Lipidové nanočástice s obsahem extraktu z olivových listů (Olea Europaea L): Optimalizace parametrů zpracování podle Box-Behnken statistického návrhu, charakterizace in vitro a hodnocení antioxidační a antimikrobiální aktivity
Jun 10, 2022
Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací
Abstraktní:Cílem této studie bylo připravit a vyhodnotit pevné lipidové nanočástice (SLN) prášku z extraktu z olivového okapu (OLP), který obsahoval mnoho antioxidačních a antimikrobiálních látek, jako je oleuropein, přírodní polyfenol. Hlavním problémem týkajícím se OLP byla nestabilita způsobená podmínkami prostředí, a tudíž ohrožená bioaktivita. K překonání tohoto problému byly SLN navrženy tak, že byly homogenní za horka, po kterém následovala sonikační technika, aby se lék chránil a zlepšila se jeho antioxidační a antimikrobiální aktivita. Lipidy jako kompritol 888ATO a povrchově aktivní látky jako tween 80 byly použity pro vývoj a stabilizaci SLNS a optimalizace byla provedena statistickým návrhem Box-Behnken (3x3). Optimalizovaná dávka (F9) ukázala velikost částic, účinnost zachycení, PDI a zeta potenciál 277,46 nm, 80,48 procent, 0,275. a -23.18 mV v tomto pořadí. Optimalizovaná formulace (F9) vykazovala vzor postupného uvolňování až 24 hodin s kinetikou uvolňování prvního řádu（R²=0.9984） a bylo zjištěno, že mechanismus uvolňování léčiva je typu Fickianovy difúze (n=0 .441). Na základě studie stability bylo možné zjistit, že formulace SLN byla stabilní. Antioxidační a antimikrobiální studie byly provedeny na optimalizované formulaci a zjištění naznačovala, že SLN vykazovaly zlepšenou aktivitu vychytávání radikálů a antimikrobiální aktivitu proti grampozitivním (Staphylococcus aureus) a gramnegativním (Pseudomonas aeruginosa) bakteriím. Nakonec se dospělo k závěru, že vyvinuté SLN byly schopny chránit a být vhodné pro dodávání OLP.
klíčová slova:Olea europaea, oleuropein,pevné lipidové nanočástice, extrakt z olivových listů,antioxidační aktivitu, antimikrobiální aktivita
1. Úvod
Čeleď Dicotyledons Oleaceae se skládá z asi 30 rodů opadavých rostlin včetně olivovníků a je příbuzná asi 600 druhům. Členové Oleaceae jsou dobře pěstováni v topických a sub-mírných podmínkách Asie?. Olivový olej (Olea europaea) získaný z různých částí, jako je ovoce, listy atd., má při pravidelné konzumaci mnoho zdravotních výhod. Tradičně se používal jako lidový lék k léčbě různých typů horeček a dalších tělesných potíží2).
Extrakt z olivových listů vykazoval několik terapeutických aktivit, jako je antihypertenzní, hypoglykemická, antimikrobiální, hypourikemická atd. Antivirová aktivita proti infekci HIV-I byla prokázána a hlášena. Kromě toho oleuropein (typický sekoiridoid) získaný z olivovníku vykazoval hypocholesterolemickou a hypoglykemickou aktivitu se silným antioxidačním a protizánětlivým účinkem. Produkt rozkladu oleuropeinu, tzn. hydroxytyrosol také vykazoval všechny výše uvedené aktivity spolu s potenciálním účinkem pohlcování volných radikálů5.bioflavonoidySpojení všech těchto terapeutických činností týkajících se olivovníku z něj činí důležitý přispěvatel v oblasti zdraví 4).
V tomto projektu se autoři zabývají antimikrobiálními a antioxidačními vlastnostmi extraktu z listů olivovníku. Antimikrobiální aktivita olivového extraktu je způsobena kyselinou p-hydroxybenzoovou, cyklotrisiloxan hexamethyl, cyklopentasiloxan oktamethyl a cyklopentasiloxanem desmethylem, vanilovou, kávovou, protokatechovou, syringovou, galovou kyselinou atd. Další složky jako oleuropein, kvercetin, tyrosol a kyselina oleanolová je také zodpovědná za antimikrobiální aktivitu. Antimikrobiální potenciál všech těchto látek byl již dříve popsán několika výzkumníky proti bakteriím, kvasinkám, plísním, virům, retrovirům a dalším parazitům2).
Cistanche může proti stárnutí
Dietní příjem přírodních zdrojů antioxidantů, jako je ovoce a listy, získal velkou pozornost a má pozitivní vliv na zdraví lidí. Výsledky mnoha epidemiologických studií prokázaly, že příjem potravin bohatých na polyfenoly snižuje výskyt onemocnění koronárních tepen (ICHS). CHD jako MI (infarkt myokardu), IS (ischemická mrtvice) atd. jsou spojeny s aterosklerózou." Nedávné studie prokázaly, že oxidační poškození je důležitým etiologickým faktorem pro progresi aterosklerózy, zejména podle teorie oxidačního stresu, Předpokládá se, že oxidativní modifikace lipoproteinu s nízkou hustotou (LDL) hraje klíčovou roli v rozvoji aterosklerózy. Inhibice takového procesu je proto považována za důležitý terapeutický přístup. Různé důležité složky jako Oleuropein (hydroxytyrosol, tyrosol) , verbascosid (také známý jako ac-toeside nebo Kalinin), ligstrosid, apigenin-7-glukosid, di-kosmetický-7-glukosid, luteolin, katechin atd. byly získány pro listy olivovníku a vykazující antioxidant Hydroxytyrosol je hlavní oleuropein z olivových listů, který má patentované antioxidační vlastnosti).
Kromě této aktivity vykazoval extrakt z olivových listů další farmakologické aktivity, jako je protizánětlivý,12),protirakovinný8.14), antivirový5),hypoglykemický4), hypolipidemický17, proti agregaci krevních destiček. Agentura jako EFSA (Euro-pean Food Safety Agency) a EMA (Evropská léková agentura) posoudily terapeutickou použitelnost extraktantů z olivových listů. Kromě hlavní použitelnosti trpí extrakční produkty z olivových listů problémy s nestabilitou v atmosférických podmínkách (teplota, světlo a kyslík). stejně jako biologické podmínky, a proto vykazovaly špatnou biologickou aktivitu20,21).koupit cistanchePro zlepšení stability byly vyvinuty různé formulace na bázi nanočástic, aby se prozkoumala různá aktivita extraktu z olivových listů. Mezi tyto formulace patří nanoemulze (W/O i více typů)2), inkluzní komplexy, produkty sušené rozprašováním?4), elektrostatická extruze25, bipolární komplexy), nano-lipozomy20, nanoemulze, mikro -zapouzdření, nanočástice PLA2 a NLC0. S těmito formulacemi jsou spojeny různé problémy, jako je nízká hodnota výtěžku, časově náročný postup, snížená účinnost zachycení, kontaminace zbytkovým rozpouštědlem a velká velikost částic. Aby se tyto nevýhody regulovaly, vznikly lipidové nanočástice. Lipidové nanočástice es-speciálně pevné lipidové nanočástice (SLN) nabízejí mnoho výhod, jako je lepší účinnost zachycení, řízená velikost částic, biokompatibilita, biologická odbouratelnost a snadnost přípravy. Kromě toho mají lipidy používané pro přípravu SLN určitý synergický účinek na protizánětlivou aktivitu spolu se zachyceným léčivem. Dosud nebyla vyvinuta žádná formulace založená na pevných lipidových nanočásticích (SLN) pro zkoumání jejich antimikrobiálních a antioxidačních vlastností a také pro zlepšení stability produktu extraktu z olivových listů.
Výzkumná práce byla proto zaměřena na "vývoj pevných lipidových nanočástic (SLN) pro extraktový prášek (OLP) z olivových listů (Olea europaea L.). Aktivní složky byly odděleny extrakcí olivových listů pomocí ethanolu. Rozpouštědlem bylo odstraněn sušením, aby se získal produkt ve formě suchého prášku. Síla extraktu z olivových listů (OLP) byla začleněna do SLN (OLP-SLN) a optimalizace byla provedena pomocí softwaru pro expertní návrh (Model 8.0.7.1) pomocí Box-Behnken design. Tři faktory, jako je poměr léčiva (OLP) k lipidu, koncentrace povrchově aktivní látky (procenta, Tween 80) a rychlost homogenizace (ot./min) byly brány jako nezávislé parametry a faktory jako velikost částic, účinnost zachycení a index polydisperzity (PDI) byly vybrány jako závislé parametry. Optimalizovaná formulace byla hodnocena pro morfologickou studii, studii DSC, studii uvolňování in vitro a studii stability. Nakonec byly hodnoceny antimikrobiální a antioxidační aktivity, aby se ověřil antimikrobiální a antioxidační potenciál rozvinutého S Formulace LN.
2. Materiály a metody
Olivové listy byly získány z místní zahrady. Čerstvé listy byly vysušeny a rozdrceny na prášek pro extrakci. Různé lipidy jako vzácný ATO5, kompritol 888 ATO byly získány z Gattefosse (Německo). Glycerylmonostearát (GMS), kyselina palmitová, kyselina stearová tween 80 atd. byly zakoupeny od centrálního lékárenského domu ltd (New Delhi, Indie). ) byly získány od společnosti Merck (Darmstadt, Německo). Kyselina askorbová, dihydrogenfosforečnan draselný, octan amonný, methanol, hydroxid sodný, poloxamer 188, ethanol, živný agar a dialyzační vak (M.Wt cut off 12,000 kD) byly získány od Sigma Aldrich (St Louis, USA). Všechny ostatní chemikálie použité pro studii jsou analytické čistoty.
2.1 Extrakce fenolických složek
Čerstvé listy oliv byly vysušeny a rozdrceny na prášek pro extrakci. Aktivní složky byly extrahovány z energie pomocí rozpouštědla (ethanol:voda, 4:1 v/v). Do extrakční baňky bylo odebráno dostatečné množství prášku (250 mg) a bylo přidáno rozpouštědlo (1000 ml) ethanol:voda, 4:1 obj./) a směs byla nepřetržitě míchána po dobu 24 hodin. Po tomto kroku byla fyzikální směs zfiltrována a rozpouštědlo bylo odpařeno do sucha při 40 stupních, čímž byl získán prášek).
2.2 Příprava a optimalizace SLN: Předběžná
screeningová studie a předoptimalizace proměnných formulace Pro výběr vhodného lipidu, surfaktantu, rychlosti a doby homogenizace, doby sonikace atd. byly provedeny předběžné studie. Výběr vhodného lipidu závisí na rozpustnosti léčiva v lipidu a výběr povrchově aktivní látky závisí na rozpustnosti lipidu v povrchově aktivní látce.
Příslušný lipid (100 mg) byl roztaven nad svými teplotami tání (přibližně o 10 stupňů výše) v lahvičce, poté následovalo začlenění léčiva (OLP) za kontinuálního třepání. Vzhled světle světlé barvy označuje koncový bod. Podobné experimenty byly provedeny pro výběr vhodných povrchově aktivních látek.
2.3 Experimentální design
V této studii byl pro účely optimalizace použit BBD expertního návrhového softwaru se třemi faktory a třemi úrovněmi. Ve studii byly použity tři faktory, jako je poměr léčiva k lipidu (A,1:3-1:6), koncentrace povrchově aktivní látky (B, procento ,1.5-4,5 procenta) a rychlost homogenizace (C ,rpm,3000-6000 rpm, pro dvě h) byly brány jako nezávislé parametry a velikost par-title (nm, Y1), účinnost zachycení (procenta ,Y2) a PDI (Y3) byly brány jako závislé parametry. Cílem aplikace tohoto návrhu bylo optimalizovat výše uvedené tři nezávislé parametry a dosáhnout optimální velikosti částic, maximální účinnosti zachycení a nejnižší možné PDI. Data byla přizpůsobena v expertním návrhovém softwaru pro BBD15). Celkem bylo vytvořeno 17 šarží s 5 šaržemi s podobným složením (pět středových bodů) (tabulka 1). Polynomiální rovnice druhého řádu byla použita k prokázání vlivu různých nezávislých parametrů na velikost částic, účinnost zachycení a také PDI.
2.4 Vývoj SLN
SLN naplněné OLP byly připraveny horkou homogenizací následovanou metodou sonikace. Složení různých šarží SLN s obsahem OLP je uvedeno v tabulce 1. Nejprve byl lipid (kompritol 888 ATO) roztaven kolem 10 stupňů jeho bodu tání a bylo přidáno požadované množství OLP (1:{{6} }:6 poměr léčiva k lipidu). Mezitím bylo požadované množství (1,5 procenta) povrchově aktivní látky rozpuštěno v deionizované vodě a teplota této fáze byla udržována stejná jako teplota lipidové fáze. Vodná fáze byla poté postupně začleňována do lipidové fáze a podrobena horké homogenizaci prstencem s proměnlivou rychlostí (ot./min., 3000-6000 ot./min., dvě hodiny), aby se získal průběh disperze SLN. Získaná emulze se nechala působit
ochladit a poté sonikovat po dobu 10 minut při 100% amplitudě pomocí sonikátoru (typ sondy, Vibra-Cell'VCX 130; Sonics, CT, USA), aby se získala konečná disperze SLN. Disperze byla shromážděna ve skleněné lahvičce a uložena v chladničce pro další studium. Podobně byly vyvinuty slepé SLN bez API (léčiva).
2.5 Charakterizace OLP-SLN
2.5.1 Hodnocení velikosti částic, PDI a zeta potenciálu
Pro měření průměrné velikosti částic a indexu polydisperzity (PDI) různých šarží byla použita fotonová korelační spektroskopie (PCS) využívající zeta sizer (Malvern, nano ZS 90, Malvern Instruments, UK). Teplota byla udržována na 25 stupních a úhel rozptylu byl nastaven na 90 stupňů.cistanchPro ředění původní disperze OLP-SLNs byla použita deionizovaná voda. Zeta potenciál, který indikuje povrchový náboj, byl stanoven pomocí stejného přístroje s intenzitou elektrického pole kolem 20 V/cm27
2.5.2 Morfologická studie
Transmisní elektronový mikroskop (TEM, Fei elektronová optika, Japonsko) využívající uhlík potažený měděnou mřížkou byl použit ke zkoumání morfologie a tvaru připravených OLP nabitých SLN (optimalizovaná šarže F9). Pro obarvení vzorku OLP-SLN se provedlo negativní barvení barvivem fosfowolframovou kyselinou (2 procenta hmotn./hmotn., trvání 20-30 sekund) s následným sušením při teplotě místnosti. Nakonec byl vzorek detekován pomocí TEM.
2.5.3 Hodnocení účinnosti zachycení
Účinnost zachycení (EE) byla stanovena zkoumáním nezachyceného množství léčiva přítomného v disperzi OLP-SLN. K tomuto účelu byla použita technika odstřeďování. Odměřené množství (10 ml) OLP-SLN bylo odebráno do centrifugační zkumavky a ponecháno sedimentovat pomocí chladicí centrifugy (Remi, Indie) při 12 000 ot./min. po dobu 15 minut. Přítomnost nezachyceného léčiva byla analyzována UV-viditelným spektrofotometrem (Model 1800, Shimadzu, Japonsko) při 230 nm. Procento zachycení léčiva bylo stanoveno podle následujícího vzorce (rovnice 1):
2.5.4 Studie diferenciální skenovací kalorimetrie (DSC).
Účelem této studie bylo vyhodnotit tepelné chování různých přípravků, viz čistý OLP, kompritol 888 ATO a optimalizovaný přípravek OLP-SLN (F9) pomocí diferenciální skenovací kalorimetrie (Mettler, Toledo, USA). Každý vzorek byl zabalen do hliníkové misky a skenován při teplotním rozsahu 20-350 stupňů (rychlost 10 stupňů/min) za použití prázdné uzavřené misky jako reference v inertní atmosféře (dusík). Byly získány a interpretovány křivky DSC . 2.5.5 Studie uvolňování léčiva (v procentech)
Studie uvolňování léčiva optimalizované šarže (F9) byla provedena Franzovou difúzní celou s použitím dialyzační membrány. Před aplikací dialyzační membrány byla vyvinuta ošetřením 0,35% w/v roztoku siřičitanu sodného při 80 stupních po dobu 1-2 min s následným okyselením HSO({{ 13}} 0,2 procenta, obj./obj.) a poté uloženy po dobu 12 hodin v destilované vodě. Fyziologický roztok fosfátového pufru (pH 7,4) byl naplněn do receptorového oddílu a disperze SLN (F9,1 ml) byla odebrána do donorového oddílu. Experiment byl proveden při 37±0,5 stupni za stálého míchání (50 ot./min.). Alikvoty (1 ml) byly odebírány z receptorového prostoru v předem stanovených časových intervalech a množství léčiva přítomného v každém vzorku bylo detekováno UV-viditelným spektrofotometrem při 230 nm. Vhodná kinetika uvolňování z optimalizovaných SLN byla detekována proložením údajů o uvolňování do nuly, nejprve Higuchiho modelu a Korsmeyer-Peppasova modelu, jak je uvedeno v tabulce 2, a byla stanovena hodnota R (korelační koeficient). Model s nejvyšší hodnotou R byl považován za optimalizovaný model8).
Tento článek je převzat z J. Oleo Sci. 70, (10) 1403-1416 (2021)
