Část 1: Účinek akteosidu jako buněčného chrániče k produkci klonovaného psa

Ji Hye Lee1☯, Ju Lan Chun1☯, Keun Jung Kim1, Eun Young Kim1, Dong-hee Kim1, Bo Myeong Lee1, Kil Woo Han1, Kang-Sun Park1, Kyung-Bon Lee2, Min Kyu Kim1*

1 Division of Animal & Dairy Science, College of Agriculture and Life Science, Chungnam National University, Daejeon, Korejská republika,

2 Katedra pedagogiky biologie, Vysoká škola pedagogická,Chonnam National University, Gwangju, Korejská republika

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

Pls klikněte sem pro část 2

Abstraktní

Přenos jádra somatických buněk (SCNT) je dobře známá laboratorní technika. Princip SCNT spočívá v přeprogramování somatického jádra injekcí somatické buňky do oocytu příjemce, jehož jádro bylo odstraněno. Proto jsou buňky dárce jádra považovány za klíčový faktor v SCNT. Synchronizaci buněčného cyklu buněk dárců jádra ve stádiu G0/G1 lze indukovat kontaktní inhibicí nebo hladověním v séru. V této studii,akteosid, fenylpropanoidní glykosidová sloučenina, byla zkoumána, aby se zjistilo, zda je použitelná pro indukci synchronizace buněčného cyklu, cytoprotekce a zlepšení účinnosti SCNT u psích fetálních fibroblastů. Primárními psími fetálními fibroblasty byly ošetřenyakteosid(10, 30, 50 μM) po různá časová období (24, 48 a 72 hodin). Synchronizace buněčného cyklu ve fázi G0/G1 se významně nelišila s metodou indukce:akteosidléčba, kontaktní inhibice nebo hladovění v séru. Z těchto tří léčeb však sérové ​​hladovění vedlo k významně zvýšené hladině reaktivních forem kyslíku (ROS) (99,5 ± 0,3 procenta) a apoptóze. To také odhalily výsledkyakteosidsnížené procesy ROS a apoptózy včetně nekrózy ve psích fetálních fibroblastech a zlepšené přežití buněk. Psí fetální fibroblasty ošetřenéakteosidbyli úspěšně zatčeni ve fázi G0/G1. Navíc rekonstruovaná embrya s použitím buněk dárců jádra ošetřených akteosidem produkovala zdravého klonovaného psa, ale ne embrya vytvořená pomocí buněk dárců jádra podrobených kontaktní inhibici. Závěrem,akteosidindukovaná synchronizace buněčného cyklu buněk dárců jádra by byla alternativní metodou ke zlepšení účinnosti psího SCNT kvůli jeho cytoprotektivním účinkům.

Akteosid Cistanche může posílit imunitu

Úvod

Technika SCNT se používá k produkci geneticky lepších nebo manipulovaných zvířat pro zemědělské účely a jako biomedicínské zdroje. S rostoucí potřebou zvířecích modelů onemocnění, záchrany zvířat ohrožených vyhynutím, kmenových buněk pro regenerativní medicínu, transplantace orgánů atd. se v poslední době zvyšuje zájem o klonování zvířat pomocí SCNT [1–5]. I když byla produkce klonovaných zvířat úspěšná, účinnost SCNT je stále velmi nízká [6]. Mezi příčiny nízké vývojové kompetence embrya SCNT patří mnoho faktorů, které souvisejí s kvalitou oocytů příjemce, kvalitou buněk dárce jádra a stavem náhradní matky [7–10].

Je známo, že reaktivní formy kyslíku (ROS) a apoptóza se podílejí na ženských reprodukčních procesech včetně vývoje oocytů in vivo a in vitro [11–14]. ROS přerušují vývoj embrya indukcí cytoplazmatické kondenzace, poškození DNA a apoptózy v embryích. Podpůrné studie uvádějí, že snížení ROS zlepšuje kompetenci vývoje embryí SCNT během kultivace in vitro [15–17]. Apoptóza je fyziologický proces, ke kterému dochází spontánně během normálního preimplantačního vývoje embrya za účelem udržení buněčné homeostázy odstraněním poškozených/nefunkčních buněk DNA. ROS způsobuje fragmentaci DNA a zvyšuje apoptotické blastomery, které narušují vývoj embrya. Případ ROS a apoptózy je pozorován častěji po SCNT než po in vitro fertilizaci [18, 19]. Mnoho studií uvádí, že kompetence vývoje embryí SCNT je zachráněna snížením hladin ROS a apoptózy použitím antioxidantů, jako je selen [20], inzulin-transferin-selen [17, 21], melatonin [22] a glutathion [23].

Předchozí studie uváděly, že použití dárcovských buněk zastavených ve fázi G{{0}}/G1 zlepšilo účinnost SCNT [7, 9, 24–28]. Chromatin v dárcovských buňkách ve stadiu G0/G1 byl považován za nejúčinnější pro kompetence vývoje embryí SCNT. K synchronizaci buněčného cyklu dárce se často používá kontaktní inhibice, sérové ​​hladovění a chemické ošetření [7, 25, 29, 30]. Sérové ​​hladovění však snížilo přežití buněk a zvýšilo fragmentaci DNA, což vede k apoptóze [31]. Chemická inhibice je další strategií k zastavení buněčného cyklu ve fázi G0/G1 pomocí inhibitorů, jako je roskovitin [29, 32], dimethylsulfoxid (DMSO) [33] a cykloheximid (CHX) [34]. Účinnost metody použité pro synchronizaci je ovlivněna typy a druhy dárcovských buněk. Pro optimální synchronizaci dárcovských buněk je třeba pečlivě vyhodnotit různé aspekty použitých metod.

Akteosid(také známý jako verbaskosid) [{{0}}(3, 4-dihydroxyfenylethyl)-1-OaL-rhamnopyranosyl-(1/3)-bD-({{13} }O-caffeoyl)-glukopyranosid] se izoluje z fialových květů Syringa vulgaris. Je známo, že rostliny obsahující akteosid mají antimikrobiální a antimykotické účinky [35–37] a zabraňují zánětu. Akteosid skutečně vykazuje různé biologické aktivity in vitro a in vivo, jako je antioxidační aktivita, antiapoptotická aktivita, cytotoxicita proti různým nádorovým buňkám a synchronizace buněčného cyklu ve fázi G0}/G1 jako cyklin-dependentní inhibitor kinázy (CDK) [38]. Například Lee et al.[38] uvedli, že léčba akteosidy může inhibovat proliferaci lidských promyelocytárních HL-60 leukemických buněk indukcí zástavy buněčného cyklu ve fázi G0/G1. Účinek dárcovských buněk ošetřených akteosidy na účinnost psího SCNT však musí být ještě studován.

V této studii účinkyakteosidna synchronizaci buněčného cyklu, ROS aapoptózana psích fetálních fibroblastech. Analýza synchronizace buněčného cyklu, ROS a apoptózy byla provedena pomocí fluorescenčně aktivovaného třídění buněk (FACS). K prokázání účinnosti dárcovských buněk ošetřených akteosidem byla embrya SCNT kultivována a přenesena do recipientního psa a úspěšně produkovala zdravého klonovaného psa.

cistancheumí léčitledvinanemoc zlepšitledvinovéfunkce

Materiály a metody

Etické prohlášení

V této studii bylo použito 44 samic kříženců (ve věku 1–6 let) jako dárkyně oocytů a náhrady pro embryotransfer a samice bígla (ve věku 2 let) byla použita pro vytvoření buněčných linií fetálních fibroblastů. Všechny pokusy na zvířatech byly schváleny Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Chungnam National University (číslo schválení: CNU-00487) a byly provedeny v souladu s „Příručkou pro péči a použití laboratorních zvířat“ publikovanou IACUC z Chungnamské národní univerzity. Psi byli chováni uvnitř v oddělených klecích se systémem řízení teploty a ventilace. Psi byli krmeni komerční stravou jednou denně a poskytovali jim vodu ad libitum. Ve všech pokusech na zvířatech byli psi zpočátku anestetizováni 6 mg/kg ketaminu a xylazinu a udržováni v anestetizovaném stavu 2% isofluranem. Na konci operace byla podána antibiotika (prokain penicilin G, benzathin penicilin G a dihydrostreptomycin sulfát), aby se zabránilo jakékoli infekci. Po operaci byli psi přemístěni do svých vlastních klecí se sladkou vodou, sledováni a pověřeným veterinářem jim byla poskytnuta zvláštní péče, aby mohla být provedena nezbytná léčba, pokud to zvířata potřebovala.

Chemikálie

Všechny chemikálie byly zakoupeny od Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA), pokud není uvedeno jinak. Akteosid byl získán od Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd. v Číně.

Izolace psích fetálních fibroblastů

Psí fetální fibroblasty byly získány z {{0}}denních plodů. Stručně řečeno, samice bígla byla uměle oplodněna spermatem samce bígla. Po 28 dnech byla potvrzena březost u samice bígla a celiohysterektomií bylo získáno 5 plodů. Plody byly třikrát promyty fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, USA). Hlava, vnitřní orgány a končetiny plodů byly odstraněny chirurgickou čepelí a zbývající části těla byly rozemlety v PBS. Kousky plodů byly dvakrát promyty centrifugací při 400x po dobu 5 minut a kultivovány v Dulbeccově modifikovaném Eagleově médiu (DMEM; Gibco) doplněném 1 procentem penicilin-streptomycinu (produkt č. P4458) a 20 procenty fetálního bovinního séra (FBS; Gibco) při 39 stupních ve zvlhčené atmosféře s 5 procenty CO2 a 95 procenty vzduchu. Když buňky dosáhly konfluence po 5–7 dnech, byly ošetřeny 0,25 procenta trypsin-EDTA (Gibco) po dobu 2 minut a sklizeny. Dvě psí fetální fibroblastové buněčné linie byly založeny ze dvou jednotlivých plodů. Buňky byly zmraženy v 10% DMSO v FBS a skladovány v kapalném dusíku při -196 stupni, dokud nebyly použity.

Léčba buněk

Zmrazené psí fibroblasty byly rozmraženy a kultivovány do 80 procenta konfluence. Buňky byly sklizeny a pasážovány 4 až 7 krát pro následující experimenty. Buňky byly nasazeny v koncentraci 106/ml do 60 mm kultivačních misek. Buňky byly kultivovány v (1) DMEM doplněném 10 procenty FBS a 1 procentem penicilin-streptomycinu po dobu pěti dnů (kontaktní inhibice), (2) DMEM doplněném 0,5 procenta FBS a 1 procentem penicilin-streptomycinu po dobu pěti dnů (sérové ​​hladovění) nebo (3) DMEM doplněný 10 procenty FBS a 1 procentem akteosidu obsahujícího penicilin-streptomycin v koncentraci 10 uM, 30 uM nebo 50 uM po dobu 24 hodin, 48 hodin a 72 hodin (léčení akteosidy).

Analýza buněčného cyklu průtokovou cytometrií

Pro analýzu stádií buněčného cyklu byly buňky sklizeny pomocí {{0}},25% trypsin-EDTA a 3krát promyty PBS centrifugací. Po posledním promytí byly supernatanty odstraněny a buňky byly resuspendovány v 0,3 ml PBS. Pro fixaci bylo k buněčné suspenzi po kapkách přidáno {{10}},7 ml studeného absolutního ethanolu, promícháno jemným vortexováním a skladováno přes noc při 4 stupních. Fixované buňky byly odstředěny a dvakrát promyty studeným PBS. Buňky byly resuspendovány v 0,25 ml PBS doplněném 5 ul 10 mg/ml RNázy a inkubovány po dobu 1 hodiny při 37 stupních. Poté bylo přidáno 10 ul 1 mg/ml propidium jodidu (PI). Buněčný cyklus byl analyzován kvantifikací obsahu DNA v buněčných populacích ve fázích G0/G1 (2n), S (mezi 2n a 4n) a G2/M (4n) pomocí průtokového cytometru FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA , USA).

Detekce ROS průtokovou cytometrií

ROS v živých buňkách byla hodnocena pomocí Image-iT™ Live Green Reactive Oxygen Species Detection Kit (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Stručně, buňky byly po odstranění kultivačního média promyty v PBS a byly přidány 2 ml 100 uM pracovního roztoku terc-butylhydroperoxidu (TBHP). Po inkubaci při 37 stupních po dobu 1 hodiny byl pracovní roztok TBHP odstraněn a buňky byly jemně promyty 3krát v teplém Dulbeccově fosfátem pufrovaném solném roztoku (DPBS; Gibco). Buňky byly poté inkubovány v pracovním roztoku 25 μM 5-(a{10}})-karboxy-2,7-dichlordihydro-fluoresceindiacetátu (karboxy-H2DCFDA) při 37 stupních po dobu 30 minut ve tmě . Když je oxidován, karboxy-H2DCFDA emituje zelenou fluorescenci, což usnadňuje stanovení ROS průtokovou cytometrií. Jako pozitivní kontrola byl použit TBHP, který je induktorem produkce ROS. Jádra buněk byla obarvena Hoechst 33342. Po 3x promytí PBS byly buňky sklizeny trypsinizací, suspendovány v PBS a použity pro detekci ROS pomocí průtokového cytometru FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA ). Rychlost tvorby ROS byla vypočtena vydělením počtu ROS pozitivních buněk celkovým počtem buněk a převedením hodnot na procenta.

Analýza apoptózy průtokovou cytometrií

Analýza apoptózy byla provedena pomocí soupravy Vybran1 Apoptosis Assay Kit #2 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Stručně, buňky byly sklizeny trypsinizací a promyty 2krát studeným PBS. Poté bylo k buňkám přidáno 100 μl 1× pufru vázajícího anexin, 5 μl Alexa Fluor 488 annexinu V a 1 μl PI. Po inkubaci po dobu 15 minut při teplotě místnosti bylo přidáno 400 ul 1x pufru vázajícího annexin a buněčná suspenze byla jemně promíchána. Annexin V, což je protein vázající fosfolipidy závislý na Ca2 plus, má vysokou afinitu k fosfatidylserinu (PS). V živých buňkách je PS umístěn na vnitřní cytoplazmatické membráně a translokován na vnější cytoplazmatickou membránu v apoptotických buňkách. Apoptotické buňky se odlišují Annexinem V značeným Alexa Fluor 488 vazbou na PS na vnější membráně. Kromě toho PI, což je barvivo vázající nukleovou kyselinu, barví nekrotické buňky červenou fluorescencí. Proto byly apoptotické buňky se zelenou fluorescencí, nekrotické buňky s červenou fluorescencí a živé buňky s malou nebo žádnou fluorescencí v buňkách analyzovány pomocí průtokového cytometru FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Rychlosti byly vypočteny vydělením počtu buněk živých, nekrotických nebo apoptotických buněk celkovým počtem buněk a převedením vypočtených hodnot na procenta.

Odběr in vivo zralých oocytů

K detekci ovulace u každého psa byla měřena koncentrace sérového progesteronu (P4) pomocí radioimunoassay Kit DSL-3900ACTIVE progesteron Coated-tube Radioimmunoassay Kit (Diagnostic Systems Laboratories, Inc., TX, USA). Jak bylo popsáno dříve [39, 40], den, kdy koncentrace P4 přesáhla 4 ng/ml, byl považován za den ovulace. 72 hodin po ovulaci byly oocyty získány laparotomií za použití aseptických chirurgických postupů. Fimbria vejcovodu se přiblížila přes bursální štěrbinu a zavedla kanylu pomocí ocelové jehly s obrácenou přírubou (18 gauge, 7,5 cm). Intravenózní (IV) katétr 24 gauge (Angiocath™ Plus, Becton Dickison Korea Inc., Soul, Korea) byl vložen do šíje vejcovodu poblíž uterotubálního spojení a médium 199 (Gibco) doplněné 1 procentem penicilin-streptomycinu a 5% FBS bylo zavedeno do vejcovodu přes IV katétr. Oocyty byly okamžitě transportovány do laboratoře. Celkem bylo odebráno 316 oocytů od 31 psů.

Transfer jádra somatických buněk a transfer embrya SCNT byly provedeny, jak bylo popsáno dříve [39]. Stručně řečeno, k odstranění buněk cumulus z in vivo zralých oocytů byly komplexy cumulus-oocyte (COC) opakovaně pipetovány v 0,1% hyaluronidáze. První polární tělísko a chromozomy metafáze II byly odstraněny aspirací. Enukleace byla potvrzena barvením Hoechst 33342 (bisbenzimid). Psí fetální fibroblasty byly ošetřeny 30 μM akteosidem po dobu 48 hodin a poté sklizeny 0,25% trypsinem-EDTA. Jedna buňka, která má hladkou buněčnou membránu, byla přenesena do perivitelinního prostoru každého enukleovaného oocytu. Dvojice byly ekvilibrované infuzní médium, což je 0,26 M mannitolové médium obsahující 0,1 mM HEPES, 0,5 mM MgS04 a 0,05 procenta BSA, a fúzované dvěma pulzy stejnosměrného proudu (69–75 V po dobu 15 μs) z přístroje Electro-Cell Fusion (NEPA gene Co., Chiba, Japonsko). Tyto kuplety byly inkubovány v médiu 199 doplněném 10 procenty FBS po dobu 1 h 30 min. Fúzovaná embrya SCNT byla zkontrolována a chemická aktivace byla indukována jejich inkubací v 10 μM vápenatém ionoforu (produkt č. C7522, Sigma) po dobu 4 minut. Embrya SCNT byla promyta a poté umístěna do modifikovaného syntetického vejcovodného tekutého média (mSOF) [41] obsahujícího 1,9 mM 6-dimethylaminopurinu (6-DMAP) na 3 h 30 min. Upravená embrya byla chirurgicky přenesena do vejcovodů náhradních mláďat synchronizovaných s říjí do 4 hodin po SCNT. Těhotenství bylo potvrzeno ultrasonograficky 26. den (nejdříve) po embryotransferu.

aktivní složkaakteosidvcistanche

In vitro kultivace klonovaných embryí

Po SCNT byla klonovaná embrya kultivována ve 40 μl mikrokapkách modifikovaného syntetického vejcovodného tekutého média (mSOF) (10 klonovaných embryí na mikrokapku) překryté minerálním olejem při 38,5 stupních v 5 procentech CO2 a 95 procentech vzduchu. Vývoj embryí SCNT byl pozorován od 2. do 8. dne.

Mikrosatelitní a mitochondriální analýza DNA klonovaného psa

Celková DNA byla extrahována z buněk dárce jádra a kůže psů dárců oocytů, náhradních psů a klonovaného psa pomocí G-spin™ Genomic DNA Extraction Kit (iNtRON BIOTECHNOLOGY, Seongnam, Korea) podle pokynů výrobce, a poté byl eluován v 10}0 ul TE pufru (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0). Množství DNA bylo měřeno BioSpec-nano spektrofotometrem (Shimadzu Corp., Japonsko).

Pro mikrosatelitní genotypizaci bylo vybráno následujících 7 specifických genů: PEZ1, PEZ3, PEZ8, PEZ12, FH2010, FH2054 a FH2079. PCR byla provedena s počáteční denaturací po dobu 10 minut při 95 stupních, 20 cyklů složených z denaturace po dobu 30 sekund při 95 stupních, 30 sekund žíhání při 58 stupních (-0,1 stupně/cyklus), 1 min prodloužení při 72 stupňů a 15 dalších cyklů zahrnujících denaturaci po dobu 30 sekund při 95 stupních, 30 sekund žíhání při 56 stupních, 1 minutu prodloužení při 72 stupních a konečné prodloužení při 72 stupních po dobu 10 minut.

Pro sekvenování mitochondriální DNA byly s použitím kompletních nukleotidových sekvencí psí mtDNA (přírůstkové číslo GenBank: U96639) syntetizovány následující oligonukleotidové primery: Cytochrom b oblast (L14,252 –L14,631) F: ACTCATTCATTGACCTCCCAGCG,R: AGATAGGAGTT; Cytochrom c oxidasová podjednotka II (L7,054—L7,465) F: ATGGCGTACCCATTTCAACT,R: GGATGGTTATTTCTATTGG; 16S rRNA (L2,033 –L2,472) F: GCAAAGGTAGCATAATCAT,R: AGGACTTTAATCGTTGAAC; Oblast D-smyčky (L15,622 – L16,030) F: CATAGGACATATTAACTCAATC,R: AAGTCCAGCTACAAGTTATTTG [42]. Cykly PCR pro tuto analýzu zahrnovaly: 95 stupňů počáteční denaturace po dobu 5 minut, 5 cyklů denaturace po dobu 30 sekund při 95 stupních, 40 sekund žíhání při 60 stupních (-1 stupeň/cyklus), 1 min prodloužení při 72 stupňů a dalších 30 cyklů denaturace po dobu 30 sekund při 95 stupních, 40 sekund žíhání při 55 stupních, 1 minuta extenze při 72 stupních a finální extenze při 72 stupních po dobu 10 minut. Fragmenty PCR z různých experimentů byly analyzovány pomocí ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Inc., USA). Sestavení sekvencí, vícenásobné zarovnání a oříznutí zarovnání pro kontrolní oblasti byly provedeny pomocí softwaru BioEdit (v.7.0.5.3).

akteosidvcistanchemůže posílit imunitní systém