Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Pls klikněte sem pro část 2

I-Fang Wang,1,2 Yihan Wang,2 Yi-Hua Yang,1,3,4 Guo-Jen Huang,5,6 Kuen-Jer Tsai,3,4,* a Che-Kun James Shen1,2,7 ,*

1 Absolvent Institutu nervové regenerativní medicíny, College of Medical Science and Technology, Taipei Medical University, Taipei 11031, Taiwan

2Institut molekulární biologie, Academia Sinica, Taipei 11529, Tchaj-wan

3Institut klinické medicíny, College of Medicine, National Cheng Kung University, Tainan 70403, Tchaj-wan

4Výzkumné centrum klinické medicíny, National Cheng Kung University Hospital, College of Medicine, National Cheng Kung University, Tainan 70403, Tchaj-wan

5Katedra a postgraduální institut biomedicínských věd, College of Medicine, Univerzita Chang Gung, Taoyuan 33302, Tchaj-wan

6Neuroscience Research Center, Chang Gung Memorial Hospital, Linkou 33302, Tchaj-wan

7Vedení kontaktu

*Korespondence: kjtsai@mail.ncku.edu.tw (K.-JT), ckshen@tmu.edu.tw (C.-KJS)

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109477

Cistanche může zlepšit paměť

SOUHRN

Fenotypová variace je základním předpokladem pro evoluci buněk a organismu přirozeným výběrem. Zatímco úloha stochastické genové exprese ve fenotypové diverzitě geneticky identických buněk je dobře prostudována, není mnoho známo o vztahu mezi stochastickou genovou expresí a individuální variací chování u zvířat. Ukazujeme, že specifická miRNA (miR-466f{1}}p) je upregulována v hippocampu části jednotlivých inbredních myší při úkolu Morrisova vodního bludiště. Významné je, že miR- 466f{3}}p pozitivně reguluje morfologii, funkci a prostorové učení neuronů aPaměťschopnost myší. Mechanisticky miR-466f{1}}p potlačuje překlad MEF2A, negativního regulátoru učení/Paměť. Nakonec jsme ukázali, že různá upregulace hipokampální miR-466f{1}}p je výsledkem randomizované fosforylace hipokampálního cyklického AMP (cAMP)-response element-binding (CREB) u jedinců. Toto zjištění modulace prostorového učení aPaměťprostřednictvím randomizované hipokampální signalizační osy po neuronální stimulaci představuje demonstraci toho, jak variace v tkáňové genové expresi vede k různému chování zvířat.

ÚVOD

Fenotypová variace mezi jednotlivci poskytuje evoluční výhodu, protože poskytuje populační diverzitu, na kterou působí přírodní výběr (Pavlicev et al., 2011). Genetické pozadí a faktory prostředí přispívají ke vzniku takové přirozené variace (Bendesky a Bargmann, 2011). Experimentálně byly inbrední myši často používány ke studiu molekulárního a buněčného základu průměrných fenotypů a chování, aby se minimalizovaly účinky genetických rozdílů mezi testovanými jedinci (Casellas, 2011). Mezi jednotlivými izogenními myšmi však byla prokázána variace v množství tkáňových transkriptů. Geny vykazující vysoce variabilní úrovně exprese jsou často spojeny s imunitní funkcí, stresovými reakcemi a hormonální regulací, tj. procesy citlivými na podněty z prostředí (Vedell et al., 2011). Některé z těchto studií také ukázaly, že rozdíly v genové expresi nebo buněčné signalizaci, s nebo bez vlivu environmentálních faktorů, jako je mateřské olizování, zásobování živinami v děloze nebo stresem vyvolaná odolnost versus náchylnost (Bale, 2015; Danchin et al. ., 2011; Lorsch

et al., 2019; Pedersen et al., 2011), může vést k rozdílům ve fenotypech a chování (Casellas, 2011; Locke et al., 2015; Loos et al., 2015; Oey et al., 2015).

Prostorové učení aPaměťformaci řízenou mozkem lze rozdělit do dvou systémů: (1) egocentrická navigace využívající samopohyb a vnitřní podněty a (2) alocentrická navigace primárně zahrnující hippocampus a blízké mozkové struktury, která je stimulována distálními podněty mimo organismy (Ekstrom a kol., 2014). Schopnost prostorového učení aPaměťumožňuje většině živočišných druhů postupně upravovat své chování tak, aby se přizpůsobilo v prostorově a časově proměnných prostředích, což je rozhodující pro jejich přežití. To lze hodnotit u laboratorních zvířat aplikací vzorců chování, jako je Morrisovo vodní bludiště (MWM) (Vorhees a Williams, 2014). Pozoruhodně se ukázalo, že geneticky identičtí inbrední hlodavci vykazují fenotypové variace v prostorovém učení aPaměť(Tsai et al., 2002), ale základní mechanismy této variace chování zůstaly neznámé.

Tvorba nových vzpomínek je složitý proces vyžadující na aktivitě závislou genovou transkripci, novou syntézu proteinů a

Obrázek 1. Korelace mezi variací prostorového učení aPaměťschopnosti a miR-466f{1}}p indukce

(A) Úkol MWM u inbredních myší C57BL/6J divokého typu. Levý panel: Výkony MWM myší GLN (tečky) a myší PLN (čtverečky). Z celkového počtu 289 testovaných myší bylo 180 klasifikováno jako GLN a 109 jako PLN. Pravý panel: test MWMtask (n=47 a 30 v každé skupině). V histogramu jsou porovnány průměry v každém ze čtyř kvadrantů a oblasti platformy. P, místo chybějící plošiny; T, cílová zóna bez P; R, pravá zóna; O, protější zóna; L, levá zóna. (B) RT-qPCR analýza exprese miRNA. Relativní hladiny exprese šesti miRNA lokalizovaných v miR-466-669 klastru a miR{10}}p, jako pozitivní kontrola obohacená mozkem, byly analyzovány a normalizovány pomocí interní kontroly U6 snRNA z GLN a PLN myšího hipokampu (n=9–18 na skupinu). I, miR-466f- 3p; II, miR-466}g; III, miR-466i-3p; IV, miR-467b-3p; V, miR-467f; VI, miR-669f; VII, miR-132-3str.

jemně vyladěné specifické neuronové sítě jakoPaměťengramy k vytvoření nových neuronových spojení a trvalé plasticitě (Asok et al., 2019). Hipokampální engramy, což jsou řídké populace neuronů v gyrus dentatus (DG), představují soubory neuronů vykazujících zvýšenou aktivitu poPaměťformace. Zatímco neurony DG engram vykazují velmi odlišný vzorec genové exprese (Rao-Ruiz et al., 2019), molekulární mechanismy specifické pro engram, které jsou základemPaměťkonsolidace zůstává velkou neznámou. Je známo, že různé faktory a signální cesty regulují učení pozitivně nebo negativněPaměťprocesy byly identifikovány (Abraham et al., 2019; Humeau a Choquet, 2019). Mezi nimi aktivovaná forma cyklického AMP (cAMP)-response element-binding protein (CREB) stimuluje genovou transkripci v reakci na na aktivitě závislé zvýšení intracelulárního Ca2 plus v neuronech (Kandel, 2012). Na druhé straně, camp/PKApathway potlačuje transkripční aktivitu myocyteenhancer faktoru 2 (MEF2) tím, že brání jadernému exportu jeho korepresoru, HDAC5, a jadernému importu koaktivátoru NFAT (Belfield et al., 2006). Kromě toho, na rozdíl od CREB, aktivita MEF2A omezujePaměťformace (Cole et al., 2012). Kromě proteinových faktorů se mikroRNA (miRNA) podílejí také na regulaci neuronových funkcí, včetně učení a paměti (McNeill a Van Vactor, 2012). miRNA jsou malé (22 nt) nekódující RNA, které primárně působí jako post-transkripční regulátory genové exprese prostřednictvím sekvenčně specifického párování bází s jejich rozpoznávacími místy ve 30 netranslatovaných oblastech (30 UTR) specifických mRNA (Daugaard a Hansen, 2017). miRNA se účastní řady signálních drah v postmitotických neuronech a zprostředkovávají buněčné procesy závislé na aktivitě, včetně dendritického růstu a větvení, tvorby synapsí a zrání. Regulací genové exprese také hrají důležitou roli v dlouhodobých formách synaptické plasticity, která je základemPaměťformace, vyhledávání a konsolidace (Chen a Shen, 2013; Wang et al., 2012b).

V následujícím textu předkládáme důkazy pro příčinnou souvislost mezi expresí stochastických genů v tkáních a individuálními odchylkami v chování u zvířat. Konkrétně ukazujeme, že stochastická aktivace hipokampální osy CREB-pCREB / miR- 466f-3p-MEF2A moduluje individuální variace prostorového učení aPaměťschopnost u inbredních myší.

VÝSLEDEK

Individuální variace prostorového učení aPaměťschopnost koreluje s indukcí miR-466f{1}}p ze specifického shluku miRNA

Identifikovat miRNA zapojené do regulace učení aPaměťK rozlišení inbredních myší divokého typu C57BL/6J s dobrou nebo špatnou schopností učení a paměti jsme použili úlohu MWM (obrázek 1A). Myši, které dokončily úkol do 30 s v poslední (6.) relaci, jsme definovali jako „dobré žáky“ (GLN), zatímco myši, které nedokázaly najít platformu do 30 s v poslední relaci, byly považovány za „špatné žáky“. “ (PLN). Jak je znázorněno na obrázku 1A (levý panel), 62 procent myší patřilo do skupiny GLN (180 z 289 myší), které vykazovaly výrazné snížení únikové latence z 98,1 s (1. sezení) na 21,8 s (6. sezení). Naproti tomu úniková latence u zbývajících 38 procent myší, skupiny PLN (109 z 289 myší), byla mezi prvním a šestým sezením pouze mírně snížena (ze 111,8 s v 1. relaci na 82,1 s v 6. relaci). . Test sondy, který ukazuje, že se myši skutečně naučily úkol během šesti sezení, také ukázal, že myši GLN zůstaly déle v oblasti platformy než myši PLN (obrázek 1A, levý pár sloupců na pravém panelu).

Dále jsme analyzovali RNA z hipokampu myší GLN a PLN pomocí miRNA microarray hybridizace (n=4 v každé skupině). Obecně jsme pozorovali relativně malé rozdíly v expresních profilech hipokampálních miRNA od myší GLN a PLN. Poznamenali jsme však, že prvních 10 miRNA, u kterých byly hladiny exprese vyšší u myší GLN než u myší PLN (data nejsou uvedena), bylo všech odvozeno ze stejného klastru miRNA specifického pro hlodavce, miR-466-669, umístěného v intronu 10 gen mSfmbt2 (viz níže). Na základě reverzní transkripčně-kvantitativní polymerázové řetězové reakce (RT-qPCR) analýzy hladin exprese vybraných miRNA v klastru jsme pro další zkoumání vybrali miR-466f{9}}p (obrázek 1B). Průměrná exprese této miRNA byla 1.{12}}krát vyšší v hipokampu GLN myší ve srovnání s PLN myší. Je pozoruhodné, že průměrné hladiny hipokampálního miR-466f{14}}p byly podobné ve skupině PLN, kontrolní skupině v domácí kleci (HC) a kontrolní skupině plavání (obrázek 1C), čímž byly vyloučeny účinky související s cvičením během plavání a další podpora myšlenky, že miR-466f-3p byl vyvolán během prostorového učení aPaměťformace.

Na obrázku 1C data odhalují, že úrovně exprese hipokampální miR-466f{2}}p u více než 42 procent myší GLN byly alespoň 1.5-krát vyšší než průměrná úroveň exprese myší HC kontrolní myši, zatímco hladiny u 15 procent PLN myší byly poloviční než u HC myší. Přibližně 25 procent myší GLN a 55 procent myší PLN mělo podobné úrovně miR-466f{{10}}p (0.8- až 1.{14}} násobek vzhledem k HC). Pearsonův korelační bodový graf ukazující pozitivní korelaci mezi úrovněmi miR-466f-3p a procentuálním trváním na platformě během testu sondy je znázorněn na obrázku 1D. Také jsme provedli miR-466f{19}}p a U6 malou jadernou RNA (snRNA) in situ hybridizaci (ISH) mozkových řezů u myší GLN i PLN (obrázek 1E). Statistická analýza signálů miR- 466f-3p prostřednictvím ISH potvrdila, že indukce miR-466f- 3p byla skutečně větší u DG GLN myší ve srovnání s

PLN myši, zatímco při porovnání signálů U6 snRNA nebyl nalezen žádný rozdíl (pravý histogram, obrázek 1E). Přestože signály miR-466-3p nebyly mezi jednotlivými granulárními buňkami v DG stejné, stále se významně a všudypřítomně zvýšily v hippocampu myší GLN ve srovnání s myšmi PLN. Proto k indukci miR-466f{5}}p nedošlo pouze v malé části buněk, např. engram neuronů. Tato data naznačují, že zvýšená regulace miR-466f-3p během úlohy MWM je úzce spojena s lepším prostorovým učením aPaměťschopnost u významné části myší GLN.

Analyzovali jsme také průměrné hladiny exprese několika mozkově specifických miRNA pomocí RT-qPCR. Mezi nimi byl miR-132-3p upregulován v myším hipokampu po úloze MWM, ale nepozorovali jsme signifikantní rozdíly mezi skupinami GLN a PLN (pár sloupců VII, obrázek 1B). Hladiny exprese miR-335-5p a miR-22 byly u skupin GLN, PLN a HC podobné (obrázek S1A). Na rozdíl od miR-466f-3p tedy hipokampální exprese těchto miRNA během tréninku MWM nekoreluje s prostorovým učením aPaměťschopnost myší.

Upregulace miR-466f{1}}p podporuje růst neuritů a tvorbu dendritické páteře

Abychom potvrdili, že miR-466f{1}}p byl skutečně exprimován v neuronech, provedli jsme miRNA ISH v kombinaci s imunofluorescenčním (IF) barvením NeuN a MAP2 v primárních hipokampálních neuronech. Výsledky ukázaly, že podobně jako u jiných miRNA (Cohen et al., 2011; Thomas et al., 2017), miR-466f-3p byl exprimován hlavně v oblasti neuronálního soma, s některými dalšími signály v dendritech (obrázek S2A). Pochopit molekulární a buněčný základ asociace upregulovaného miR-466f-3p s učením aPaměťNejprve jsme přechodně nadměrně exprimovali miR-466f{1}}p spolu s fúzním polypeptidem dsRed pod kontrolou ubikvitinového promotoru z pFUGW- miR-466f-3p- dsRed plasmid do primárních hipokampálních neuronů DIV10 (obrázek S2B). Prostřednictvím miRNA ISH jsme potvrdili, že signál miR-466f{9}}p je silnější ve skupině s nadměrnou expresí miR-466f-3p ve srovnání s vektorovou kontrolou nebo mutantní miR{{ 12}}f-3p skupina (šipky, obrázek S2B). Paralelně jsme také vytvořili platformu pro zkoumání účinku miR-466f{16}}p ztráty funkce inhibicí miR-466f-3p pomocí miR-houby umístěné v 30 UTR EGFP mRNA exprimované z plazmidu pFUGW-miR-houba-EGFP (obrázek S2C). Reportér EGFP v houbovém plazmidu sloužil jako indikátor účinnosti transfekce i jako senzor aktivity buněčné miRNA (Kluiver et al., 2012). U významné části transfekovaných buněk HEK293T se signál EGFP snížil po společné expresi s miR-466f-3p divokého typu, ale ne s mutantní miR-466f{{32 }}p, v důsledku inhibice translace EGFP mRNA vazbou miR-466f-3p na miR- houbu v 30 UTR (srovnejte levé čtyři obrázky a dva his- program, obrázek S2C) . Na rozdíl od toho jsme nepozorovali snížený signál EGFP při společné expresi kontrolní houby kódující osm kopií míchané sekvence z plazmidu pFUGW-SCR- houba-EGFP buď s miR-466f-3p nebo jeho mutanta (srovnejte pravé čtyři obrázky a dva histogramy).

Jak je znázorněno na obrázku 2A, ektopická exprese miR-466f{2}}p opět vedla k morfologickým změnám neuronů, zejména ke zvýšenému růstu neuritů ve srovnání s kontrolními neurony transfekovanými vektorem pFUGW- exprimujícím dsRed dsRed nebo mutantní miR-466f-3p-exprimující plazmid pFUGW-mut-miR- 466f-3p-dsRed. Kvantifikační data ukázala, že průměrný počet dendritických větví na neuron se významně nelišil mezi skupinou nadměrně exprimující miR-466f-3p (sloupec II) a vektorovou nebo mutantní kontrolou (sloupec I a III) (vpravo horní histogram, obrázek 2A). Průměrná celková délka dendritů a průměrná délka primárních dendritů se však zvýšily po nadměrné expresi miR-466f{19}}p (srovnejte sloupec II se sloupcem I a III, pravý dolní histogram na obrázku 2A). Paralelně jsme inhibovali endogenní miR-466f-3p pomocí miR-houby. Jak je vidět, mezi miR-466f-3p-inhibičními a kontrolními skupinami nebyl žádný významný rozdíl v počtu dendritických větví (srovnejte sloupec IV se sloupcem I a V, histogram vpravo nahoře, obrázek 2A) , ale skupina inhibice miR-466f{30}}p vykazovala významné snížení průměrné celkové délky dendritů i střední délky primárních a sekundárních dendritů ve srovnání s jinými skupinami (srovnejte sloupec IV s pruhy I a V, pravý dolní histogram na obrázku 2A). Kromě toho IF barvení ukázalo, že nadměrná exprese miR- 466f-3p, ale ne inhibice, také zvýšila hustotu dendritických trnů (obrázek 2B, horní panely a levý dolní histogram). Provedli jsme také společné barvení na protein 95 postsynaptické hustoty (PSD-95) a spočítali jsme hustotu kolokalizovaných dendritických trnů, abychom stanovili přesný počet excitačních synapsí (obrázek 2B, histogram vpravo dole), což odhalilo, že miR{{40 Nadměrná exprese }}f-3p zvýšila hustotu PSD-95-pozitivních trnů ve srovnání s jinými kontrolními skupinami. Inhibice miR-466f-3p však významně nezměnila hustotu PSD-95-pozitivních trnů s ohledem na hustotu kontrolních skupin (obrázek 2B, histogram vpravo dole). Společně tato data naznačují, že při absenci neuronální stimulace samotná inhibice miR-466f-3p neovlivňuje hustoty excitačních synapsí nebo celkových dendritických trnů.