ČÁST 1 Antioxidační a antikoagulační účinky fenylpropanoidních glykosidů izolovaných z řepíků (Orobanche Caryophyllacea, Phelipanche Arenaria a P. Ramosa)

Bartosz Skalski a, Sylwia Pawelec b, Dariusz Jedrejek b, Agata Rolnik a, Rostyslav Pietukhov a,

Renata Piwowarczyk c, Anna Stochmal b, Beata Olas a,*

Univerzita v Ło´d´z, Katedra obecné biochemie, Fakulta biologie a ochrany životního prostředí, 90-236 Ł´od´z, Polsko

b Ústav biochemie a kvality plodin, Institut pedologie a pěstování rostlin, Státní výzkumný ústav, 24-100 Puławy, Polsko

Centrum pro výzkum a ochranu biodiverzity, Katedra biologie životního prostředí, Institut biologie, Univerzita Jana Kochanowského, 25-406 Kielce, Polsko

Abstraktní

Holoparazitické rostliny čeledi Orobanchaceae, včetněCistanche, Orobanche a Phelipanche spp., jsou známé pro své bohatství fenylpropanoidních glykosidů (PPG). Bylo zjištěno, že mnoho PPG sloučenin má široké spektrum aktivit, jako jsou antimikrobiální, protizánětlivé, antioxidační a paměťové látky. Abychom lépe prozkoumali potenciál bioaktivity evropských řepíků (O. Caryophyllaceae – OC, P. Arenaria – PA, P. ramosa – PR) a deseti jednotlivých izolovaných fenylpropanoidních složek, zkoumali jsme jejich antiradikálové působení, ochranný účinek proti oxidaci v plazmě in vitro systému a vliv na parametry koagulace. Testované extrakty vykazovaly vyplachovací aktivitu 50–70 procent síly Troloxu. Extrakt OC bohatý naakteosidměl o více než 20 procent lepší antiradikálový potenciál než extrakt PR, který jako jediný obsahoval PPG postrádající B-kruhový katecholový zbytek v acylové jednotce. Navíc bylo zjištěno, že pouze osm testovaných PPG prokázalo antioxidační potenciál v lidské plazmě ošetřené H2O2/Fe; nicméně tři testované PPG měly kromě antioxidačních vlastností také antikoagulační potenciál. Zdá se, že struktura PPG, zejména přítomnost acylových a katecholových skupin, souvisí hlavně s jejich antioxidačními vlastnostmi. Antikoagulační potenciál těchto sloučenin také souvisí s jejich chemickou strukturou. Vybrané PPG vykazují potenciál pro léčbu kardiovaskulárních onemocnění spojených s oxidačním stresem.

Pro více informací prosím kontaktujte:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanchetubulosa má mnoho účinků

1. Úvod

Oxidační stres je široce známý pro svůj negativní dopad na zdraví živých organismů, včetně zrychleného stárnutí a některých druhů rakoviny. Výskyt oxidačního stresu je spojen s narušenou rovnováhou mezi oxidačním a antioxidačním mechanismem (včetně enzymatické (kataláza, glutathionperoxidáza) a neenzymatické (glutathion) obrany) v buňkách těla [1]. Nadprodukce reaktivních forem kyslíku (ROS), včetně oxidačních radikálů a látek s uzavřenou skořápkou, je jedním z hlavních mechanismů vzniku oxidačního stresu. Biologický účinek způsobený ROS však do značné míry závisí na koncentraci, době expozice a umístění. Za normálních podmínek (nízká koncentrace) mohou kyslíkové/dusíkové radikály hrát roli sekundárních poslů, ale na vyšší úrovni mohou začít reagovat s biologickými strukturami, jako jsou buněčné membrány [2]. Mezi všemi druhy ROS způsobuje hydroxylový radikál (HO.) jedno z největších poškození biomakromolekul: proteinů, lipidů a DNA. Je známo, že oxidační stres hraje důležitou roli v řadě onemocnění, včetně kardiovaskulárních. Poruchy krevního systému korelovaly a/nebo jim předcházely změny různých parametrů hemostázy a plazmatických biomarkerů [1,3].

Na druhé straně, mnoho přírodních látek, jako jsou polyfenoly a polynenasycené mastné kyseliny, bylo identifikováno jako silné antioxidanty schopné zabránit tvorbě a/nebo snížení reaktivních kyslíkových forem. Sloučeniny s takovými vlastnostmi se nacházejí v mnoha potravinářských produktech a farmaceutických přípravcích rostlinného původu. Strava obohacená o čerstvou zeleninu a ovoce a antioxidační terapie založené na přírodních antioxidantech jsou proto široce doporučovány, protože mohou snížit hladinu oxidačního stresu a zabránit různým patofyziologickým procesům [4,5]. Rostlinné polyfenoly jsou různorodou skupinou sekundárních metabolitů, mezi nimiž zaujímají důležité místo fenolové kyseliny, protože jsou široce distribuovány a vykazují různé biologické účinky, jako jsou antimikrobiální, antioxidační a protizánětlivé. Fenylpropanoidní glykosidy (PPG) jsou esterové deriváty kyseliny hydroxyskořicové a jsou hlavní/jedinou třídou sekundárních metabolitů přítomných v holoparazitických rostlinách Orobanchaceae, včetněCistanche, Orobanche a Phelipanche spp. Několik druhů této čeledi je vážnými škůdci plodin, kterých se chtějí farmáři na polích zbavit (příklad Phelipanche ramosa), jen málo z nich se používá ve farmakologii, zatímco většina z nich má pro člověka malý význam. HerbaCistancheje široce používán v asijské tradiční medicíně při léčbě ledvinové nedostatečnosti a jako prostředek zlepšující imunitu a paměť, proti stárnutí a proti únavě [6]. Fytochemické analýzy různých výzkumných skupin prokázaly, že fenylpropanoidní glykosidy, jako je acetonid, echinakosid a podium side, jsou jednou z hlavních aktivních složek Herba Cistanche [7]. Nedávná studie několika druhů chomáčů nalezených v Polsku od Jedrejek et al. [8] prokázal, že tento rostlinný materiál má podobné kvalitativní složení (převaha PPG), navíc se rovná nebo dokonce převyšujeCistanchespp. z hlediska obsahu účinných látek [8].

Cistanche deserticola má mnoho účinků, klikněte sem a dozvíte se více

Tato studie byla zaměřena na hodnocení antiradikálového a antioxidačního potenciálu a také vlivu na parametry hemostázy tří extraktů z řepky metlice (Orobanche Caryophyllaceae – OC, Phelipanache Arenaria – PA a P. ramosa – PR) bohatých na různé fenyly. -

prostanoidy, stejně jako jejich jednotlivé PPG složky. Antiradikálová kapacita byla měřena pomocí 2,2′-azinobis-3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonové kyseliny/ekvivalent Troloxu (ABTS/TE) a 2,2-difenyl-1-pikrylhybrazilu (DPPH ) testy. Oxidační stres v plazmovém testovacím systému byl indukován pomocí hydroxylového radikálu (H2O2/Fe), poté byla měřena peroxidace lipidů (test s thiobarbiturovou kyselinou-reaktivními látkami (TBARS)) a byla měřena hladina proteinových karbonylových a thiolových skupin. Mezi stanovené parametry hemostázy patřily: aktivovaný parciální tromboplastinový čas (APTT), protrombinový čas (PT) a trombinový čas (TT).

2. Materiály a metody

2.1. Chemikálie

2,2-difenyl-1-pikrylhydrazylový radikál (DPPH), 2,2′-azinobis-3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonová kyselina (ABTS), persíran draselný, {{9 }}hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-karboxylová kyselina (Trolox), dimethylsulfoxid (DMSO), kyselina thiobarbiturová (TBA), kyselina mravenčí (třída LC-MS), a H202 byly zakoupeny od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Methanol (gradient HPLC) a acetonitril (třída LC-MS) byly získány od společnosti Merck (Darmstadt, Německo). deset fenyl-

propanové sloučeniny testované v této práci, včetně 2'-O-acetylakteosidu (97 procent), 2'-O-acetylpoliumosidu (98 procent), 3-O-methylpoliumosidu (96 procent), acetonidu (99 procent), arény uvnitř (97 procent), crenatosid (98 procent), teniposid (99 procent), poliumosid (99 procent), tubulosid A (96 procent) a wiedemanniosid D (96 procent) jsme dříve izolovali z níže uvedeného rostlinného materiálu [ 8]. Čistota sloučenin byla hodnocena pomocí UHPLC-PDA-MS analýzy. Ultračistá voda byla připravena interně pomocí systému pro čištění vody Milli-Q (Millipore Co.). Ostatní činidla byla analytické čistoty a byla poskytnuta domácími komerčními dodavateli.

2.2. Přírodní materiál

Kvetoucí rostliny tří druhů řepky, včetně Orobanche Caryophyllaceae Sm., Phelipanche Arenaria Pomel a P. Ramos (L.) Pomel identifikoval prof. Renata Piwowarczyk (Univerzita Jana Kochanowského, Kielce, Polsko) a shromážděno z přírodního zdroje v Polsku.

Poukazové exempláře (O. Caryophyllaceae – Chomento´wek (50.3349◦N, 20.4000◦E), xerotermní travní porost, parazituje Galium boreale, květen 2014; P. Arenaria – Zwierzyniec a 18. mma Arenaria – Zwierzyniec (50.3622◦E), 01.3622◦ travin. ladem, parazitovat na Artemisia campestris, červen 2014;

P. ramosa – Szewce (50.3553◦N, 22.3038◦E), pole, parazituje Solanum Lycopersicum, září 2014) jsou uloženy v Herbáři Univerzity Jana Kochanowského v Kielcích (KTC). Rostlinný materiál byl před extrakcí lyofilizován a jemně rozemlet.

2.3. Příprava extraktů z řepky

Práškový rostlinný materiál (O. Caryophyllaceae (OC) – 2 g, P. Arenaria (PA) – 3 g a P. ramosa (PR) – 3 g) byl extrahován 80% MeOH při 40 ◦C a 1500 psi (tlak rozpouštědla ) pomocí akcelerovaného ASE 200

extraktor rozpouštědel (Dionex, Sunnyvale, CA, USA). Extrakty byly odpařeny a lyofilizovány (lyofilizátor Gamma 2–16 LSC, Christ, Německo). Účinnost extrakce pro OC, PA a PR byla 55 procent, 37 procent a 43 procent hmotnosti rostlinného materiálu. Vzhledem k vysokému obsahu sacharidů (data neuvedena) byly surové extrakty dále purifikovány extrakcí na pevné fázi (SPE) na mikrokolonce Oasis HLB (500 mg; Waters, Milford, MA, USA). Cukry byly odstraněny 1 procentem MeOH, potom byly sloučeniny, které jsou předmětem zájmu, eluovány 80 procenty MeOH. Po odstranění rozpouštědla byly extrakty OC, PA a PR lyofilizovány (lyofilizátor Gamma 2–16 LSC) a výtěžky čištění SPE byly 53 procent (OC), 67 procent (PA) a 51 procent (PR). .

2.4. Fytochemické vlastnosti extraktů z řepky metlice

Kvalitativní a kvantitativní analýzy extraktů z řepky metlice byly provedeny pomocí systému ACQUITY UPLC (Waters) připojeného k detektoru fotodiodového pole (PDA) a tandemovému kvadrupólovému hmotnostnímu spektrometru (TQD-MS/MS). Lyofilizované extrakty OC, PA a PR byly rozpuštěny v 50 procentech methanolu na koncentraci 0,50 mg/ml a poté

chromatografováno na koloně BEH C18 (100 x 2,1 mm, 1,7 um, Waters). Chromatografické podmínky byly následující: teplota pece – 25 ◦C,

lineární gradient 10→25 procent mobilní fáze B (0,1 procenta kyseliny mravenčí v acetonitrilu) v mobilní fázi A (0,1 procenta kyseliny mravenčí v H2O) za 12 min, průtok – 0,4 ml/min, nástřikový objem – 2 μL, UV rozsah – 190–490 nm (rozlišení 3,6 nm). MS analýza byla provedena v režimu negativních iontů s elektrosprejovou ionizací (ESI), s použitím následujících nastavení: rozsah skenování 100–1200 m/z; kapilární napětí 2,8 kV; napětí kužele 35 V;

teplota zdroje 150 ◦C; desolvatační teplota 450 ◦C; desolvace

průtok plynu 900 l/h a průtok kuželového plynu 100 l/h. Získávání a zpracování dat bylo provedeno pomocí softwaru Waters MassLynx 4.1.

Píky fenylpropanoidního glykosidu (PPG) byly identifikovány porovnáním získaných LC-MS dat s dříve izolovanými sloučeninami [8]. Kvantifikace PPG v extraktech z řepky metlice byla založena na metodě UPLC-UV s detekcí při 330 nm a kalibrací externího standardu pomocíakteosid(Sigma-Aldrich, 99 procent, HPLC) as

skupinový standard. Lineární kalibrační křivka byla připravena v šesti koncentracích v rozmezí 1–200 ug/ml a vykazovala dobrou linearitu (R2

0.999). Kvantitativní výsledky představují střední hodnotu SD ze tří injekcí a byly vyjádřeny v miligramechakteosidekvivalenty (ekv.) na gram extraktu (mgakteosidekv/g).

2.5. Antiradikálová aktivita in vitro

2.5.1. Test vychytávání radikálů ABTS

ABTS antiradikálový test byl proveden za použití metody popsané v Kontek et al. [9], s drobnými úpravami takto: K přípravě činidel bylo použito 20 procent MeOH (7 mM ABTS a 4,9 mM draselného per-

síran); roztoky extraktů OC, PA a PR, ve čtyřech koncentračních úrovních v rozmezí 100–400 ug/ml, a roztoky Trolox, v šesti koncentračních úrovních v rozmezí 10 250 ug/ml, byly připraveny s 50 procent MeOH. Poměr vzorku k pracovnímu roztoku ABTS byl 1:25 (obj./obj.). Absorbance při 734 nm byla měřena po 30 minutách inkubace

ve tmě pomocí UV-vis spektrofotometru (Evolution 260 Bio,

Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA).

Inhibice absorbance (procenta) byla vypočtena následovně: [(Absecon-

trol–Absample)/Abscontrol] ×100.

Byly vypočteny ekvivalenty troloxu (TE) extraktů z řepky metlice

pomocí vzorce TE=mvzorek/mstandard, kde m je sklon rovinky

čárové křivky (inhibice absorbance vs. koncentrace). Hodnota TE

ukázka popisuje jeho normalizovanou aktivitu vůči Troloxu (TEstandard =

1.0). Hodnoty IC50 pro OC, PA a PR extrakty a Trolox byly

dosažené experimentálně, pak byly vypočteny z jejich přímky

křivky (inhibice absorbance vs. koncentrace) a jsou vyjádřeny v

ug/ml.

Test byl proveden v triplikátech a výsledky jsou uvedeny

jako průměr ± standardní odchylky (SD).

2.5.2. Test vychytávání radikálů DPPH

DPPH antiradikálový test byl proveden metodou popsanou Jedrejek et al. [8] a Brand-Williams et al. [10], s následujícími drobnými úpravami: roztoky extraktů OC, PA a PR, ve čtyřech koncentračních úrovních v rozmezí 50▽ 250 ug/mL, a roztoky Trolox, v šesti koncentračních úrovních v rozmezí 10▽ 250 ug/ml, byly připraveny s 50 procenty MeOH. Poměr vzorku k DPPH byl 1:19 (v/v). Absorbance při 517 nm byla měřena po 30 minutách inkubace ve tmě pomocí UV-vis spektrofotometru (Evolution 260 Bio). Inhibice absorbance (procenta) byla vypočtena následovně: [(Absecontroll-Abssample)/Abscontrol] x 100. Hodnoty troloxového ekvivalentu (TE) a IC50 zkušebních vzorků byly vypočteny stejným způsobem jako v testu ABTS (oddíl 2.5.1). Test byl proveden v triplikátech a výsledky jsou uvedeny jako průměr ± SD.

2.6. Zásobní roztoky testovaných rostlinných sloučenin a extraktů pro experimenty s lidskou plazmou

Zásobní roztoky testovaných sloučenin a rostlinných extraktů byly připraveny v 50 procentech DMSO. Konečná koncentrace DMSO v testovaných vzorcích byla nižší než 0,05 procenta a jeho účinky byly stanoveny ve všech experimentech.

2.7. Izolace lidské plazmy

Lidská krev neboli plazma byla získána od šesti pravidelných dárců (nekuřáků a žen) do krevní banky (Lodž, Polsko) a lékařského centra (Lodž, Polsko). Krev byla odebírána jako roztok CPD (citrát/fosfát/dextróza; 9:1; objem/objem krev/CPD) nebo roztok CPDA (citrát/fosfát/dextróza/adenin; 8,5:1; objem/objem; krev/CPDA). Dárci alespoň dva týdny před odběrem neužívali žádné léky ani návykové látky (včetně tabáku, alkoholu a doplňků antioxidantů). Naše analýza vzorků krve byla provedena podle pokynů Helsinské deklarace pro lidský výzkum a schválena Výborem pro etiku výzkumu experimentování na lidech na univerzitě v Lodži. Plazma byla připravena centrifugací čerstvé lidské krve při 4500 x g po dobu 25 minut při teplotě místnosti. Koncentrace proteinu byla vypočtena měřením absorbance testovaných vzorků při 280 nm podle postupu Whitakera a Granuma [11].

2.8. Markery oxidačního stresu v lidské plazmě

2.8.1. Měření peroxidace lipidů

Peroxidace lipidů v plazmě byla kvantifikována měřením koncentrace látek reaktivních s kyselinou thiobarbiturovou (TBARS). Koncentrace TBARS byla vypočtena pomocí molárního extinkčního koeficientu (ε=156,000 M 1 cm 1 ). Metoda je podrobněji popsána jinde [12,13]. 2.8.2. Měření karbonylových skupin Hladina karbonylových skupin byla vypočtena pomocí molárního extinkčního koeficientu (ε=22,000 M 1 cm 1 ) a byla vyjádřena jako nmol karbonylových skupin/mg plazmatického proteinu podle Bartosze [ 13] a Levine a kol. [14]. 2.8.3. Stanovení thiolových skupin Obsah thiolových skupin v plazmatických proteinech byl měřen spektrofotometricky pomocí SPECTROstar Nano Microplate Reader (BMG LABTECH, Německo) pomocí absorbance při 412 nm s 5,5'-dithiol-bis-(2- nitrobenzoovou kyselinou). Metoda je podrobněji popsána na jiném místě [15–17].

2.9. Parametry hemostázy

2.9.1. Měření protrombinového času (PT)

PT byla stanovena koagulometricky za použití optické koagulace

Písmena označují výsledky Tukeyova testu (p < 0.05), hodnoty jsou stejné

písmeno v řadě se výrazně neliší.

2.9.2. Měření trombinového času (TT)

TT byl stanoven koagulometricky za použití optického koagulačního analyzátoru (model K-3002, Kselmed, Grudziadz, Polsko), podle metody popsané v Malinowska et al. [18].

2.9.3. Měření aktivovaného parciálního tromboplastinového času (APTT)

APTT byl stanoven koagulometricky pomocí K-3002 optického koagulačního analyzátoru (Kselmed, Grudziadz, Polsko) podle Mali now ska et al. [18].

2.10. Analýza dat Test Q-Dixon byl proveden za účelem eliminace neurčitých dat.

Data byla testována na normální rozdělení Shapiro-Wilkovým testem a rovnost rozptylu s Leveneovým testem. Statisticky významné rozdíly byly identifikovány pomocí ANOVA, po které následoval Tukeyův test vícenásobného srovnání nebo Kruskal-Wallisův test. Srovnání byla považována za významná při p < 0,05.="" hodnoty="" jsou="" uvedeny="" jako="" průměry="" ±="">