Optogenetická inhibice mediálních entorhinálních kortexových vstupů do hippocampu během krátké doby těsně po učení narušuje kontextový strach formování paměti

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstraktní

Vznik časové asociacePaměťa kontextově specifický strachPaměťpředpokládá se, že vyžaduje vstupy do mediální entorhinální kůry (MEC).hippocampuspři výukových akcích. Zda se však vstupy MEC podílejí také na tvorbě paměti během období po učení, nebylo dosud přímo testováno. Abychom tuto možnost prozkoumali, optogeneticky jsme inhibovali axony a terminály pocházející z bilaterálních dorzálních MEC excitačních neuronů v dorzálníchhippocampuspo dobu 5 minut hned po kontextovém podmiňování strachu (CFC). Myši exprimující eNpHR3.0 vykazovaly významně menší zmrazení ve srovnání s kontrolními myšmi exprimujícími samotný EGFP během testu vyhledávání v podmíněném kontextu 1 den po učení. Na rozdíl od toho stejná optogenetická inhibice vstupů MEC provedená 30 minut před testem vyhledávání neovlivnila zmrazení během testu vyhledávání, s vyloučením možnosti nespecifického škodlivého účinku optické inhibice na proces vyhledávání. Tyto výsledky podporují, že vytváření kontextové paměti strachu vyžaduje vstupy MEC do hippocampu během období po učení.

Klíčová slova: Mediální entorinální kortex, Hippocampus, Kontextové podmiňování strachu

Min Soo Kang a Jin-Hee Han

Systém hippocampus-entorhinální kůra je pro epizodický stav rozhodujícíPaměťformace [1]. Důkazy naznačují, že vstup z mediální entorhinální kortexové vrstvy III (MECIII) dohippocampus, hlavně pro podpole CA1, je zásadní pro dočasné asociativní učení, jako je sledování strachu, ale ne pro kontextové a opožděné podmiňování strachu [2, 3]. Naproti tomu optogenetická inhibice buněk střední entorhinální kortexové vrstvy II (MECII) vyčnívajících do gyrus dentatus (DG) a CA3, ale nikoli buněk vyčnívajících do CA1, během CFC narušuje tvorbu paměti [4]. Předpokládá se tedy, že vstup z MECII do DG nebo CA3 je nezbytný pro kontextové učení strachu. Nejen při učení, ale vstup MEC do hipokampu se také podílí na jedinečných vzorcích fyziologické aktivity pozorovaných v hipokampu během odpočinku a spánku, jako jsou vlnky a zubaté hroty, které jsou spojeny sPaměťproces konsolidace [5–10]. Proto vstup MEC dohippocampusmůže hrát roli při vytváření paměti během období po učení. Tato možnost však zatím nebyla vyzkoušena. Abychom otestovali, zda je vstup MEC do hipokampu nezbytný během období po učení, přijali jsme optogenetický přístup k umlčení vstupní aktivity MEC u hybridních myší 129/C57Bl/6 [11, 12]. Za účelem manipulace se vstupem MEC byl do bilaterální injekce injikován adeno-asociovaný virus (AAV) obsahující geny kódující eNpHR3.0 fúzovaný s fluorescenčním proteinem EYFP pod promotorem CaMKII (AAV-CaMKII - eNpHR3.{13}}EYFP). MEC zacílení na vrstvu II a III (0,5 µL na stranu; AP: – 4,65 mm; ML: ±3,4 mm; DV: – 3,3 mm) (obr. 1a). Jako kontrola jsme injikovali AAV postrádající eNpHR3.0 (AAV CaMKII -EGFP), který exprimuje pouze fluorescenční protein. Exprese AAV byla omezena na vrstvy MEC II a III, které vysílají projekci do hipokampu (obr. 1b). V hippocampu byly axonální projekce MEC exprimující EYFP detekovány v DG a CA3, pocházející z MECII, a také v CA1, pocházející z MECIII (obr. 1a). Tři týdny po operaci injekce AAV byly myši znovu anestetizovány pro implantaci optických vláken.

Cistanchemůže zlepšitPaměť

Optická vlákna byla implantována do dorzálního hipokampu (AP: − 2.0 mm; ML: ± 1,3 mm; DV: − 1,5 mm) pro optickou supresi dorzálních MEC vstupů pomocí 561- nm laseru. Špičky optických vláken byly umístěny přímo nad molekulární vrstvou CA1 stratum lacunose, a proto 561-nm laser mohl pokrýt jak MECII aferenty v molekulární vrstvě DG/CA3 stratum radiatum, tak aferenty MECIII v molekulární vrstvě CA1 stratum lacunose ( Doplňkový soubor 1: Obr. S1). Během týdenního období zotavení po operaci implantátu si myši prošly zvykáním na vlákna po dobu 3 dnů. Byly připojeny k optickému propojovacímu kabelu dodávajícímu světlo a umístěny do habituační klece na 5 minut bez dodání světla. Po 3 dnech zvykání byly myši EGFP a eNpHR3.{21}} trénovány na CFC.

Myši vstoupily do klimatizační komory a dostaly šok do nohy ({{0}},5 mA, 2 s) o 3 minuty později. Minutu po šoku do tlamy byly myši okamžitě přeneseny do habituované klece a dostávaly kontinuální 561-nm světlo (5 mW na špičce vlákna) po dobu 5 minut (obr. 1b). Po inhibici po učení se myši vrátily do svých domovských klecí. Pro testování, zda byla kontextová paměť správně vytvořena, byla testována dlouhodobá paměť (LTM). Myši znovu vstoupily do kondicionační komory 24 hodin po CFC. Úrovně zmrazování byly měřeny jako index LTM, sledované po dobu 3 minut. Myši ve skupině eNpHR3.0 vykazovaly významně méně zmrazení ve srovnání s myšmi v kontrolní skupině EGFP (obr. 1c), což ukazuje na deficit 24-h LTM inhibicí vstupů MEC do hipokampu po učení. Toto snížení zamrzání nebylo způsobeno nespecifickým škodlivým účinkem procesu optické inhibice. Když byla stejná optická inhibice aplikována 30 minut před testem LTM, nebyl mezi skupinami žádný významný rozdíl v zmrazení (obr. 1d, e).

Přestože většina aferentních MEC cílí na hippocampus, je známo, že MEC vysílá projekce do mediálních prefrontálních kortikálních oblastí, jako je prelimbická a infralimbická kůra [13]. Vzhledem k tomu, že exprese AAV byla v MEC náhodná, je možné, že naše optická inhibice ovlivnila axony MEC, které procházejí hipokampem, pokud vůbec nějaké, aby vyvolaly svůj účinek na kontextovou tvorbu paměti strachu. Abychom tuto možnost vyloučili, retrográdně jsme označili neurony MEC, které vyčnívají do hipokampu. Do hipokampu jsme vstříkli virus CAV2-Cre, který je retrográdně pohlcen neurony, které vyčnívají do hipokampu přes zakončení axonů (obr. 1f).

AAV-Ef1 - DIO-eNpHR3.0-EYFP nebo AAV-Ef1 -DIO-EYFP byl injikován do MEC, takže neurony MEC, které pohltily CAV2-Cre, mohou express eNpHR3.{10}EYFP nebo EYFP (Dodatečný soubor 1: Obr. S2). Deset, podařilo se nám inhibovat vstupy MEC v hipokampu hned po CFC. Podobně jako u předchozích výsledků optická inhibice v tomto stavu narušila vytváření paměti kontextu strachu (obr. 1g, h). Tato data tedy dále posilují náš závěr, že vstupy MEC do hipokampu jsou klíčové pro vytváření kontextuální paměti během období po učení. Jedním omezením v této studii je nedostatek prostorové specifity v použité optické inhibici.

Není tedy jasné, do jaké míry a kde přesně byly v hipokampálním okruhu rozšířené vstupy MEC potlačeny optickou inhibicí v našem stavu. Přesná inhibice vstupů MEC zaměřených na konkrétní podpole, jako je CA1 nebo DG hippocampu, může být nezbytná k objasnění mechanismu, kterým vstupy MEC přispívají k vytváření kontextové paměti strachu v budoucí studii. Ačkoli jsme v této studii netestovali účinek optické inhibice vstupů MEC do hipokampu v různých časových bodech po kontextuálním podmiňování strachu, předchozí studie uvádějí časově závislou roli mozkových aktivit po učení pro konsolidaci vzpomínek závislých na hippocampu, jako je kontextové podmiňování strachu. Například pomocí optogenetické strategie předchozí studie uměle manipulovala s indukcí pomalého spánku (SWS) v různých časových bodech po různých učebních úkolech a zdálo se, že existuje kritické časové okno (do 30 minut), během kterého SWS vyvolal světlem může zlepšit vzpomínky závislé na hipokampu [14].

Obr. 1 inhibice vstupu MEC do hippocampu bezprostředně po výdělku zhoršuje dlouhodobou kontextovou tvorbu paměti strachu. a Schematické znázornění bilaterální AAVinekce a místa implantace optického ferulu (na levé straně). Reprezentativní obrázky conkocalmikroscopk s expresí EGFP a eNpHR0-EYFP v MEC nahoře) a v hipokampu (dole). Hvězdička označuje přibližnou polohu hrotu optického vlákna. b Schéma chování. Histogram ukazující úroveň zamrznutí během testeNpHR30 kolem（3589主 3,21 procenta ,n=】1】 ukázal výrazně méně křehkého šperku ve srovnání s kontrolní skupinou EGFP (53,13±265 procent ,n{12}}) v roce LTM test.**str<00005; students="" t-test.behavior="" scheme.e="" histogram="" shoving="" freezing="" level="" during="" the="" test.enphr3.0(5031±290%,n="1l)and" egfp(4831±427%,n="10group" showed="" similar="" feinglevelin="" utm="" tes.p="">005:Studentský t-test. není významný,f strategie inigce CAV a AAV nebo retrográdní značení MEC neuonproilcting hippocampus(f) Schematické znázornění bilaterální CW injekce AW injekce a schéma chování místa implantace optického ferulu (vpravo). h Histogram zobrazující úroveň zamrznutí během testu. Skupina eNpHR3.0 (33,71±4,06 procent ,n=11) ​​vykázal významně nižší úroveň zamrznutí ve srovnání s kontrolní skupinou EYFP (50,13±3,18 procenta,n=12) v testu LIM .**str<0005; student's="" t-test="" data="" are="" presented="" as="">

Zajímavé je, že další studie na potkanech ukázala, že selektivní elektrolytické léze přímé entorhinální projekce (temporoammonické, TA) do hipokampální oblasti CA1 24 h, ale ne 3 týdny po tréninku Morrisova vodního bludiště, narušily tvorbu prostorové paměti na vzdáleném čas, což naznačuje, že interakce MEC-hippokampus prostřednictvím vstupní dráhy TA během tohoto časového období je nutná pro konsolidaci systémů [15]. Vzhledem k těmto zjištěním je vysoce pravděpodobné, že vstupy MEC do hipokampu mají časově závislou roli při vytváření nedávné a vzdálené kontextové paměti strachu.

V naší studii je zajímavé, že tak krátká doba (5 minut) post-tréninkové optogenetické inhibice stačila k narušení tvorby kontextové paměti. Jedna interpretace je, že naše výsledky mohou odrážet částečný blok konsolidačních událostí, které jsou nutné pro normální tvorbu paměti. V souladu s tímto popisem byla v našem stavu částečně narušena paměť. Další možností je, že během tohoto krátkého časového bodu potřebného pro vytvoření kontextové paměti strachu může nastat kritická událost. Jednou z možností je, že vstup MEC může být rozhodující pro spouštění vlnění nebo zubatých hrotů v hipokampu, které korelují s přehráváním dříve prožitých událostí [7, 9, 10, 16] a optogenetická inhibice vstupu MEC by mohla narušit takové vzorce aktivity. Alternativně může krátká inhibice vstupu MEC ovlivnit následný spánek s pomalými vlnami, který má také zásadní časové okno z hlediska konsolidace paměti závislé na hippocampu [14].

Reference

1. Eichenbaum H. Kortikálně-hipokampální systém pro deklarativní paměť. Nat Rev Neurosci. 2000;1(1):41–50.

2. Suh J, Rivest AJ, Nakashima T, Tominaga T, Tonegawa S. Vstup vrstvy III entorhinální kůry do hippocampu je zásadní pro časovou asociaci

3.paměť. Věda. 2011;334(6061):1415–20. Kitamura T, Pignatelli M, Suh J, Kohara K, Yoshiki A, Abe K, et al. Ostrovní buňky řídí časovou asociační paměť. Věda. 2014;343(6173):896–901.

4. Kitamura T, Sun C, Martin J, Kitch LJ, Schnitzer MJ, Tonegawa S. Entorhinální buňky kortikálního oceánu kódují specifické kontexty a řídí kontextově specifickou paměť strachu. Neuron. 2015;87(6):1317–31.

5. Buzsaki G, Horvath Z, Urioste R, Hedtke J, Wise K. Vysokofrekvenční síť

6.oscilace v hipokampu. Věda. 1992;256(5059):1025–7.Bragin A, Jando G, Nadasdy Z, Vanlandeghem M, Buzsaki G. Dentate EEG hroty a související interneuronální populační výbuchy v hipokampální hilové oblasti krysy. J Neurophysiol. 1995;73(4):1691–705.

7. Chrobak JJ, Lorincz A, Buzsaki G. Fyziologické vzorce v systému hipokampálně-entorinální kůry. Hippocampus. 2000;10(4):457–65.

8. Girardeau G, Zugaro M. Hippokampální vlnění a konsolidace paměti. Curr Opin Neurobiol. 2011;21(3):452–9.

9. Yamamoto J, Tonegawa S. Přímý mediální entorinální kortexový vstup do hippocampu CA1 je zásadní pro prodloužené přehrávání v tichém stavu. Neuron. 2017;96(1):217–27.

10. Nokia MS, Gureviciene I, Waselius T, Manila H, Penttonen M. Hipokampální elektrická stimulace narušuje asociativní učení, když je zaměřena na dentální hroty. J Physiol-London. 2017;595(14):4961–71.

11. Wehner JM, Silva A. Význam rozdílů mezi kmeny při hodnocení procesů učení a paměti u nulových mutantů. Ment Retard Dev Disabil Res Rev. 1996;2(4):243–8.

12. Vetere G, Kenney JW, Tran LM, Xia F, Steadman PE, Parkinson J a kol. Chemogenetické zkoumání sítě paměti strachu v celém mozku u myší. Neuron. 2017;94(2):363–74.

13. Insausti R, Herrero MT, Witter MP. Entorhinální kůra potkana: cytoarchitektonické dělení a původ a distribuce kortikálních aferentů. Hippocampus. 1997;7(2):146–83.

14. Lu Y, Zhu ZG, Ma QQ, Su YT, Han Y, Wang X a kol. Kritické časové okno pro selektivní indukci konsolidace paměti hipokampu krátkou epizodou spánku s pomalými vlnami. Bulletin neurověd. 2018;34(6):1091–9.

15. Remondes M, Schuman EM. Role kortikálního vstupu do hipokampální oblasti CA1 při konsolidaci dlouhodobé paměti. Příroda. 2004;431(7009):699–703.

16. O'Neill J, Boccara CN, Stella F, Schoenenberger P, Csicsvari J. Povrchové vrstvy mediálního entorinálního kortexu se přehrávají nezávisle na hipokampu. Věda. 2017;355(6321):184–8.