1:100 v 0,3% PBST, Cy3 anti-myší protilátku (715-165-150, Jackson ImmunoResearch Laboratories), zředěnou 1:300 v 0,3% PBST , jako sekundární protilátka, a Alexa-488 anti-HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories), zředěné 1:300 v 0,3% PBST, pro kontrastní barvení.
