Omega-3 mastné kyseliny upregulují SIRT1/3, aktivují PGC-1 prostřednictvím deacetylace a indukují produkci Nrf1 v modelu krysy s 5/6 nefrektomií
Mar 10, 2022
Úvod
Ledvinyse podílejí na regulaci několika funkcí, včetně různých metabolických drah, rovnováhy vody a elektrolytů, kontroly krevního tlaku a produkce několika hormonů. Protože tyto funkce spotřebovávají obrovskou energii,ledvinyjsou bohaté na mitochondrie [1]. Mitochondrie se mohou adaptovat na různé metabolické podmínky prostřednictvím regulačních mechanistických cílů rapamycinu (mTOR) a AMP-aktivovaných proteinkinázou (AMPK) zprostředkovaných dráhami snímání živin za účelem udržení zdravé mitochondriální populace [2]. Mezi studiemi o mitochondriích je k dnešnímu dni pouze několik studií o mitochondriální biogenezi. Většina studií souvisejících s mitochondriální biogenezí je založena na neledvinovétkáně [3,4] a studie naledvinyse týkají především akutníchporanění ledvin(AKI) zvířecí modely, proximální tubulární buňky a diabetická nefropatie [5–7]. Ačkoli mitochondriální biogeneze může souviset s patogenezí mitochondriální dysfunkce u nediabetických chronickýchnemoc ledvin (CKD), výzkum na toto téma je také velmi omezený. CKD a mitochondriální biogeneze souvisí s kardiovaskulárním onemocněním [8,9]. Zlepšení mitochondriální biogeneze může být prospěšné pro kardioprotekci u CKD. Studie ukazující, že omega-3 mastné kyseliny (MK) usnadňují biogenezi mitochondrií, byla provedena za použití neledvinatkání [3,10]. Nedávná studie prokázala slibnou roli omega-3 FA v mitochondriální biogenezi na zvířecích modelech s kardiovaskulárními a neurodegenerativními onemocněními [11]. Proto jsme se v této studii zaměřili na zkoumání mitochondriální biogeneze vledviny5/6 nefrektomických (Nx) krys. Kromě toho jsme pomocí tohoto modelu hodnotili účinek omega-3 FA na mitochondriální biogenezi.
klíčová slova:nukleární respirační faktor 1; jaderný faktor erytroidní 2-příbuzný faktor 2; sirtuin 1; sirtuin 3; omega-3 mastná kyselina; ledvina, ledvina
CISTANCHE ZLEPŠÍ ONEMOCNĚNÍ LEDVIN/RENÁL
2. Výsledky
2.1. Změny funkce ledvin a histologické nálezy
Ve srovnání s kontrolní skupinou byla hladina močovinového dusíku (BUN) v krvi ve skupinách Nx a Nx léčených omega{{0}}} FA významně zvýšena (kontrolní skupina 17,7 ±1,5, Nx skupina 77,7 土 28,4 a sýkora s omega-3 FA skupina 63,9 土 17.0 mg/dl, p = 0.{{20}}07). Ačkoli nebyl žádný významný rozdíl mezi skupinami Nx a Nx léčenými omega-3 FA, hladiny BUN byly numericky nižší ve skupině Nx léčené omega-3 FA. Hladina sérového kreatininu (sCr) mezi těmito třemi skupinami byla podobná jako u BUN (kontrolní skupina, 0,4 0,0 U; skupina Nx, 1,3 土 0,6; omega-3 FA, 1,0 ± 0,3 mg/dl; y=0,008). Ve srovnání s kontrolní skupinou byla pozorována závažná tubulární dilatace a atrofie pomocí barvení PAS ve skupině Nx (doplňkový obrázek S1). Kromě toho výsledky ukázaly, že skupina Nx léčená omega-3 FA vykazovala méně tubulointersticiálních změn než skupina Nx. Thefunkce ledvina histologické změny ve třech skupinách již byly popsány v předchozí studii [12].
22 Změny ve faktorech souvisejících s mitochondriální biogenezí
2.2.1. Exprese Nrf1 a Nrf2.Ve srovnání s kontrolní skupinou vykazovala skupina Nx významně sníženou hladinu exprese nukleárního respiračního faktoru 1 (Nefl) a nukleárního faktoru erytroidního 2-faktoru 2 (Nrf2). Avšak ve skupině Nx léčené omega-3 FA byla hladina exprese Nrf1 a Nrf2 významně zvýšena ve srovnání se skupinou Nx, ale nedosáhla úrovně kontrolní skupiny (Oigure P, doplňkový obrázek St) . Tyto výsledky byly také nalezeny cn Nrf1 mRNA kvantitativní PCR analýzou v reálném čase (doplňkový obrázek S3).
2.2.3. Vyjádření faktorů souvisejících s PGC-1 Aktivita: pAMPK, SIRT1/3.Ve srovnání s kontrolní skupinou vykazovaly skupiny Nx a Nx léčené omega-3 významně nižší hladiny fosforylovaného AMPK (poměr dýně k AMPK) (obrázek 3A). Kromě toho skupina Nx vykazovala významně nižší úroveň exprese sirtuinu 1 (SIRT1) ve srovnání s kontrolní skupinou (obrázek 3B, doplňkový obrázek S6). Po přidání omega-3 FA se však exprese SIRT1 relativně zvýšila, ale tento rozdíl nebyl statisticky významný. Tyto výsledky byly nalezeny při kvantitativní analýze mRNA SIRT1 v reálném čase PCR (doplňkový obrázek S7). Naopak exprese sirtuinu 3 (SIRT3) byla významně snížena ve skupině Nx ve srovnání s kontrolní skupinou, která byla významně zachráněna ve skupině Nx léčené omega-3 FA (obrázek 3C).
2.2.4. Exprese Keap1, mTOR, FoxO1 a FoxO3, ve srovnání s kontrolní skupinou byla exprese Kelch-like EC H-asociovaného proteinu 1 (Keap1) a proteinů Forkhead box O1 a O3 (FoxO1/3) významně zvýšena ve skupině Nx . Ve skupině Nx léčené omega-3 FA byla hladina exprese Keap1 a FoxO1/3 významně snížena ve srovnání se skupinou Nx (obrázek 4C,E,F). Ve srovnání s kontrolní skupinou byla exprese mTOR významně snížena ve skupině Nx. Nicméně ve skupině Nx léčené omega-3 FA byla exprese mTOR zachráněna, ale nedosáhla úrovně v kontrolní skupině (obrázek 4B)
2.2.5. Obsah mitochondriální DNA (mtDNA), Významné snížení mtDNA bylo pozorováno ve skupině Nx ve srovnání s kontrolní skupinou. Redukční množství mtDNA se však významně obnovilo ve skupině omega-3 Nx léčené Nx (doplňkový obrázek S9).
3. Diskuse
PGC-1, který se aktivuje fosforylací a deacetylací, je hlavním regulátorem mitochondriální biogeneze a produkce energie. Našli jsme pokles exprese a deacetylace PGC-1 v modelu CKD. Je pozoruhodné, že snížená PGC-1 deacetylace je hlavním mechanismem přispívajícím k dysfunkční mitochondriální biogenezi a snížené produkci energie u CKD. AMPK aktivuje PGC-1 prostřednictvím fosforylace jeho threoninových nebo serinových zbytků [13,14]. AMPK je také aktivován po fosforylaci, když je poměr AMP/ATP vysoký. Je však známo, že AMPK je u CKD inaktivován v důsledku zhoršeného snímání vysokých hladin AMP [15,16]. Podobně jako v předchozích studiích jsme prokázali, že fosforylace AMPK byla významně snížena vledvinatkáně skupiny Nx. Ačkoli se zdá, že pPGC-1/PGC-1 je do určité míry zvýšeno ve skupině Nx, je nepravděpodobné, že by se úroveň fosforylace PGC-1 zvýšila kvůli sníženému PGC{{3 }} výraz. Kromě toho skupina Nx léčená omega-3 FA také vykazovala podobné výsledky jako skupina Nx, což naznačuje, že podávání omega-3 FA neovlivnilo fosforylaci AMPK a PGC{{6} } . K deacetylaci může dojít v celé sekvenci PGC-1 a SIRT1 a 3 hrají hlavní roli v procesu deacetylace [13,14]. Po podání omega-3 FA se hladina exprese PGC-1, SIRT1 a 3 zvýšila, což vedlo k záchraně deacetylovaného PGC-1 na stejnou úroveň jako u normální kontrolní skupiny . Záchrana úrovně exprese Nrf1 a Nrf2, která je prokázána u skupiny Nx léčené omega-3 FA, přímo souvisí se zvýšením úrovně exprese SIRT1 a 3, což dále vedlo k deacetylaci PGC{ {22}}.
CISTANCHE ZLEPŠÍ FUNKCI LEDVIN/RENÁL
Nedávné studie o mitochondriích vnemoc ledvinprokázali, že zvýšení úrovně exprese PGC{0}} nebo SIRT prostřednictvím genetických nebo farmakologických intervencí zlepšilopoškození ledvinna zvířecích modelech AKI [5–7,17,18]. Základní mechanismus zahrnuje účinek zlepšení oxidační nebo antioxidační reakce FA. Předchozí studie uváděla, že podávání omega-3 FA zlepšilo mitochondriální beta-oxidaci FA a vykazovalo antioxidační účinky u 5/6 Nx potkaního modelu [19]. Existují také zprávy naznačující, že omega-3 FA zvyšuje expresi PGC-1, Nrf1 a SIRT1 ve svalových buňkách, makrofázích a nervových buňkách [3,10,11]. Protože účinky omega{16}} FA na mitochondrie v modelu CKD nebyly dosud hlášeny, prokázali jsme, že omega{17}} FA je účinný při obnově molekul souvisejících s mitochondriální biogenezí a mtDNA pomocí modelu CKD v tomto studie.
Jak mTOR, tak AMPK se účastní mitochondriální biogeneze, ale jejich role se liší v závislosti na nutričním stavu. mTOR, cíl rapamycinového komplexu 1 (mTOC1), může být aktivován prostřednictvím energetických stimulů, jako je aminokyselina nebo glukóza, a může spustit dráhy, které vedou k anabolickým procesům a mitochondriální biogenezi. Naopak AMPK může být aktivován hypoxií a nutričním deficitem, což vede k aktivaci katabolického procesu a mitochondriální biogenezi a inhibuje spotřebu energie prostřednictvím mTOC1 [2]. V této studii jsme nejen prokázali pokles pAMPK/AMPK, ale také pokles mTOR v modelu CKD. Kromě toho podávání omega-3 FA vedlo k téměř obnovení exprese mTOR, ale k žádnému obnovení poklesu pAMPK/AMPK. Omega-3 FA proto mohou zmírnit sníženou mitochondriální biogenezi zvýšením exprese mTOR vledvinyzvířecího modelu CKD. Je však třeba provést další studie, aby se objasnilo, zda je mTOR snížen u pacientů s CKD a jak zvýšení exprese mTOR prostřednictvím léčby omega-3 FA ovlivní mitochondriální zdraví a progresi CKD.
FoxO1 a 3 se vážou na promotor PGC-1 a zesilují jeho transkripci [20,21]. V této studii však bylo zjištěno, že FoxO1 a 3 byly zvýšeny ve skupině Nx a sníženy v kontrolní skupině a skupině Nx léčené omega-3 FA. Proto se předpokládá, že exprese FoxO1 a 3 je relevantní pro kompenzační odpověď na snížení PGC-1 u CKD nebo zvýšení PGC-1 prostřednictvím podávání omega-3 FA. Nrf2 hraje důležitou roli v buněčné redoxní homeostáze a mitochondriální biogenezi. Existují tři systémy ubikvitin ligázy související s degradací Nrf2 (Keap1, protein obsahující repetice transducinu a synoviální E3 ubikvitin ligáza) [22]. V této studii jsme prokázali významný pokles Nrf2 a významný nárůst Keap1 ve skupině Nx ve srovnání s kontrolní skupinou. d Nicméně ve skupině Nx léčené omega-3 FA byla nalezena exprese Keap1 být snížen a Nrf2 byl zvýšen. Výsledky naznačují, že zlepšený antioxidační účinek podávání omega-3 FA u CKD potkaního modelu může souviset se snížením exprese Keap1 a degradace Nrf2, což může zvýšit mitochondriální biogenezi. Na základě výsledků získaných v této studii je nutný další výzkum, aby se objasnil kauzální vztah mezi FoxO1/3 a Nrf2 v prostředí CKD a účinek podávání omega-3 FA.
CISTANCHE ZLEPŠÍ INFEKCI LEDVIN/RENÁL
Molekulová hmotnost Nrf2 byla v této studii a dalších nedávných studiích zjištěna na ploše 68 kilodaltonů (kDa) [23,24]. Předchozí studie však prokázaly, že biologicky relevantní molekulová hmotnost Nrf2 je 95–110 kDa [25,26]. Našli jsme také pásy, u kterých bylo podezření, že jsou biologicky relevantní Nrf2 (doplňkový obrázek S8). K nalezení molekulové hmotnosti biologicky důležitého Nrf2 jsou nutné další studie. V předchozích studiích byly hlášeny změny v mitochondriích 28. den po 5/6 Nx, což naznačovalo pokles exprese genu nebo proteinu spojeného s beta-oxidací, oxidativní fosforylací a strukturním proteinem vnitřní membrány, ale nedošlo k žádnému výsledku související s výrazem PGC-1 [27,28]. V této studii jsme potvrdili, že molekuly související s mitochondriální biogenezí a mtDNA odrážející mitochondriální biogenezi byly modulovány během chronického stadia, protože změny byly pozorovány 45. den po 5/6 Nx u potkanů. Navzdory histologickým a biologickým zlepšením léčba omega-3 FA nevedla k funkční obnověledvinyve srovnání s modelem Nx. Je proto zapotřebí další výzkum, aby se zjistilo, zda jsou omega-3 mastné kyseliny účinné při obnověfunkce ledvinindukcí účinků, které by mohly zlepšit mitochondriální funkci. Tato studie má několik omezení. Nejprve jsme nehodnotili aktivitu citrátsyntázy a tvorbu superoxidu v mitochondriálním dýchacím řetězci. Za druhé, neexperimentovali jsme, které FA složky přípravku Omacor jsou ovlivněny hlavně na molekulách souvisejících s mitochondriální biogenezí. Za třetí, neprokázali jsme jasný mechanismus pro zlepšení molekul souvisejících s mitochondriální biogenezí. Jen navrhujeme, že protizánětlivý účinek, snížení oxidačního stresu a samotné omega-3 mastné kyseliny jako metabolické sloučeniny, mohou souviset s mechanismem.
4. Materiály a metody Mitochondriální biogeneze
4.1. Zvířata a experimentální designStudie byly provedeny na samcích krys Sprague-Dawley (ve věku 9-týdnů) zakoupených od Japan SLC, Inc. (Shizuoka, Japonsko). Všechny krysy byly podrobeny buď falešné kontrole nebo 5/6 Nx. Všechny procedury zahrnující zvířata byly provedeny v souladu se souhlasem Institutional Animal Care Committee (DIACUC-14-4) univerzity Dong-A. Potkani byli chováni za standardních podmínek a byl jim umožněn volný přístup k vodě z vodovodu a standardní stravě. Všechny krysy byly zařazeny do následujících skupin: skupina 1 (simulovaná kontrola, n=6), kontrolní krysy držené na fyziologickém roztoku (1 ml/kg/den výplachem žaludku); skupina 2 (Nx skupina, n=6), Nx krysy držené na fyziologickém roztoku (1 ml/kg/den výplachem žaludku); skupina 3 (skupina omega-3 FA), krysy Nx léčené omega-3 FA. Dávka a způsob podávání omega-3 FA (Omacor, 300 mg/kg/den žaludeční sondou, Pronova Biocare, Sandefjord, Norsko) byly stanoveny na základě předchozích studií [19]. Omacor je omega-3 MK z moře a skládá se ze 460 mg kyseliny eikosapentaenové (EPA) a 380 mg kyseliny dokosahexaenové (DHA) v 1 g přípravku Omacor. Omacor je obvykle předepisován k sekundární prevenci po infarktu myokardu a léčbě hypertriglyceridémie [29]. Dvě omega-3 MK (EPA plus DHA) jsou hlavní (84 procent) a aktivní složky přípravku Omacor, které jsou farmaceuticky připravovány
kompozice překonávající minoritní složky (16 procent). Omacor jsme zvolili pro suplementaci omega-3 FA s protizánětlivým účinkem a snížením oxidačního stresu, protože v klinických studiích snížil riziko kardiovaskulárních onemocnění [30]. Krysy byly krmeny rovnoměrně a jejich hmotnost byla sledována denně. Krysám byl umožněn volný přístup k vodě z vodovodu po dobu 15 týdnů po operaci a poté byly usmrceny pod anestezií diethyletherem. Po smrti byl odebrán vzorek krve z aorty a poté centrifugován při 3000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut. K identifikaci změn vfunkce ledvinHladiny BUN a sCr byly měřeny pomocí automatického analyzátoru (Roche, Německo).
4.2. Histopatologické vyšetření.Opraveno formalínemledvinatkáně byly zality v parafínu, nakrájeny na plátky (4 um) a obarveny kyselinou jodistou-Schiff. Histopatologické změny byly pozorovány pomocí Aperio ScanScope (Aperio Technologies, Vista, CA, USA).
4.3. Izolace RNA a kvantitativní analýza PCR v reálném čase.Celková RNA byla extrahována zledvinatkáně pomocí činidla TRIzol. Poté byl 1 ug celkové RNA převeden na jednořetězcovou cDNA pomocí soupravy pro syntézu M-MLV cDNA (Enzynomics, Daejeon, Korea). Primery byly navrženy z příslušných genových sekvencí pomocí softwaru Primer3 a mfold. Pro kvantitativní analýzu PCR v reálném čase byla cDNA podrobena amplifikaci PCR pomocí genově specifických primerů: potkan PGC1 50- CCG AGA ATT CAT GGA GCA AT-30(smysl), 50- GTG TGA GGA GGG TCA TCG TT-30(antisense); potkaní Nrf1 50- GTT TCA TGG ACC CAA GCA TT-30(smysl), 50- GGT GGC CTG AGT TTG TGT CT-30(protismysl); potkan SIRT3, 50- GAG ACT TGG TGG GGT CCT TT -30(smysl), 50- ATC CTG CAG CTC TTG TGT CC -30(protismysl); potkan SIRT1, 50- CAG GTT GCA GGA ATC CAA AG -30(smysl), 50- CTC CAC GAA CAG CTT CAC AA -30(protismysl); krysí aktin, 50- GCG CAA GTA CTC TGT GTG GA -30 (smysl), 50- CAT CGT ACT CCT GCT TGC TG -30 (protismysl). PCR v reálném čase byla provedena pomocí SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) s přístrojem ABI 7500 (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA).
CISTANCHE ZLEPŠÍ BOLESTI LEDVIN/RENÁL
4.4. Western blotting a imunoprecipitace.Western blotting byl analyzován, jak bylo popsáno dříve, s mírnými modifikacemi [10].ledvinytkáně byly homogenizovány lyzačním pufrem (PRO-PREP proteinový extrakční roztok), inkubovány (30 min při 4 ◦C) a centrifugovány (14,000 rpm po dobu 20 min při 4 ◦C). Koncentrace proteinu byla stanovena Bradfordovým proteinovým testovým činidlem (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Vzorek stejného proteinu byl nanesen na 7,5–15% SDS-PAGE a přenesen na nitrocelulózovou membránu (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA). Poté byly proteiny imunoblotovány s každou protilátkou. Protilátky proti PGC-1 a SIRT1 byly získány od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Protilátky proti AMPK, pAMPK, Nrf1, SIRT3, Fox01, Fox03a a mTOR byly zakoupeny od Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Protilátky proti Nrf2, Keapl (monomer) a -aktinu byly zakoupeny od Abcam (Cambridge, MA, USA) a Sigma (St. Louis, MO, USA). Pro imunoprecipitaci bylo celkem 500 ug proteinu inkubováno s PGC-1 protilátkami (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) a proteinovými A/G plus-agarózovými kuličkami (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) a nechala se míchat při 4 °C přes noc. Imunoprecipitáty byly poté separovány pomocí elektroforézy SDS-PAG a imunoblotovány pomocí protilátek proti acetyl-lysinu (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) a fosfoserinu (MerckMillipore, Burlington, MA, USA). Membrány byly následně inkubovány se sekundární protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou po dobu 60 minut při teplotě místnosti. Hladiny proteinu byly standardizovány pomocí -actinu (ImageJ verze 1.48q). Western blotování a imunoprecipitační analýza s protilátkami byla provedena pomocí chemiluminiscenčního substrátu se zesíleným Super Signal West Pico (Thermo Scientific, Hudson, NH, USA) a detekována pomocí LAS-3000} Plus (Fuji Photo Film, Tokio, Japonsko).
4.5 Měření obsahu mtDNAKe stanovení relativního obsahu mtDNA byla použita qPCR. Reakce byla provedena pomocí SYBR Green chemistry za použití 3 ng celkové DNA jako templátu a následujících primerů: krysí mtDNA 5'-GGTTCTTACTTCAGGGCCATCA-3' (sense), 5,-TGATTAGACCCGTTACCA TCGA-3}' ( antisense); potkaní p-aktin, 5'- CCCAGCCATGTACGTAGCCA (smysl), C- CGTCTC- CGGAGTCCATCACf (antisense). Obsah mtDNA vzhledem k jaderné DNA byl popsán v [31].
4.6 Statistická analýzaStatistické analýzy byly provedeny pomocí softwaru SPSS 18.0 (IBM Corp., Armonk, NYP USA). Výsledky jsou vyjádřeny jako průměr 土 SD. Průměry pro skupiny byly porovnány analýzou rozptylu, po které následovalo Tukeyho vícenásobné srovnání. p e 0.05 bylo považováno za statisticky významné.
5. Závěry
Na krysím modelu CKD byly pozorovány významné modulace v expresi mediátorů souvisejících s mitochondriální biogenezí. Omega-3 FA může zlepšit mitochondriální biogenezi zvýšením regulace Nrf1 a Nrf2. Tento ochranný mechanismus může být zahájen zvýšením exprese PGC-1 a deacetylací PGC-1, která byla spuštěna zvýšenou produkcí SIRT1/3 (obrázek 5). Obrázek 5. Účinek omega-3 FA na mitochondriální biogenezi u CKD. Tučné černé šipky označují expresi mediátorů souvisejících s mitochondriální biogenezí v modelu CKD potkanů. Červené šipky označují vyjádření mediátorů po podání omega{10}} FA. Šipky nahoru/dolů označují zvýšení a snížení exprese mediátorů.
