Část 1: Bioaktivní sloučeniny z Ephedra Fragilis: Optimalizace extrakce, chemická charakterizace, antioxidační a antiglykační aktivity

Pro více informací Kontakttina.xiang@wecistanche.com

Abstraktní: Metodologie povrchu odezvy (RSM) s Box-Behnken designem (BBD) byla použita k optimalizaci extrakce bioaktivních sloučenin z Ephedra fragilis. Výsledky naznačují, že nejlepším řešením pro tuto kombinaci proměnných byla extrakce 61,93 procenta ethanolu při 44,43 stupni po dobu 15,84 hodiny. Surový ethanolový extrakt (CEE) získaný za optimálních extrakčních podmínek byl postupně frakcionován rozpouštědly se zvyšující se polaritou. Obsah celkových fenolických (TP) a celkových flavonoidů (TF), jakož iantioxidanta byly měřeny antiglykační aktivity. Fytochemický otiskový profil frakce s nejvyšší aktivitou byl charakterizován pomocí RP-HPLC. Ethylacetátová frakce (EAF) měla nejvyšší obsah TP a TF a vykazovala nejsilnější antioxidační a antiglykační aktivity. Výsledky Pearsonovy korelační analýzy ukázaly, že obsahy TP a TF vysoce významně korelovaly s antioxidačními a antiglykačními aktivitami. Celkem bylo v EAF E. fragilis identifikováno šest sloučenin, včetně čtyř fenolových kyselin a dvou flavonoidů. Kromě toho analýza molekulárního dokování také ukázala možné spojení mezi identifikovanými bioaktivními sloučeninami a jejich mechanismy účinku. Naše výsledky naznačují nové důkazy o antioxidačních a antiglykačních aktivitách bioaktivních sloučenin E. fragilis, které lze použít při léčbě a prevenci stárnutí a komplikací spojených s glykací.

Klíčová slova: Ephedra fragilis; metodologie povrchu odezvy; Box-Behnken design; bioaktivní sloučeniny; RP-HPLC; antioxidační a antiglykační aktivity

Kliknutím sem se dozvíte více o produktech

1. Úvod

Neustálé vystavování se agresorům z různých zdrojů může vést k nárůstuvolné radikályprodukci v lidském těle, překračující jeho schopnost je regulovat, a postupem času přispívá k rozvoji několika chorob souvisejících s oxidativním stresem, včetně stárnutí a cukrovky[1]. Proto,antioxidantysuplementace může pomoci udržet optimální biologický systém odstraněním nadměrné koncentrace volných radikálů [2]. Bylo prokázáno, že volné radikály se účastní procesu glykace. Glykace, spontánní neenzymatická reakce mezi dostupnými aminoskupinami aminokyselinových zbytků v proteinech a redukujících cukrech, se vyskytuje ve vyšší míře při stárnutí a hyperglykémii, což vede k produkci a akumulaci pokročilých konečných produktů glykace (AGEs) 3]. Kromě toho, že AGE interferují s proteiny a mění jejich funkčnost, mohou také

zapojit se s receptorem pro AGEs (RAGE), 45 kDa multiligandovým buněčným povrchovým receptorem patřícím do superrodiny imunoglobulinů [4], a aktivovat několik downstream intracelulárních signálních drah doprovázených zvýšením produkce volných radikálů, které přispívají k patologickým komplikacím souvisejícím k cukrovce [5].

Je dobře známo, že antioxidanty a molekuly lapače radikálů jsou dobrými ochránci proti těmto procesům [6]. Používání léčivých rostlin při prevenci a vyvažování nemocí spojených s oxidačním stresem je starou lékařskou tradicí. V poslední době mnoho studií prokázalo, že sekundární metabolity, jako jsou taniny, fenolové kyseliny a flavonoidy s duálním antioxidačním a antiglykačním potenciálem, jsou účinnější v léčbě diabetes mellitus [7]. Proto je velmi zajímavé identifikovat nové zdroje fytochemikálií, které účinně vychytávají volné radikály a snižují neenzymatickou glykaci.

Ephedra fragilis je členem rodu Ephedra (čeleď Ephedracea), který obsahuje více než 60 druhů rostoucích v pouštních a semiaridních podmínkách na obou polokoulích na šesti kontinentech [8]. Po více než 5000 let se mnoho druhů rodu Ephedra běžně používá v tradiční čínské medicíně (TCM) k léčbě několika nemocí; několik studií uvádí jejich četné zdravotní přínosy, jako je protizánětlivý [9, antiinvazivní, antiangiogenní, [10], antimikrobiální, antiproliferativní, proapoptotický[11], neuroprotektivní [12], hepatoprotektivní a antimikrobiální. -oxidační vlastnosti [13]. Flavonoidy, alkaloidy, fenolové kyseliny a další sloučeniny v rostlinách Ephedra byly považovány za hlavní fytochemické složky pro tyto farmakologické vlastnosti [14]. Ve farmaceutickém průmyslu je vysoce účinná kapalinová chromatografie s reverzní fází (RP-HPLC) široce používána jako analytická metoda k detekci a identifikaci chemických sloučenin na základě jejich různých hydrofobních vlastností, i když v literatuře je popsáno jen málo studií pro chemickou analýzu Druh Ephedra.

Proces extrakce těchto bioaktivních sloučenin z různých rostlinných zdrojů je prvním důležitým krokem v jejich kvalitativní a kvantitativní analýze [15]. Různé faktory viz. extrakční metoda, typ a koncentrace rozpouštědla, teplota, čas a další mohou významně ovlivnit složení a rychlost extrakce těchto sloučenin [16]. Pro získání vysokého obsahu rostlinných účinných látek je proto nutná optimalizace extrakčních procesů. Metodika povrchu odezvy (RSM), původně vyvinutá v 50. letech 20. století Boxem a Wilsonem, je v současnosti nejběžněji používaným nástrojem k provádění, zlepšování a optimalizaci takových procesů, ve kterých mají nezávislé faktory kombinovaný účinek na požadovanou odezvu. Jedním z nejčastěji vybíraných designů v RSM výzkumníky je Box-Behnken design (BBD), protože potřebuje omezenou zkoušku, a proto představuje alternativu, která se vyhýbá dlouhodobým experimentům a snižuje náklady [17-19].

Dosud nejsou v literatuře dostupné žádné studie týkající se optimalizace extrakce bioaktivních sloučenin E. fragilis. Proto se tato studie zaměřovala na optimalizaci extrakce celkového obsahu fenolů (TP) a flavonoidů (TF) z E. fragilis aplikací BBD. Surový ethanolový extrakt (CEE) získaný za optimálních extrakčních podmínek byl postupně frakcionován rozpouštědly se zvyšující se polaritou a pomocí různých in vitro testů byly zkoumány jejich antioxidační a antiglykační aktivity. Nakonec jsme provedli analýzu in silico, abychom dále porozuměli mechanismům, kterými se bioaktivní sloučeniny v EAE, identifikované vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s reverzní fází (RP-HPLC), vážou na BSA a RAGE jako cílové proteiny.

2. Výsledky a diskuse

2.1. Montáž modelů

RSM with a BBD was applied to investigate the effect of ethanol concentration (%, Xj), temperature(°C, X2), and time (h, X3)on the extraction yield of TP and TF from E. fragilis. The results of 15 trials after the BBD are given in Table 1. Analysis of variance(ANOVA)(Table 2) indicates that the models were significant as evidenced by F and p-values. The coefficient of multiple determinations (R')of the models were 0.9935 and 0.9939 for TP and TF, respectively, suggesting that only 0.65 and 0.61%of the total variations are not explained by the models. A comparable value of adjusted R2 to R2 represents an excellent statistical model. As given in Table 2, the adjusted R2(0.9818 and 0.983 for TP and TF contents, respectively) is close to R2, which means that the insignificant terms were not included in the models. Moreover, predicted R2(0.9012 and 0.9338 for TP and TF contents, respectively) is in reasonable agreement with adjusted R2 and confirms that the models are highly significant. The"fitness" of the models was also confirmed using the lack of fit test The insignificant p-value for lack of fit (p >{{0}}.05) pro dvě odpovědi označuje vhodnost modelů pro přesnou předpověď variace ve výsledcích [20]. Dobrá přesnost je popsána jako poměr signálu k šumu větší než 4, což je považováno za žádoucí [21]. Hodnoty adekvátní přesnosti jsou 29,4772 a 28,729 pro obsah TP a TF, v daném pořadí, což demonstruje adekvátní signál. Současně nižší hodnoty variačního koeficientu (CV procenta) (1,52 a 0,4246 procent pro obsah TP a TF, v tomto pořadí) indikují lepší přesnost a spolehlivost experimentálních hodnot. Pro každý faktor odezvy byl pečlivě zkoumán vliv extrakčních faktorů XI (koncentrace ethanolu), X2 (teplota extrakce) a X3 (doba extrakce) (tabulka 2). Významnost každého koeficientu byla testována pomocí hodnot F a p, přičemž se uvažovalo, že vyšší hodnota F a menší hodnota p vždy vedly k významnější shodě mezi různými nezávislými proměnnými [22]. Souhrnně tyto výsledky ukázaly, že modely byly reprodukovatelné a vhodné pro optimalizaci.

2.2. Vlivy extrakčních proměnných na obsah TP

Jak je uvedeno v tabulce 2, výsledky ANOVA ukázaly významné lineární (X a X2), kvadratické (Xj, X5 a X) a interaktivní (X1X a X2X3) účinky na obsah TP. Mezi nimi je obsah TP hlavně závislý na X, X3 na p<0.001 followed="" by="" x1="" and="" x1x,="" at=""><0.01. the="" following="" second-order="" polynomial="" equation="" could="" be="" used="" to="" express="" the="" relationship="" between="" tp="" content="" and="">

Hodnota nedostatečného přizpůsobení byla nevýznamná (F-hodnota =11,02, p-hodnota=0,0843), což naznačuje, že model je dobře nastaven s dobrou predikcí (R{ {9}}.9935; Úprava R2=0.9818)(tabulka 2).

Interakce mezi koncentrací ethanolu a teplotou extrakce (XjX2) vedou k vysoce významnému (str<0.01)effect on="" tp="" content="" (table2).="" as="" ethanol="" concentration="" (x1)="" and="" extraction="" temperature="" (x)increase="" in="" the="" range="" of="" 40-61.80%="" and="" 25-44.30°c="" respectively,="" the="" tp="" content="" increases="" rapidly.="" however,="" beyond="" 61.80%and="" 44.30°c,="" tp="" content="" decreases="" slightly(figure="" 1a).="" however,="" the="" interaction="" of="" the="" extraction="" temperature="" and="" extraction="" time="" (x2x3)showed="" a="" highly=""><0.001) effect="" on="" tp="" content="" (table="" 2).="" as="" shown="" in="" figure="" 1b,="" tp="" content="" slightly="" improved="" with="" increasing="" extraction="" temperature="" (x2)and="" extraction="" time="" (x3)up="" to="" 44.37℃c="" and="" 15.77="" h,="" respectively,="" but="" diminished="" slowly="">

Tyto účinky by mohly být způsobeny skutečností, že fenolické sloučeniny jsou polární molekuly, které se přirozeně vyskytují s glukosidy, díky čemuž jsou lépe rozpustné ve vodě [23]. Protože extrakce fenolických sloučenin je silně závislá na polaritě rozpouštědla, je při extrakci směs vody a alkoholu účinnější než samotný alkohol [20]. S ohledem na princip „like-dissolves-like“ vede pokles koncentrace ethanolu ke zvýšení polarity rozpouštědla, což napomáhá rozpouštění TP[15]. Nicméně vysoká koncentrace ethanolu může ovlivnit rychlost extrakce tím, že zabrání rozpouštění fenolických sloučenin. Podobně zvýšení extrakční teploty zvýšilo regeneraci cílových fenolických sloučenin změkčením tkání, oslabilo integritu buněčné stěny, zvýšilo přenos hmoty a pronikání rozpouštědla do rostlinné matrice a zvýšilo jak rozpustnost, tak rychlost difúze; příliš vysoké teploty pro delší dobu extrakce však mohou zvýšit pravděpodobnost jejich degradace [23]. Dále bylo zjištěno, že dlouhá doba extrakce potenciálně prodlužuje expozici kyslíku a světlu, což v konečném důsledku zvyšuje riziko tvorby volných radikálů, které mohou být vychytávány fenolickými sloučeninami [23]. Proto prodloužená doba extrakce nebyla užitečná pro maximalizaci výtěžku extrakce [24].

2.3. Vlivy extrakčních proměnných na obsah TF

Jak je zřejmé z tabulky 2, lineární účinky X a X3; kvadratické efekty X a X; a interakční účinek X1X2 a XjXg prokázal významné účinky na obsah TF. Mezi všemi významnými faktory je TF hlavně závislá na X3, X, X, X a X1X2 na p<0.001 followed="" by="" x="" andx1x3="" at=""><0.01. the="" fitted="" second-order="" polynomial="" of="" tf="" content="" is="" as="">

Nevýznamná hodnota nedostatečné shody (F-hodnota=1.13; p-hodnota=0.5024) naznačovala, že navrhovaný model vyhovuje prostorovému vlivu proměnných na odezvu s dobrou předpověď (R2=0.9939; Adj R2= 0.9830) (tabulka 2).

Pro obsah TF byly vytvořeny různé 3D grafy povrchu odezvy a zobrazeny na obrázku 1D-F. Interakční účinek koncentrace ethanolu a extrakční teploty (X1X2) ukázal významný (str<0.001) effect="" on="" tf="" content.="" from="" figure="" 1d,="" tf="" content="" increased="" at="" first="" and="" then="" decreased="" quickly="" with="" the="" rise="" of="" the="" two="" parameters,="" and="" a="" maximum="" tf="" content="" was="" achieved="" when="" ethanol="" concentration="" (xj)="" and="" extraction="" temperature="" (xo)were="" 61.89%="" and="" 44.23°c,="" respectively.="" this="" phenomenon="" is="" similar="" to="" tp,="" which="" might="" also="" be="" attributed="" to="" the="" fact="" that="" a="" rise="" in="" the="" extraction="" temperature,="" the="" solubility,="" extraction="" rate,="" and="" diffusion="" rate="" increase,="" which="" ultimately="" helps="" tf="" to="" dissolve="" insolvent="">

Podobně interakce mezi koncentrací ethanolu a dobou extrakce (XIX3) ukázala podobnou korelaci (obrázek 1F). Výtěžek extrakce TF se postupně zvyšoval se zvyšující se koncentrací ethanolu (Xj) a dobou extrakce (X3). Blízko středu grafu odezvy (61,89 procent a 15,81 h pro X a X3, v tomto pořadí) dosáhl výtěžek TF svého nejvyššího, ale poté pomalu klesal. Tento jev je s největší pravděpodobností způsoben druhým Fickovým zákonem difúze, který odhaluje, že konečné rovnováhy mezi koncentrací roztoku v pevné matrici a rozpouštědlem bude dosaženo po určité době, což vede ke zpomalení výtěžku extrakce cílových sloučenin [26]. .

2.4. Validace optimalizovaných podmínek

Cílem optimalizace bylo stanovit extrakční podmínky, které by současně poskytovaly nejvyšší obsahy TP a TF. K provedení optimalizace byl použit expertní software. BBD navrhlo optimální koncentraci ethanolu, teplotu extrakce a dobu 61,93 procenta, 44,43 stupně a 15,84 h, v tomto pořadí pro extrakci bioaktivních sloučenin E. fragilis. V tomto optimálním bodě byly předpokládané obsahy TP a TF 15,335 mg GAE/g sušiny a 2,972 mg OE/g sušiny (tabulka 3). Validace prediktivní kapacity modelů byla provedena experimentálně za optimálních podmínek získaných z RSM. Experimenty byly provedeny trojmo za získaných podmínek a průměrný obsah TP a TF byl 14,98±0,29GAE/g DW a 2,92±0,09 QE/g dw, v daném pořadí. Experimentální hodnoty zkoumaných odpovědí byly srovnatelné a v souladu s předpokládanými hodnotami, což potvrdilo, že modely byly dostatečné k vyjádření očekávané optimalizace.

2.5. Extrakční výtěžek a fytochemická analýza

Tabulka 4 ukazuje extrakční výtěžek E. fragilis CEE a jeho frakcí. Naše výsledky ukázaly, že výtěžek extrakce v různých frakcích se významně liší od 0,78 do 10,6 procenta (w/wo). Jak ukazuje tabulka 4, CEE(1{{14} },6 procenta) měl nejvyšší procentuální výnos, následovaný WF (2,73 procenta), WBF (2.{16}}4 procenta), DMF (0,64 procenta) a EAF (0,93 procenta), zatímco HF (0,78 procenta ) měl nejnižší procentní výtěžnost.

Obsah TP E. fragilis CEE a jeho frakcí byl stanoven pomocí regresní rovnice kalibrační křivky (y {{0}}.009x-0.{{{{101} 25}}154; R2=0.9973) a vyjádřeno v miligramech ekvivalentů kyseliny gallové (GAE) na gram sušené hmotnosti (tabulka 4). Obecně platí, že nejvyšší obsah TP měl EAF (32,78±0,49 mg GAE/g DW) následovaný postupně WBF, DMF a CEE (25,02±1,01, 19,21±0,22 a 14,98±0,29 mg GAE/g DW), zatímco WF a HF vykazovaly nejnižší obsahy (10,47 ± 0,71 a 8,14 ± 0,17 mg GAE/g DW, v tomto pořadí). Obsah TF v E. fragilis CEE a jeho frakcích byl vyhodnocen kolorimetrickým stanovením chloridu hlinitéhokvercetinas a standard (y=0.0295x+0.0361; R2=0.9986)(Table 4). Similar to the TP content, the same results were observed in the TF content with the highest and lowest content being detected in the EAF(10.50 ± 0.11 mg OE/g of DW)and HF(1.65± 0.13 mg OE/g of DW), respectively. The TF content is arranged as the following sequence: EAF>WBF>DMF> CEE>WF>HF. Je zajímavé, že obsahy TP a TF v EAF byly 2,18 a 3.{3}}krát vyšší než v CEE, což naznačuje, že ethylacetát může být vhodným rozpouštědlem pro koncentraci více dostupných fenolických a flavonoidních sloučenin během frakcionace CEE. Naše údaje týkající se obsahu TP a TF jsou v souladu s údaji Yao et al. [27], kteří uvádějí, že EAF získané z léčivé rostliny Pyrola asarifolia měly nejvyšší hladiny fenolických látek a flavonoidů ve srovnání s ostatními frakcemi (petrolether, n-butanol a voda). Ve své studii Bhardwaj et al. [28] také uvedl podobné výsledky při použití několika rozpouštědel se zvyšující se polaritou (n-hexan, chloroform, ethylacetát a n-butanol) při štěpení léčivé rostliny Codonopsis clematidea. Podle těchto autorů má EAF nejvyšší obsah TP a TF, následovaný n-butanolem, chloroformem a hexanem. Tato významná odchylka ve výtěžcích extrakce, složení a čistotě fenolických sloučenin mezi frakcemi je pravděpodobně způsobena rozdíly v polaritě složek nalezených v rostlinných materiálech, jejich chemické struktuře, stupni jejich polymerace a jejich vzájemné interakci [29 ].

2.6. Antioxidační aktivita in vitro

2.6.1.DPPH"Úklidová činnost

DPPH" je jedním z mála stabilních volných radikálů, které se široce používají ke zkoumání antioxidačního potenciálu rostlinných extraktů [30]. Potenciál vychytávačů extraktu je často spojován s jeho schopností vychytávat stabilní volné radikály, což je způsobeno jeho schopností darovat vodík .

Byla studována schopnost vychytávání CEE/frakcí a také VC při různých dávkách na DPPH* volné radikály. Obrázek 2A ukazuje, že všechny frakce vykazovaly zjevnou aktivitu vychytávání DPPH v závislosti na dávce v rozmezí 0,1 až 1 mg/ml. Při dávce 1 mg/ml 64,32,44,1{{22} },67,24,86,63,80,95,51,37 a 99,62 procent DPPH" radikálů byly zhášeny CEE, HE, DMF, EAF, WBF, WF a VC, v tomto pořadí. Nejnižší IC50 pro vychytávání DPPH“ ze všech frakcí vykázal EAF (0.116±{{30}}.015 mg/ml )postupováno WBF (0,175 ± 0.03 mg/ml), CEE (0,23 ± 0,065 mg/ml) a DMF (0,297 ±0,044 mg/ml). WF a HF vykazovaly srovnatelně vyšší hodnoty IC50 (0,964±0,178 a 1,245±0,105 mg/ml).

Observed differentials in the scavenging activities of the fractions against the DPPH*radical may be assigned to the structural characteristics and the number of phenolic compounds present in each fraction. Similar results were observed in the medicinal plant Liquidambar formosana Hance leaf since the EAF was more effective than the other fractions (dichloromethane, n-butanol, and water fractions)[31]. As a standard molecule, ascorbic acid (VC) displayed the lowest IC50 value (0.039 ±0.009 mg/mL) in comparison to all fractions. The scavenging potential is in decreasing order of VC>EAF> WBF>DMF >CEE>WF>HF.

Hodnota IC50 pro vychytávání radikálů DPPH významně pozitivně korelovala s obsahem obou TP (r=0,963;p<0.01) and="" tf="" content(r=""><0.01)as presented="" in="" table="" 5.="" therefore,="" the="" discovered="" antioxidant="" activity="" suggested="" that="" eaf="" can="" be="" a="" source="" of="" numerous="" natural="" compounds="" with="" antioxidant="" properties="" that="" can="" act="" as="" hydrogen="" donors="" to="" terminate="" the="" process="" of="" oxidation="" by="" converting="" the="" free="" radicals="" to="" their="" stable="">

2.6.2.ABTS· plus Scavenging Activity

Test ABTS scavenging se široce používá jako index pro informování a zkoumání antioxidační kapacity čistých sloučenin i přírodních extraktů [32,33]. Vyblednutí modrozelené barvy chromoforu ABTS* na 734 v přítomnosti rostlinného extraktu může indikovat antioxidační aktivitu.

Jak je znázorněno na obrázku 2B, křivka zachycování CEE/frakcí na ABTS* plus vykazovala se zvyšující se koncentrací vzestupný trend. Při 1 mg/ml byly míry vychytávání CEE, HF, DMF, WBF, EAF, WF a VC 80,31,40,54,88,76, 9{{2{ {22}}}},11, 82,97, 67,36 a 94,90 procent, v tomto pořadí. Mezi všemi frakcemi minimální hodnotu IC0 vykázal EAF(0.11{{30}}±0.014 mg/ ml) dále DMF (0,196±0.023 mg/ml),WBF (0,277±0,031 mg/ml), CEE(0,429 ± 0,039 mg/ml) a WF (0,654 ± 0,043 mg/ml), zatímco HF vykazoval nejvyšší hodnotu ICso (1,314 ± 0,104 mg/ml). Celkově bylo toto zjištění v souladu s nálezem Kaewseejana a Siriamornpuna [29]. Srovnání s inhibiční kapacitou VC (0,025±0,005 mg/ml) ukázalo, že vychytávací aktivita CEE a jejích frakcí byla mírně slabá.

Jak je uvedeno v tabulce 5, vysoce významná korelace vychytávání radikálů ABTS s obsahem TP (r=0.921;p<0.01), and="" a="" significant="" correlation="" with="" tf="" content="" (r=""><0.05), were="" shown.="" this="" finding="" confirms="" the="" results="" obtained="" for="" the="" dpph*scavenging="" assay,="" proving="" the="" capacity="" of="" eaf="" to="" scavenge="" free="">

2.6.3. Činnost pohlcování H2O2

H2O2 je hlavním přispěvatelem oxidačního stresu a snadno difunduje buňkami přes membránu jako molekula posla [34]. Celkově vzato H2O2 sám o sobě není nebezpečný [35], ale může reagovat s Fe2 prostřednictvím Fentonovy reakce a dává vzniknout vysoce reaktivnímu hydroxylovému radikálu (OH*)[36]. Z ROS tedy nejvíce poškozuje biomolekuly. Je proto nutné vyhodnotit schopnost CCE a jeho různých frakcí vychytávat H2O2.

Scavenging activities of CEE/fractions, as well as standard antioxidants, were presented in Figure 2C. Notably, all extracts showed a strong scavenging activity on HO, which increased with the increase of sample doses ranging from 0.1 to 1 mg/mL. Moreover, the H2O2 scavenging potential decreased in the order of EAF> WBF>DMF>CEE>WF>HF a odpovídající vychytávací schopnosti při 1.0 mg/ml byly 84,56, 75,24, 67,17, 56,18, 50,19 a 34,95 procent, v tomto pořadí, což byly mnohem nižší hodnoty než u VC (98,03 procent).

Mezi všemi frakcemi vykazovala EAF nejnižší hodnotu IC50 (ICs0= 0.098±0,013 mg/mL) a byla výrazně vyšší než u VC (0,024±0,006 mg/ml). To může být způsobeno přítomností vysoce fenolických a flavonoidních sloučenin v EAF, o kterých je všeobecně známo, že hrají klíčovou roli jako antioxidanty v biologických systémech. V naší nedávné studii jsme prokázali schopnost EAF z E. fragilis chránit Tetrahymena pyriformis proti H2O2-indukovanému oxidativnímu poškození [37].

Naše analýza dat ukázala, že stejně jako u výsledků DPPH" a ABTS* plus byla zaznamenána silná pozitivní korelace hodnoty ICs0 pro pohlcování H2O2 s obsahem obou TP (r=0,926; p<0.01) and="" tf="" content="" (r=""><0.01)(table 5).="" in="" their="" study,="" sroka="" and="" cisowski="" [38]="" reported="" also="" a="" positive="" correlation="" between="" phenolic="" compounds="" with="" ho2-scavenging="" ability.="" according="" to="" these="" authors,="" the="" ho2-scavenging="" depended="" strongly="" on="" the="" number,="" positions,="" and="" the="" model="" of="" substitution="" of="" oh="" bonded="" to="" the="" aromatic="" ring="" of="" phenolic="">

2.6.4. Snížení výkonu

Redukční síla extraktu působí jako indikátor jeho potenciální antioxidační aktivity [39, A40]. Antioxidační potenciál se odhaduje na základě schopnosti antioxidantů redukovat železo (Fe3) v chloridu železitém na železnaté (Fe2 plus). Obecně jsou redukční vlastnosti přisuzovány přítomnosti reduktonů v rostlinných extraktech, o kterých je známo, že působí rozbitím řetězce volných radikálů darováním atomu vodíku [41].

Obrázek 2D ukazuje křivku dávka-odpověď pro redukční schopnost extraktů E. fragilis. Je známo, že čím vyšší je absorbance při 700 nm, tím větší je redukční schopnost. V současné studii vykazovala CEE a jejích pět frakcí značnou redukční sílu v závislosti na koncentraci.

EAF vykázala maximální antioxidační aktivitu (EC{{0}},136± 0.{{10}}13 mg/mL) ve srovnání s VC(EC{{4 }}.083± 0.005 mg/ml). Těsně následovaly WBF (EC50=0,180 ± 0,028 mg/ml), DMF (EC50=0,319 ± 0,031 mg/ml), CEE (EC50=0,334±0,029 mg/ml) a WF (EC50=0,398±0,064 mg/ml) .HF zaostávala a vykazovala minimální redukční energetickou aktivitu (EC5s0 =0.626±0,068 mg/ml) ve srovnání s ostatními frakcemi. Tato zjištění naznačují, že EAF může obsahovat různé jednotlivé sloučeniny, které mají účinnou a silnou redukci energetické aktivity. Vědci zjistili, že ethylacetátové extrakty mohou sloužit jako silné antioxidanty [42].

Pozitivní korelace byla pozorována mezi redukujícím výkonem a obsahem TP i TF (r=0,975; p<0.01 and="" r="0.987;"><0.01; respectively).these="" correlations="" confirmed="" the="" contribution="" of="" phenolic="" compounds="" in="" the="" reducing="" power="">

2.6.5. Fosfomolybdenový test

TAC CEE a jeho frakcí a také VC byly vyhodnoceny pomocí fosfomolybdenového testu a vyjádřeny jako EC0, což je koncentrace poskytující 0,5 absorbance. Metoda byla založena na redukci Mo(VI) na Mo(V) pomocí extraktů za vzniku komplexu zelený fosfát/Mo (V) při kyselém pH s maximální absorpcí při 695 nm [43].

As shown in Figure 2E, the total antioxidant capacity of CCE/fractions and VC correlated well with increasing concentrations in the range of 0.1 to 1 mg/mL.Of the CEE fractions, the ECs0 values ranged from 0.159±0.019 to 0.604±0.073 mg/mL, with a descending order of EAF>WBF> DMF> CEE >WF>HF(str<0.05), which="" indicates="" that="" eaf="" and="" hf="" had="" the="" highest="" and="" lowest="" antioxidant="" activity,="" respectively.="" this="" activity="" could="" be="" due="" to="" the="" presence="" in="" eaf="" of="" various="" phenolic="" compounds="" that="" might="" possess="" antioxidant="" activity.="" vc,="" which="" is="" the="" positive="" control,="" displayed="" the="" lowest="" ec5o="" value="" (0.095±="" 0.008="" mg/ml)="" in="" comparison="" to="" all="">

Byla pozorována vysoce významná korelace mezi celkovou antioxidační aktivitou a obsahem TP a obsahem TF (r=0,978 pro oba;p<0.01) and="" is="" shown="" as="" presented="" in="">

2.6.6. - Modelový systém karoten-linoleát

V modelu -karoten-kyselina linolová podléhají vysoce nenasycené molekuly -karotenu rychlé změně barvy v důsledku volných radikálů linoleátu generovaných oxidací kyseliny linolové [44]. Suplementace antioxidanty by mohla minimalizovat oxidaci -karotenu neutralizací volných radikálů linoleátu, a tím inhibovat bělení -karotenu [45].

Antioxidant activity of CCE/fractions and BHT, as measured by the β-carotene-linoleate model, are shown in Figure 2F. All tested extracts showed concentration-dependent scavenging activity. The EAF, which contained the highest amount of phenolics and flavonoids contents, showed a significant effect in inhibiting β-carotene bleaching, reaching 74.75%at a concentration of 1mg/mL. WBF, CCE, DMF, HF, and WF inhibited the oxidation of β-carotene by 51.61,58.12,50.09,41.39, and 31.66% respectively, at the same concentration. Overall, decreasing antioxidant activity was depicted as EAF> WBF> CEE>DMF>HF>WF.

EAF zobrazila minimální hodnotu IC50 (IC50=0,127 ± 0.{{10}}42 mg/mL) ve srovnání s BHT (ICs { {5}}.049 ± 0.001 mg/ml). WBF. CCE. DME. MY. a HF vykazovaly poměrně vyšší hodnoty IC0 0,5±0,111 mg/ml, 0,998 ± 0,101 mg/ml, 1,073±0,084 mg/ml, 1,402±0,058 mg/ml a 2,209 ± 0,081 mg/ml, v daném pořadí.

Významná pozitivní korelace byla pozorována mezi vychytáváním oxidace karotenu a obsahem obou TP (r= 0.850;p<0.05) and="" tf="" content="" (r=""><0.05)(table 5).="" this="" result="" suggests="" that="" eaf="" may="" contain="" some="" antioxidants="" that="" can="" inhibit="" the="" formation="" of="" hydroperoxide="" and="" stop="" the="" radical-chain="" reaction="">

The involvement of reactive oxygen species (ROS) in several pathological situations has been growing recently. Bioactive compounds are gaining interest thanks to their potent antioxidant activity, but their complexity imposes the development of many methods to evaluate the antioxidant activity and the effectiveness of these chemical compounds. Thus, in this study, CEE and its fractions have been investigated for their antioxidant potential using six assays: DPPH, ABTS, H>O, RP, TAC a -karoten. Proto jsme ukázali, že silné antioxidační aktivity CEE a jejích frakcí vykazovaly vyšší vychytávací aktivity, a to může být silně způsobeno jejich složením z fenolové kyseliny a flavonoidů, jako je kyselina gallová, rutin a kvercetin.