Část 1: Fenylethanoidní glykosidy Cistanche Tubulosa indukují apoptózu buněk hepatocelulárního karcinomu a zvyšují protinádorový účinek
Mar 25, 2022
Kontakt: ali.ma@wecistanche.com
Pengfei Yuan, BSc1, Changshuang Fu, MSc1, Yi Yang, PhD1, Aipire Adila, PhD1, Fangfang Zhou, MSc1, Xianxian Wei, MSc1, Weilan Wang, PhD1, Jie Lv, PhD1, Yijie Li, PhD1, Lijie Xia, PhD1, PhD1 a Jinyao Li, PhD1
Abstraktní
Cistanche tubulosa je druh čínské bylinné medicíny a vykonává různé biologické funkce. Předchozí studie to prokázalyFenylethanoidové glykosidy Cistanche tubulosa(CTPG) vykazují protinádorové účinky na různé nádorové buňky. Protinádorové účinky CTPG na buňky HepG2 a BEL-7404 hepatocelulárního karcinomu (HCC) jsou však stále v nedohlednu. Naše studie ukázala, že CTPG významně inhiboval růst HepG2 a BEL-7404 buněk prostřednictvím indukce zástavy buněčného cyklu a apoptózy, která byla spojena s aktivací MAPK drah charakterizovaných up-regulovanou fosforylací p38, JNK, a ERK1/2 a mitochondriálně-dependentní dráha charakterizovaná redukcí mitochondriálního membránového potenciálu. Uvolňování cytochromu c a štěpení kaspázy-3, -7, -9 a PARP byly následně zvýšeny léčbou CTPG. Navíc CTPG významně potlačila migraci HepG2 snížením hladin matrix metaloproteinázy-2 a vaskulárních endoteliálních růstových faktorů. Je zajímavé, že CTPG nejen zesílil proliferaci splenocytů, ale také snížil apoptózu splenocytů indukovanou cisplatinou. V myším modelu tumoru H22 CTPG v kombinaci s cisplatinou dále inhiboval růst buněk H22 a snižoval vedlejší účinky cisplatiny. Celkově vzato, CTPG inhiboval růst HCC prostřednictvím přímého protinádorového účinku a nepřímého účinku na posílení imunity a zlepšil protinádorovou účinnost cisplatiny.
Klíčová slovaCistanche tubulosa fenylethanoidové glykosidy, apoptóza, MAPK dráha, mitochondriálně závislá dráha, cisplatina, imunoenhancement
Cistanche má protinádorový účinek.
Klikněte na produkty Cistanche a Cistanches
Úvod
Předpokládalo se, že rakovina jater bude v roce 2018 šestou nejčastěji diagnostikovanou rakovinou a čtvrtou nejčastější příčinou úmrtí na rakovinu na celém světě, s přibližně 841 000 novými případy a 782 000 úmrtími ročně v jihovýchodní Asii (Mongolsko, Kambodža a Vietnam). .1 V Číně byla rakovina jater v roce 2015 třetí nejčastější příčinou úmrtí souvisejících s rakovinou.2 Více než 90 procent primárních rakovin jater tvoří hepatocelulární karcinom (HCC) na celém světě. V současnosti jsou hlavními metodami léčby HCC hepatektomie, transplantace jater a perkutánní ablace. Bohužel, tato léčba je účinná u 30 procent pacientů s diagnostikovanou ranou rakovinou jater, zatímco pacienti s diagnostikovanou pokročilou rakovinou jater (což představuje 40 procent) se musí spoléhat na paliativní léčbu, aby prodloužili dobu jejich přežití.3,4 Sorafenib v kombinaci s jaterním arteriální chemoembolismus je důležitou a běžnou paliativní terapií pro většinu pacientů s pokročilým HCC v asijsko-pacifické oblasti.5 Sorafenib, schválený FDA v roce 2006 pro léčbu pokročilého karcinomu jater, je mnohočetný inhibitor kináz, který inhibuje proliferaci nádorových buněk a vaskulární produkci a podporuje apoptózu nádorových buněk. Sorafenib významně prodlužuje dobu přežití pacienta o 3 až 5 měsíců, ale má závažné vedlejší účinky a úzce souvisí s výskytem lékové rezistence.6 Proto je naléhavé vyvinout nová léčiva nebo strategie pro HCC.
Tradiční čínská medicína (TCM) samotná nebo v kombinaci s jinými strategiemi byla použita k léčbě HCC a prokázala klinické přínosy včetně prodloužené doby přežití, zlepšení kvality života, snížení nežádoucích reakcí atd.7,8Cistancheje TCM obsahující fenylethanoidové glykosidy (PhGs), iridoidy, lignin a polysacharidy, který má různé biologické funkce, jako je antioxidační, protizánětlivý, anti-agingový, paměťové a imunitní posilovací funkce.9 PhG byly považovány za hlavní aktivní složky Cistanche a mají řadu funkcí včetně antioxidační, protizánětlivé, antiapoptózy, hepatoprotekce a neuroprotekce.10-12 Naše skupina uvedla, žeCistanchetubulosa fenylethanoidové glykosidy(CTPG) by mohla inhibovat růst buněk melanomu B16-F10, buněk Eca{2}} karcinomu jícnu a buněk HCC H22 prostřednictvím vnějších nebo vnitřních signálních drah in vitro nebo in vivo; CTPG měl navíc imunostimulační účinek.13-15
V této studii jsme zkoumali protinádorový účinek a mechanismus CTPG na HepG2 a BEL-7404 buňky in vitro, analyzovali imunomodulační funkci CTPG in vitro a in vivo a dále hodnotili terapeutický účinek CTPG v kombinaci s chemoterapií léčivo cisplatina na myších s nádorem HCC H22 in vivo. Zjistili jsme, že CTPG může inhibovat růst buněk HepG2 a BEL-7404 prostřednictvím apoptózy závislé na mitochondriích a signální dráhy MAPK. CTPG významně inhiboval migraci buněk HepG2 snížením hladin matrix metaloproteinázy-2 (MMP-2) a vaskulárního endoteliálního růstového faktoru (VEGF). Kromě toho CTPG podpořil proliferaci a aktivaci imunitních buněk a zvýšil imunitu myší. Důležité je, že CTPG v kombinaci s cisplatinou může dále inhibovat růst buněk H22 in vivo a snížit vedlejší účinky cisplatiny.
Cistanche posiluje imunitu.
Materiály a metody
Zvířata
Asi 6 až 8 týdnů staří samci myší BALB/c, Kunming a samice myší C57BL/6 byli zakoupeni od Animal Laboratory Center, Xinjiang Medical University (Urumqi, Xinjiang, Čína) a umístěni ve zvířecím zařízení univerzity Xinjiang s pokojovou teplotou. (RT) 25±3 stupňů a 12/12 hodin světlo-tma.
Buněčné linie a buněčné kultury
Myší buňky H22 byly zakoupeny od společnosti Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Čína) a lidské buňky HCC HepG2 a BEL-7404 byly získány z Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering, Univerzita Xinjiang (Urumqi, Xinjiang, Čína) a kultivovaná v médiu RPMI 1640 (Gibco, USA) nebo Dulbeccově modifikovaném Eagleově médiu (DMEM) (Gibco) obsahujícím 10 procent tepelně inaktivovaného fetálního hovězího séra (MRC, Čína), 1 procento L- glutaminu (100 mM), 100 U/ml penicilinu a 100 ug/ml streptomycinu při 37 stupních ve zvlhčené atmosféře 5 procent CO2.
Vysoce výkonná kapalinová chromatografie (HPLC)
Hlavní sloučeniny CTPG (Upbio Tech Co., Ltd., Shanghai, Čína) byly kvalifikovány a kvantifikovány pomocí HPLC, jak bylo uvedeno dříve.13 Byla použita kolona ZORBAX SB-C18 (250×4,6 mm; 5μm). a mobilní fáze sestávala z 0,2 % roztoku kyseliny mravenčí a methanolu s gradientem od 23 % do 31 % . Celkem bylo nastříknuto 10 μl vzorku a detekováno při 330 nm. K analýze složek CTPG byly použity echinakosidové a akteosidové standardy (Yuanye, Shanghai, Čína).
echinakosid
Analýza buněčné životaschopnosti
Protinádorové účinky CTPG na buňky HepG2 a BEL-7404 byly hodnoceny pomocí MTT (3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, {{7 }}difenyl-2-H-tetrazolium bromid). Buňky HepG2 a BEL-7404 byly umístěny do 96-jamkových destiček (5 × 104 buňky/jamka) a ošetřeny 0, 200, 400 a 600 ug/ml CTPG po dobu 24 a 48 hodin, v daném pořadí, po 24 hodinách inkubace při 37 stupních. Asi 35 ug/ml cisplatiny (Yuanye) bylo použito jako pozitivní kontrola. Poté bylo do každé jamky přidáno 100 ul MTT (0,5 mg/ml, zředěno médiem bez média FBS) a kultivováno po dobu 3 hodin při 37 stupních a 5 procentech CO2. Po inkubaci byly destičky odstřeďovány při 1200 otáčkách za minutu po dobu 7 minut, médium bylo odstraněno a do každé jamky bylo přidáno 200 ug/ml DMSO, aby se rozpustily vytvořené krystaly formazanu. Hodnoty OD490 byly měřeny 96-jamkovou čtečkou mikrodestiček (Bio-Rad Laboratories, CA, USA). K vyhodnocení účinků CTPG na splenocyty byly buňky izolovány z myší C57BL/6 a umístěny do 96-jamkových destiček v hustotě 1 x 105 buněk/jamku. Splenocyty byly ošetřeny 0, 200, 400 a 600 ug/ml po dobu 24, 48 a 72 hodin, v daném pořadí. Životaschopnost buněk byla vypočtena podle následujícího vzorce: Životaschopnost buněk (procenta)=(OD-ošetřené/OD-neošetřené) × 100 procent.
Detekce Ki-67
Detekce Ki{{0}} byla provedena podle naší předchozí studie.16 Stručně řečeno, BEL{2}} buňky byly ošetřeny různými koncentracemi (0, 200, 400 a 600 ug/ml) CTPG nebo cisplatina (35 ug/ml). Po 24 hodinách byly buňky sklizeny a promyty PBS, poté fixovány a permeabilizovány pomocí Foxp3 Stained Buffer Set (eBioscience, USA) podle pokynů výrobce. Intracelulární barvení bylo provedeno pomocí FITC konjugované Ki-67 protilátky (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) po dobu 15 minut při teplotě místnosti. Vzorky byly analyzovány průtokovou cytometrií (BD FACSCalibur, CA, USA).
Analýza buněčné apoptózy a buněčného cyklu
Buňky HepG2 a BEL-7404 byly nasazeny v hustotě 2,5x105 buněk/misku a inkubovány při 37 stupních přes noc. Buňky byly trypsinizovány a sklizeny centrifugací po ošetření různými koncentracemi CTPG nebo předem ošetřeny inhibitorem kaspázy (Z-VAD-FMK) nebo inhibitorem kaspázy -3 (Ac-DEVD-CHO) (Beyotime, Čína) po dobu 2 hodin před CTPG ošetření. Po 24 hodinách byla průtokovou cytometrií detekována apoptóza. Stručně řečeno, odebrané buňky byly promyty studeným PBS (Gibco) a resuspendovány v pufru vázajícím annexin s 2,5 μl Annexin V-FITC a 5 μl PI-PE barvicího roztoku (Solarbio, Peking, Čína) a poté byly buňky inkubovány při teplotě místnosti. ve tmě po dobu 15 minut. Pro analýzu distribuce buněčného cyklu byly buňky sklizeny po ošetření CTPG a fixovány ve studeném 70% ethanolu při 4 stupních po dobu 30 minut. Buňky byly barveny PI (BD Biosciences) ve tmě po dobu 30 minut. Vzorky byly analyzovány průtokovým cytometrem (BD FACSCalibur). Hladiny exprese buněčné apoptózy a proteinů souvisejících s cyklem byly detekovány pomocí Western blotu.
Western Blot
Western blot byl proveden podle naší předchozí studie. 17HCC byly ošetřeny CTPG po dobu 24 hodin. Po dvojnásobném promytí ledově studeným PBS byly všechny adherentní a plovoucí buňky shromážděny a lyžovány v RIPA Lysis Buffer (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) po dobu 20 minut na ledu. Po centrifugaci při 12 000 ot./min 4 stupně po dobu 10 minut byla stanovena koncentrace proteinu pomocí soupravy Bicinchoninic Acid Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, USA) podle pokynů výrobce. Stejná koncentrace proteinů byla separována pomocí 12% SDS-PAGE a přenesena na PVDF membrány. Po promytí pufrem PBST (PBS s 0,05 procenta Tween-20) byly membrány blokovány 5% odtučněným mlékem při 37 stupních po dobu 1 hodiny a poté inkubovány s primárními protilátkami (Cell Signaling Technology, MA, USA) ve správných ředěních přes noc při 4 stupních. Po trojnásobném promytí PBST byla membrána inkubována s odpovídajícími sekundárními protilátkami konjugovanými s HRP (eBioscience) po dobu 2 hodin při 37 stupních. Cílové proteiny byly detekovány pomocí testovací soupravy ECL (Beyotime). Data skenování ve stupních šedi byla získána pomocí Image J.
Analýza potenciálu mitochondriální membrány (Δψm)
Δψm byla stanovena membránově permeabilním barvivem JC-1 (Beyotime). Stručně řečeno, buňky HepG2 a BEL-7404 byly ošetřeny různými koncentracemi CTPG (0, 200, 400 a 600 ug/ml) po dobu 24 hodin. Všechny buňky byly shromážděny a promyty promývacím pufrem JC-1. Buňky byly barveny fluorescenční sondou JC{10}} podle pokynů výrobce po dobu 20 minut při teplotě místnosti. Po dvojnásobném promytí PBS byly všechny vzorky analyzovány průtokovou cytometrií (BD FACSCalibur).
Barvení Hoechst 33342
Barvení Hoechst 33342 bylo provedeno podle naší předchozí studie.16 Morfologické změny jader byly zkoumány pomocí membránově permeabilního DNA-vazebného barviva Hoechst 33342 (Beyotime). Ve stručnosti, buňky byly naočkovány do 6-jamkové destičky v koncentraci 1 x 105 buněk/jamku ve 2 ml média. Když bylo dosaženo 70 až 80 procent konfluence, byly buňky ošetřeny 200, 400 a 600 ug/ml CTPG nebo cisplatiny po dobu 24 hodin. Buňky byly promyty PBS a fixovány 4% ledově chladným paraformaldehydem při 4 stupních po dobu 10 minut. Po promytí PBS byly buňky barveny Hoechst 33342 při 4 stupních po dobu 10 minut. Vzorky byly pozorovány fluorescenčním inverzním mikroskopem (Nikon Eclipse Ti-E, Japonsko).
extrakt z cistanche
Migrační test
Migrace buněk HCC byla detekována pomocí testu hojení ran. Stručně řečeno, buňky HepG2 (2x104/jamka) byly nasazeny na 24-jamkovou destičku. Po dosažení 80 procent konfluence byl střed každé jamky jednou poškrábán špičkou 20μL pipety. Po promytí PBS byly buňky ošetřeny cisplatinou (35 ug/ml) nebo různými koncentracemi (0, 200, 400 a 600 ug/ml) CTPG při 37 stupních. Po 24 hodinách byly snímky každého vzorku pořízeny pod mikroskopem (Nikon Eclipse Ti-E). Průměrné vzdálenosti migrace buněk byly analyzovány pomocí obrázku J. Procento hojení rány bylo vypočteno pomocí rovnice: hojení rány ( procenta )=(1-plocha poškrábání v uvedeném časovém bodě/plocha poškrábání v 0 hodin)×100 procento . Hladiny exprese proteinů MMP-2 a VEGF souvisejících s migrací buněk byly detekovány pomocí Western blotu.
Proliferace a apoptóza splenocytů
Pro analýzu proliferace byly splenocyty izolovány ze 3 myší C57BL/6 a obarveny CFSE (eBioscience). Buňky označené CFSE byly naočkovány do 24-jamkových destiček v hustotě 2 × 106 buněk v 1 ml média na jamku a ošetřeny různými koncentracemi CTPG (200, 400 a 600 ug/ml) nebo kombinovány s 35 ug /ml cisplatiny po dobu 72 hodin. Analýza průtokovou cytometrií byla provedena po barvení pomocí CD3-APC a CD19-PE (BD Biosciences). Pro analýzu apoptózy byly splenocyty naočkovány do 24-jamkových destiček v hustotě 2 × 106 buněk v 1 ml média na jamku a ošetřeny různými koncentracemi CTPG (200, 400 a 600 ug/ml) nebo kombinovány s cisplatiny po dobu 24 hodin. Analýza průtokovou cytometrií byla provedena po obarvení 2,5 μl Annexin V-FITC a 5 μL roztoku PI-PE.
Hodnocení bezpečnosti a imunostimulační aktivity CTPG in vivo
Pro hodnocení in vivo imunostimulačních aktivit CTPG byli samci myší Kunming ve věku 6 až 8 týdnů náhodně rozděleni do 7 skupin (5 myší/skupina). Subkutánní injekce (sc, 200, 400 mg/kg), intraperitoneální injekce (ip, 200, 400 mg/kg) a intragastrické podání (ig, 200, 400 mg/kg) byly aplikovány každé 2 dny, celkem 7krát , zatímco kontrolní skupina nedostala žádnou léčbu. Myši se vážily každý druhý den a stav myší byl sledován každý den. Po ošetření CTPG byly orgány myší odděleny a zváženy. Orgánové indexy byly vypočteny podle vzorce: orgánový index=tělesná hmotnost (mg)/tělesná hmotnost (g). Splenocyty byly shromážděny, spočítány a obarveny anti-CD3-APC, anti-CD19-PE, anti-CD49b FITC nebo anti-CD4-APC, anti-CD{{ 22}}PE, anti-CD8-FITC (BD Biosciences). Vzorky byly detekovány průtokovou cytometrií (BD FACSCalibur).
Protinádorová účinnost CTPG v kombinaci s cisplatinou u myší nesoucích nádor H22 Asi 6 až 8 týdnů starým samcům myší BALB/c byly subkutánně injikovány buňky H22 (1.0 × 106 na myš ve 100 ul PBS). Když objemy nádoru dosáhly přibližně 60 mm3, byly myši s nádorem náhodně rozděleny do 4 skupin (6 myší/skupina) a léčeny cisplatinou (4 mg/kg), CTPG (400 mg/kg), cisplatinou (4 mg/kg) plus CTPG ( 400 mg/kg), nebo bez léčby (kontrolní skupina). Nádorové myši byly intraperitoneálně injikovány CTPG 5., 7., 9., 11. a 13. den, v daném pořadí. Cisplatina byla intravenózně injikována 7. a 11. den. Objem nádoru a tělesná hmotnost byly měřeny každý druhý den. Objem nádoru byl vypočten následovně: Objem nádoru (V)=a × b2/2, ve kterém aab představuje nejdelší a nejkratší průměr nádoru měřený posuvným měřítkem. 20. den byly orgány a nádory izolovány a zváženy. Splenocyty byly shromážděny, spočítány a obarveny anti-CD3-APC a anti-CD19-PE nebo anti-CD4-FITC a anti-CD8-APC nebo anti-CD11b-PE a anti-Gr-1-APC nebo anti-CD4-FITC, anti-CD25-APC a anti-Foxp3-PE (BD Biosciences) . Následně byly frekvence a počty buněk analyzovány průtokovou cytometrií (BD FACSCalibur).
Cistanche zesiluje protinádorový účinek a zlepšuje imunitu.
Pro více informací klikněte na obrázek.
Statistická analýza
Všechna data byla vyjádřena jako průměr ± standardní chyba průměru (SEM). Statistická analýza byla provedena pomocí jedno/dvoucestné analýzy rozptylu (ANOVA) pomocí softwaru Prism5.0. P<.05 was="" considered="" statistically="">
