Část 1: Antifibrotický účinek 6-bromo-indirubinu-3 ′-oximu (6-BIO) prostřednictvím regulace aktivačního proteinu-1 (AP-1) a specificita proteinu-1 (SP-1) transkripční faktory v buňkách ledvin

Antifibrotický účinek 6-bromo-indirubinu-3 ′-oximu (6-BIO) prostřednictvím regulace aktivátorového proteinu-1 (AP-1) a specifického proteinu -1 (SP-1) transkripční faktory v buňkách ledvin

Další informace:{0}}

klíčová slova:ledvina, fibróza,SMAD,Antifibrotické

ABSTRAKTNÍ

PAI-1 a CTGF jsou nadměrně exprimovány vledvinanemocía způsobitfibrózaplic, jater aledviny. Použili jsme potkaní model unilaterální ureterální obstrukce (UUO), abychom zjistili, zda6-BIO, inhibitor glykogensyntázy kinázy-3, oslabenýfibrózain vivo inhibicí PAI-1 a CTGF. Navíc TGF-indukované buňkyfibrózabyl pozorován in vitro za použití člověkaledvinaproximální tubulární epiteliální buňky (HK-2) a krysí intersticiální fibroblasty (NRK49F). Vyjádřenífibrózasouvisející proteiny a signální molekuly, jako je PAI-1, CTGF, TGF, SMA,SMADa MAPK byly stanoveny v buňkách HK-2 a NRK49F pomocí imunoblotu. K identifikaci transkripčních faktorů, které regulují expresi PAI-1 a CTGF, byly analyzovány promotorové aktivity AP-1 a SP-1 pomocí luciferázových testů. K pozorování společné lokalizace AP-1 a SP-1 na PAI-1 a CTGF byla použita konfokální mikroskopie. Exprese PAI-1, CTGF, TGF a -SMA se zvýšila v modelu UUO i v buňkách HK-2 a NRK49F ošetřených TGF. Kromě toho léčba UUO a TGF indukovala aktivaci P-SMAD2/3, SMAD4, P-ERK 1/2, P-P38 a P-JNK MAPK signální dráhy. Aktivita promotorů PAI-1, CTGF, AP-1 a SP-1 se v reakci na léčbu TGF zvýšila. Nicméně léčba s6-BIOsnížená exprese proteinů a souvisejících signálních drahfibrózav modelu UUO a také v buňkách HK-2 a NRK49F ošetřených TGF. Kromě toho 6-BIO léčba utlumila expresi PAI-1 a CTGF a také promotorové aktivity AP-1 a SP-1, čímž regulovalaSMADa MAPK signální dráhy a následně vyvíjeníantifibrotickýúčinky naledvinabuňky.

Klikněte na Cistanche herba pro onemocnění ledvin

1. Úvod

ledvinyFibróza je způsobena různými faktory, včetně cukrovky, vysokého krevního tlaku, glomerulonefritidy a chronických onemocnění souvisejících s věkem.ledvinaonemocnění [1–3]. Glomeruli skleróza a tubulointersticiálnífibrózajsou konečnými patologickými rysyledvinaonemocnění [4,5]. Nadměrná produkce a ukládání proteinů extracelulární matrix (ECM) způsobuje strukturální a funkční poškozeníledviny, což má za následek postupnou ztrátu jeho funkce, která vyvrcholí v konečné fáziledvinanemoc [5]. Theledvinymají složitou strukturu, která se dělí na glomeruly, tubulointersticiální a vaskulatury; každý kompartment má jiný typ extracelulární matrix a může být ovlivněnfibróza[6,7]. ECM intersticiálních tubulárních buněk obsahuje různé složky včetně kolagenu, glykosaminoglykanu, elastinu, lamininu a glykoproteinů. Aktivované proximální tubulární buňky mohou aktivovat tubulointersticiální [6–10]. Glykogen syntáza kináza (GSK3) podporujeledvinafibrózaaktivací signalizace TGF v proximálních tubulárních a tubulointersticiálních buňkách [11]. V této studii jsme se zaměřili na stanovení účinků inhibitoru GSK3,6-BIOna proximálních tubulárních a intersticiálních fibroblastových buňkách cílením na inhibitor aktivátoru plazminogenu-1 (PAI-1) a růstový faktor pojivové tkáně (CTGF), které hrají klíčovou roli v progresivníchledvinapoškození a tubulointersticiálnífibróza.

6-BIOje buněčně permeabilní derivát analogu indirubinu, 6-bro-indirubinu, který je izolován z mořských měkkýšů a má vysokou specificitu a selektivitu pro GSK-3 [12,13].6-BIOje kompetitivním inhibitorem ATP a vykazuje podobnost s ATP vazebnou doménou cyklin-dependentní proteinkinázy (CDK), která reguluje protinádorovou aktivitu [14–16]. Abnormální aktivita GSK3 je spojena s několika lidskými nemocemi, včetně diabetu, zánětu, neurodegenerativních onemocnění a psychóz [17,18]. V předchozích studiích bylo prokázáno, že inhibitory GSK3 mohou opravit poškozené tubuly a snížit zánětlivé reakce, epiteliálně-mezenchymální přechod (EMT) spojený se signalizací TGF 1 a akumulaci fibronektinu v kultivovaných glomerulárních intermediárních buňkách [11,19–21]. navíc6-BIOmohou mít potenciální terapeutické účinky u několika onemocnění, včetně diabetu, neurodegenerativních poruch a rakoviny regulací zánětu, oxidačního stresu, přežití buněk, jakož i proliferace a buněčné smrti [22–24]. Nicméně potenciální terapeutické účinky6-BIOnaledvinafibrózaspojené s proximálním tubulárním a tubulárním intersticiálním poškozením jsou stále neznámé.

PAI-1, multifunkční glykoprotein vledviny, je inhibitor serinové proteázy, který inhibuje urokinázový aktivátor plazminogenu (uPA) a tkáňový aktivátor plazminogenu (tPA), který štěpí plazminogen na plazmin [25,26]. Nadměrná exprese PAI-1 inhibuje fibrinolýzu a degradaci ECM, čímž zvyšuje akumulaci ECM [27]. Kromě toho PAI-1 upreguluje MAPK (mitogenem aktivované proteinkinázy),SMADa RhoA/ROCK (Rho-asociovaná proteinkináza) signální dráhy u diabetu a chronickéledvinaonemocnění [28–30]. Transkripční faktory, jako je AP-1, SP-1,SMAD3/4, USF2 (upstream transkripční faktor 2) a CTF/NF (rodina místně specifické vazby DNA

proteiny), jsou také aktivovány MAPK aSMADsignalizace [30,31]. Kombinovaná aktivace těchto signálních drah a transkripčních faktorů zvyšuje expresi PAI-1 a vede k akumulaci ECM. CTGF je protein vázající heparin související s ECM a zahrnuje domény, jako je protein vázající růstový faktor podobný insulinu (IGFBP), von Willebrandovy repetice typu C (VWC), repetice trombospondinu typu 1 (TSR) a C-konec doména (CT) s motivem cysteinového uzlu. Z těchto čtyř domén interaguje doména CT se superrodinou TGF, fibronektinem a perlekanem [32–34]. V důsledku toho CTGF zvyšuje MAPK,SMAD, PI3K a YAP signalizace indukcí TGF a tyto signální dráhy aktivují transkripční faktory, jako jsou AP-1, SP-1, NF-kB aSMAD2/3. Upregulace CTGF tedy indukuje migraci, proliferaci a zánět buněk, čímž způsobuje akumulaci ECM [35–37].

Na základě těchto výsledků dřívějších studií jsme spekulovali, že MAPK aSMADsignalizace, stejně jako AP-1 a SP-1 transkripční faktory, možná společné vazby mezi PAI-1 a CTGF-indukovanou akumulací ECM v progresivnímledvinaonemocnění a tubulointersticiálnífibróza. Zkoumali jsme tedy, zda6-BIOmůže zabránit chronické progresiledvinaonemocnění regulací PAI-1 a CTGF.

2. Materiál a metody

2.1. Protilátky a činidla

Primárními použitými protilátkami byly anti-králičí protilátky proti PAI-1 (11907), TGF (3711), fosforylovanéSMAD2/3 (8828), SMAD4 (38454), fosforylovaný ERK (P-ERK) (9101), fosforylovaný P38 (P-P38) (4631), fosforylovaný JNK (P-JNK) (9251), fosforylovaný C-JUN (PC-JUN) (3270) fosforylovaný C-FOS (PC-FOS) (5348) a histon H3 (9715), všechny byly získány od Cell Signaling Technology. CTGF (sc-365970), SP-1 (sc-17824),SMAD6 (sc{1}}) byly získány od Santa Cruz Biotechnology. Myší protilátky proti aktinu (a5316) a (2'Z,3'E)-6-Brom indirubin-3-oxim (6-BIO) (B1686) byly získány od Sigma-Aldrich.

2.2. Pokusy na zvířatech

Všechny pokusy na zvířatech byly provedeny podle příslušných pokynů a předpisů. Experimentální protokol byl schválen výborem Animal Care Regulations (ACR) z Chonnam National University Medical School (CNUH IACUC-18010, 19. dubna 2019). Experimenty byly provedeny na samcích potkanů ​​Sprague-Dawley (180–200 g, Samtako, Korea) [38]. Potkani byli udržováni při kontrolované teplotě (21 ± 2 ◦ C) ve 12hodinovém cyklu světlo-tma. Potkani byli rozděleni do tří skupin: kontrola (n=6), unilaterální ureterální obstrukce (UUO, n=6) a UUO s6-BIOošetření (n=6).6-BIO({{0}},2 mg/kg/den) byl podáván intraperitoneálně (ip) po dobu 6 dnů. K vyvinutí modelu obstrukční nefropatie u potkanů ​​byla operace provedena následovně: UUO byla indukována podvázáním levého močovodu po dobu sedmi dnů. Břišní dutina byla otevřena a 2–0 hedvábná ligatura byla umístěna na levý proximální ureter. Kontrolní skupina dostávala stejnou léčbu po dobu sedmi dnů, s výjimkou ligatury. Krysy měly volný přístup ke standardnímu krmivu pro krysy a vodě z vodovodu a byly usmrceny 7. den po operaci. Theledvinybyly rychle odstraněny a zpracovány pro imunohistochemii a western blotting.

2.3. Histologie

ledvinytkáně byly fixovány 4% paraformaldehydem, zalité v parafinu a nařezány na 5 um silné řezy. Pro posouzení histologické morfologie byly provedeny postupy barvení hematoxylinem a eosinem (H&E), kyselinou jodistou-Schiff (PAS), červení Sirius a Massonovým trichromem (MT). Barvení H&E, PAS, Sirius red bylo provedeno podle pokynů výrobce. Pro barvení MT byly po deparafinizaci xylenem řezy ošetřeny Bouinovým roztokem při 56 °C po dobu 30 minut a promyty pod tekoucí vodou z vodovodu, dokud nebyly řezy čiré. Řezy byly následně obarveny Weigertovým hematoxylinem (A: B=1:1), následovalo barvení roztokem Biebrich Scarlet/Acid Fuchsin po dobu 10 minut a promytí destilovanou vodou. Řezy byly inkubovány s roztokem kyseliny fosfowolframové/kyseliny fosfomolybdenové po dobu 10 minut a ošetřeny roztokem anilinové modři po dobu 15 minut. Řezy byly následně inkubovány s kyselinou octovou po dobu 1 minuty a dehydratovány ethanolem a xylenem. Depozice kolagenu, jádra a svalová vlákna byly zbarveny modře, černě a červeně. Kvantitativní analýza obarveného řezu byla provedena pomocí softwaru ImageJ.

2.4. Western blot analýza

Buňky byly sklizeny, dvakrát promyty ledově studeným fosfátem pufrovaným fyziologickým roztokem (PBS), resuspendovány v lyzačním pufru a krátce sonikovány. Proteinový extrakční pufr sestával z 50 mM Tris-HCl (pH 7,2), 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1 % Nonidet P-40, 0,1 % SDS, koktejl inhibitorů proteázy (GenDEPOT, P3100– 001) a koktejl inhibitorů fosfatázy

(GenDEPOT, P3200–001). Po centrifugaci byly shromážděny supernatanty obsahující proteinové extrakty a koncentrace proteinu byly měřeny pomocí Pierce® BCA Protein Assay Kit (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA). Proteiny byly separovány na 12% dodecylsulfát-polyakrylamidových gelech a přeneseny na nitrocelulózové membrány. Bloty byly blokovány při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny 5 procenty odstředěného mléka v PBS obsahujícím 0,1 procenta Tween-20 (PBST). Blot byl poté inkubován přes noc s primární protilátkou (1;2000) při 4 °C, následovala inkubace se sekundární protilátkou (1:2500) a nakonec s protilátkami konjugovanými s anti-králičí křenovou peroxidázou, jak bylo popsáno dříve [39 ]. Specifické proteinové pásy byly vizualizovány pomocí vylepšeného chemiluminiscenčního systému. Kvantitativní analýza

intenzita pásma byla provedena pomocí softwaru ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

2.5. knockdown siRNA

Pro knock-down SP-1 byly transfekovány SP-1 siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Inc., sc-29487) a kontrolní siRNA (Santa Cruz, sc{4}}) po dobu 24 hodin do buněk HK-2 a NRK49F při 60% konfluenci s použitím transfekčního činidla Dhar-maFECT 1 (Dharmacon, T-2001–02) v konečné koncentraci 30 nM. Buňky byly inkubovány v médiu bez séra po dobu jednoho dne ve 37^◦ C inkubátor pod zvlhčenou 5% atmosférou CO2, předem ošetřený 6-BIO po dobu 1 hodiny a stimulovaný TGF- po dobu 24 hodin. Účinnost knockdownu byla stanovena analýzou western blot.

2.6. Přechodná transfekce plasmidu a reportérového konstruktu

Buňky byly pěstovány do 60–70% konfluence, promyty médiem DMEM-F-12 (HK-2 buňky) nebo DMEM (buňky NRK49F) a poté inkubovány po dobu 24 hodin v příslušných médiích bez séra a antibiotik . Buňky byly poté transfekovány dominantně-negativním konstruktem C-JUN a také reportérem PAI-1, CTGF, AP-1 a SP{11}} nesoucím vektor pGL3 pomocí činidla FuGene HD. Koncentrace reportérového plazmidu použitého při přechodné transfekci byla 2 μg (1 μg/μl). Buňky transfekované reportérem byly předem ošetřeny 6-BIO po dobu 1 hodiny a inkubovány s 10 ng/ml TGF po dobu 16 hodin.

2.7. Test promotorového reportéru

Reportérové ​​konstrukty PAI{0}} a CTGF byly vytvořeny společností BIO FACT (Yuseong-gu, Daejeon, Korejská republika). Reportérové ​​konstrukty pGL3-AP-1 a pGL3-SP-1 laskavě poskytl profesor Young Do Jung (Chonnam National University). Transkripční regulace PAI-1, CTGF, AP-1 a SP-1 byla zkoumána přechodnou transfekcí jejich příslušných konstruktů promotor pGL3-luciferáza reportér. Buňky HK-2 a NRK49F (5 × 10 5) byly nasazeny a pěstovány, dokud nebylo dosaženo 60–70procentní konfluence. Poté byly promotorové konstrukty a pGL3-prázdné vektory transfekovány do buněk pomocí FuGene HD, podle protokolu výrobce. Plazmid pRL-null kódující luciferázu Renilla byl zahrnut do všech vzorků pro monitorování účinnosti transfekce. 24 hodin po transfekci byly hladiny luciferázové aktivity světlušky a Renilla měřeny postupně z jednoho vzorku pomocí testovacího systému Dual-Glo Luciferase (Promega). Aktivita luciferázy světlušek byla normalizována na aktivitu Renilla a relativní množství aktivity luciferázy v neošetřených buňkách.

2.8. Konfokální laserová mikroskopie

Krysaledvinavzorky byly fixovány ve 4% paraformaldehydu, zality v parafínu a nařezány na 3- μm silné řezy.ledvinyřezy byly deparafinizovány a rehydratovány, blokovány, promyty PBS a inkubovány s anti-PAI-1, anti-CTGF, anti-PC-JUN, anti-PC-FOS, anti-SP{10}} a anti-AQP1 protilátky naředěné v blokovacím pufru po dobu 24 hodin při at

4 ^◦C. Po promytí byly řezy inkubovány s Alexa Fluor 488 (zelená fluorescence) kozí anti-králičí (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), Cy3 (červená fluorescence) kozí anti-myší nebo kozí anti-králičí (Invitrogen , Oregon) protilátky po dobu 2 hodin. Buňky HK-2 a NRK49F (3 × 10 5 ) byly nasazeny do {{10}}jamkových komůrek a inkubovány po dobu 24 hodin při 37 ◦ C. Buňky byly předem ošetřeny 5 μM 6-BIO po dobu 1 hodiny a poté vystaveno 10 ng/ml TGF po dobu 16 hodin. Po promytí IX PBS byly buňky fixovány 4 procenty paraformaldehydu při teplotě místnosti po dobu 15 minut a blokovány po dobu 2 hodin při teplotě místnosti pomocí IX PBS obsahujícího 1 procento BSA a 0,2 procenta Triton X-100. Buňky byly poté inkubovány s králičí nebo myší monoklonální protilátkou proti PAI-1, CTGF, PC-JUN, PC-FOS a SP-1 (zředěné 1:200 v blokovacím pufru) při 4 stupních po dobu 24 h. Po promytí byly buňky inkubovány s příslušnými sekundárními protilátkami (Cy3 kozí anti-králičí a anti-myší protilátky, Alexa Fluor 488 kozí anti-králičí a anti-myší protilátky, zředěné 1:200) po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Po promytí byla krycí sklíčka připevněna na mikrosklíčka pomocí ProLong Gold Antifade Reagent s DAPI (Life Technologies Corporation). Obrázky byly analyzovány pod konfokálním laserovým skenovacím mikroskopem Leica TCS SP8 (Leica Microsystems, Mannheim, Německo).

2.9. Statistická analýza

Výsledky byly vyjádřeny jako průměr ± SEM. Vícenásobná srovnání mezi skupinami byla provedena jednosměrnou ANOVA a Tukeyho post hoc testem poctivě signifikantního rozdílu (HSD). Výsledky s p < 0,05="" byly="" považovány="" za="" statisticky="">

3. Výsledky

3.1. 6-BIO zmírňuje morfologické změny a expresi markerů spojených s fibrózou v modelu UUO potkanů

Hodnotili jsme účinky 6-BIO nafibrózavledvinymodelu krysy UUO. Jak je znázorněno na obr. 1A, model UUO vykazoval výrazně zvýšenýledvinatubulointersticiální poškození, glomerulární skleróza, intersticiální infiltrace mononukleárních buněk, ukládání intersticiálního kolagenu afibrózave srovnání s kontrolami, jak bylo stanoveno barvením H&E, PAS, Sirius Red a MT. Kromě toho proteiny související s EMT, které indukujíledvinafibrózastejně jako kolagen I a -IV, které zvyšují akumulaci ECM, byly zvýšeny v UUO ve srovnání s kontrolami (obr. S1A a C). Tyto změny však byly utlumeny 6-BIO léčbou. Obr. 1B ukazuje, že po 7 dnech obstrukce se exprese proteinů PAI-1, CTGF, -SMA a TGF zvýšila v ledvinách modelových potkanů ​​UUO ve srovnání s expresí u kontrol a toto zvýšení bylo zmírněno ošetření pomocí 6-BIO. Výrazfibrotickýmarkery výrazně vzrostly v UUO ve srovnání s kontrolami, proti čemuž působila6-BIOošetření (obr. 1C). Imunofluorescenční barvení (obr. 1D) odhalilo, že exprese PAI-1 a CTGF (červená fluorescence) se zvýšila v obstrukceledvinyv den-7 ve srovnání s kontrolami. Exprese PAI-1 a CTGF se však po 6-BIO léčbě snížila (obr. 1D). Souhrnně tato zjištění naznačují, že 6-BIO zmírňuje tubulointersticiální poškození inhibicí exprese PAI-1 a CTGF.

3.2. 6-BIO tlumí expresi PC-JUN, PC-FOS, SP-1 a inhibuje signální dráhy spojené s fibrózou v modelu UUO potkanů

Dále jsme zjišťovali, zda6-BIOovlivňuje související signální dráhyledvinafibróza. Nejprve jsme to potvrdili6-BIO, který je známým inhibitorem GSK3, inhibuje fosforylaci GSK3. Obr. S1A a B ukazují snížení GSK3 pomocí 6-BIO. Obr. 2A ukazuje TGF /SMADsignální dráha. Analýza Western blot ukázala, že exprese fosforylovalaSMAD2/3 aSMAD4 proteiny zvýšené v UUOledviny, který byl zeslaben 6-BIO úpravou (obr. 2A). Nicméně,SMAD6, který inhibuje fosforylaci SMAD 2 a aktivituSMAD4 [40], měly opačné výsledky. Kromě toho hraje klíčovou roli signalizace MAPKledvinafibróza [41,42]. Provedli jsme analýzu western blot, abychom zjistili, zda 6-BIO ovlivňuje signalizaci MAPK. Hladiny fosforylované ERK, JNK a P38 se zvýšily v UUOledvinyve srovnání s těmi, co kontrolujíledviny(Obr. 2B). Exprese fosforylované ERK a JNK byla významně snížena 6-BIO ošetřením, zatímco pokles hladiny fosforylovaného p38 byl zanedbatelný (obr. 2B).SMADa MAPK signální dráhy byly upregulovány ve skupině UUO, což bylo obráceno6-BIOošetření (obr. 2C). Podílí se na něm mnoho transkripčních faktorůledvinafibrózaa hrají klíčové role v regulaci downstream genové exprese. Obr. 2D ukazuje, že po 7 dnech obstrukce se exprese proteinů PC-JUN, PC-FOS a SP-1 vledvinypotkanů ​​s UUO ve srovnání s kontrolní skupinou a tento nárůst byl zmírněn 6-BIO léčbou. Podobně exprese AP-1 a SP-1, důležitých transkripčních faktorů regulujícíchledvinagenů souvisejících s fibrózou, byl výrazně zvýšen vledvinykrys s UUO, ale byl oslaben po léčbě 6-BIO (obr. 2E). Obr. 2F ukazuje imunofluorescenční barvení PC-JUN, PC-FOS. a SP-1. Červená fluorescence barvení PC-JUN, PC-FOS a SP{12}} byla významně zvýšena v obstrukceledvinyve srovnání s kontrolami a byla snížena 6-BIO ošetřením. Tyto výsledky potvrzují, že AP-1 a SP-1 jsou důležitými transkripčními faktory, které se účastníledvinafibróza a6-BIOse může snížitledvinafibrózy zeslabením jejich transkripční aktivity.

Pro část 2 kliknětetady.