Nanovlákna s kyselinou oleanovou zeslabily oxidační stres v keratinocytech vyvolaný částicemi
Sep 20, 2022
Další informace vám poskytne oscar.xiao@wecistanche.com
Abstraktní:Částice ve vzduchu (PM) jsou jedním z indikátorů znečištění ovzduší a jsou také hlavním faktorem způsobujícím oxidační stres v kůži. Kyselina oleanolová (OA), přírodní terpenoidní sloučenina, účinně inhibovala stárnutí kůže vyvolané PM; OA má však špatnou rozpustnost ve vodě a absorpci kůží, což omezuje její použití v lécích a kosmetice. Cílem této studie bylo připravit nanovlákna kyseliny oleanolové (OAnf) a vyhodnotit účinky OA a OAnf v keratinocytech ošetřených PM. Výsledky ukázaly, že (OA rozpuštěný v rozpuštěném v dimethylsulfoxidu (DMSO) zeslabil PM-indukovanou nadprodukci reaktivních kyslíkatých druhů, stresem aktivovanou proteinkinázu/Jun-amino-terminální kinázu (SAPK/JNK) aktivaci a projevy zánětu a kůže -proteiny související se stárnutím. Kromě toho proces nanovláken OA účinně zlepšil rozpustnost OA ve vodě o více než 99,000-změnou jeho fyzikálně-chemických vlastností, včetně zvětšení plochy povrchu, zmenšení velikosti částic, amorfní transformace a tvorba vodíkových vazeb s pomocnými látkami. Schopnost OAnf pronikat kůží byla konzistentně více než 10-krát vyšší než u OA. Navíc, když se OAnf rozpustil v PBS, vykazoval vynikající antioxidační, protizánětlivé účinky a účinky proti stárnutí pokožky v PM Naše zjištění naznačují, že OAnf by mohla být topická antioxidační formulace ke zmírnění kožních problémů způsobených PM.
Klíčová slova:částice; kyselina oleanolová; nalnovlákno; antioxidant; protizánětlivé; proti stárnutí
1. Úvod
Znečištění ovzduší je nyní problémem veřejného zdraví na celém světě. S rozvojem technologií se různé škodlivé látky, včetně plynů, chemických látek, biologických škodlivin a částic, hromadí v atmosféře a vážně ovlivňují životy a zdraví lidí. Částice (PM), indikátor látek znečišťujících ovzduší, jsou kombinací různých organických sloučenin, biologicky odvozených materiálů a částic uhlíku[1]. PM se dostávají do plic vdechováním a vstupují do krevního oběhu a způsobují systémová zdravotní rizika, jako jsou záněty orgánů a kardiovaskulární a respirační onemocnění [2,3]. Kromě toho mohou PM procházet kožní bariérou a hromadit se ve vlasových folikulech a při opakovaném kontaktu dokonce pronikat do dermis; proto byla nadměrná expozice kůže PM spojena s vnějším stárnutím kůže, změnami pigmentace, atopickou dermatitidou, akné a psoriázou [2,4]. Delší kontakt s PM indukuje nadprodukci reaktivních forem kyslíku (ROS) v keratinocytech, což spouští několik signálních drah včetně dráhy apoptózy, drah mitogenem aktivované proteinkinázy (MAPK) a zánětu. U keratinocytů vystavených působení PM. Navíc PM také aktivuje matrixové metaloproteinázy (MMP) a vede ke ztrátě elasticity kůže a stárnutí [5].
Přírodní produkty se již dlouho používají jako účinné kosmetické přísady. Kyselina oleanolová (OA, 3 -hydroxyolean-12-en{3}}oicacid), triterpenoidní sloučenina s pěti kruhy, je široce přítomna v rostlinách, ovoci a zelenině [6]. OA je dobře známá pro své jaterní ochranné účinky, jako je snížení chemicky vyvolaného akutního poškození jater a fibrózy/cirhózy u chronických jaterních onemocnění [6,7]. Kromě toho předchozí studie odhalily, že OA má antioxidační, protirakovinné, protizánětlivé, antidiabetické a antimikrobiální účinky [8]Kim et al. odhalili, že OA by mohla snížit expresi prozánětlivých cytokinů (TNF-a,IL-6) a proteinu stárnutí kůže (MP-1) v keratinocytech ošetřených PM [9]. Fyzikálně-chemické vlastnosti OA však znesnadňují rozpouštění ve vodě, což omezuje jeho použití v lécích, potravinách a kosmetice.
Návrhy formulací dodávání léčiv, jako jsou nanonosiče na bázi polymerů, li. posomy a nanovlákna se obvykle používají ke zlepšení fyzikálně-chemických vlastností aktivních složek. Zapouzdření aktivních složek s pomocnými látkami v těchto farmaceutických formulacích by mohlo zvýšit jejich rozpustnost ve vodě a absorpci pokožkou a snížit potenciální toxicitu a podráždění pokožky. Mezi nimi jsou nanovlákna nově vznikající nanorozměrná formulace s velkým povrchem, nízkou hustotou a velkým objemem pórů a jsou již široce používána v biomedicíně, která může snížit objem perorálních léků, zvýšit stabilitu aktivních složek, kontrolovat uvolnit, zlepšit biologickou dostupnost a vytvořit umělé tkáně [10]. Elektrostatické zvlákňování je běžná technologie používaná k výrobě nanovláken a je vysoce kompatibilní s hromadnou výrobou [1]. Proto příprava nanovláken pomocí procesu elektrostatického zvlákňování může současně zlepšit biologickou dostupnost. Účinnost a účinnost výroby účinné látky se špatnou rozpustností ve vodě. Polyvinylpyrrolidon (PVPK90) a 2-hydroxypropyl- -cyklodextrin (HPBCD) jsou sloučeniny schválené FDA pro solubilizaci a dodávání hydrofobních aktivních farmaceutických složek u lidí.cistanche cholesterolPředchozí studie ukázaly, že nanovlákna připravená s HPBCD a PVPK90 významně zlepšila rozpustnost ve vodě a pronikání resveratrolu kůží [12] a plai oleje [13]. Cílem této studie tedy bylo použít PVPK90 a HPBCD jako nosiče pro přípravu nanovláken kyseliny oleanolové (OAnf) a vyhodnotit účinky OA a OAnf v keratinocytech ošetřených PM.
Cistanche může proti stárnutí
Cílem této studie bylo vyhodnotit biologický účinek OA rozpuštěného v DMSO na poškození keratinocytů vyvolané PM. Abychom překonali špatnou rozpustnost OA ve vodě, použili jsme PVPK90 a HPBCD jako nosiče pro přípravu nanovláken oleanolové kyseliny (OAnf) procesem elektrostatického zvlákňování a poté jsme určili změny fyzikálně-chemických vlastností mezi surovým OA a OAnf, abychom objasnili zlepšení rozpustnosti ve vodě a pronikání kůží. Pro srovnání biologického účinku po nanovlákenném procesu OA byl použit model poškození keratinocytů indukovaný PM k hodnocení antioxidační, protizánětlivé a anti-agingové aktivity OAnf a OA.
2. Materiály a metody
2.1.Materiály
Hydrát kyseliny oleanolové (OA) byl zakoupen od Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Tokyo, Japonsko). Polyvinylpyrrolidon (Luviskol" K90 Powder, PVP) byl zakoupen od Wei Ming Pharmaceutical Mfg. Co., Ltd. Taipei, Taiwan. Hydroxypropyl-beta-cyklodextrin (HPBCD) byl získán od Zibo Qianhui (Zibo, Čína). Methanol a dimethyl sulfoxid (DMSO) byly zakoupeny od Aencore Chemical (Surrey Hills, Austrálie).Všechny chemikálie nebo činidla pro buněčné kultury byly biologické kvality a ostatní chemikálie fyzikálně-chemického stanovení byly kvality pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (HPLC).
2.2. Test životaschopnosti buněk
Stanovení buněčné životaschopnosti aktivní složky je běžnou metodou používanou pro výběr vhodných koncentračních rozsahů pro aktivní složky pro hodnocení jejich biologické aktivity. Keratinocyty HaCaT byly zakoupeny od Istituto Zooprofilattico Sperimen-tale della Lombardia edell'Emilia Romagna (Brescia, Itálie). Buňky HaCaT byly kultivovány v DMEM (Himedia Laboratories, Mumbai, Indie) obsahujícím 10 procent fetálního bovinního séra (Hazelton Product, Denver, PA, USA) s 1 procentem penicilin-streptomycin (Biological Indus-tries, Connecticut, NE , USA) a HaCaT buňky byly inkubovány v inkubátoru (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) za podmínek nastavených na 37 stupňů s 5 procenty COz. Pro přípravu testovaných vzorků byly OA a OAnf rozpuštěny v DMSO a PBS, v daném pořadí, a poté byl každý vzorek zředěn v DMEM bez fetálního bovinního séra pro stanovení viability buněk. Buňky HaCaT byly nasazeny do 96-jamkových destiček v hustotě 1 × 104 buněk/100 μl/jamka po dobu 24 hodin. Kultivační médium bylo poté odstraněno a buňky byly ošetřeny různými koncentracemi OA a OAnf v rozmezí od 5 do 80 uM v DMEM bez séra po dobu 24 hodin. V době testu bylo ošetřovací médium odstraněno a do každé jamky bylo přidáno 150 ul 0,5 mg/ml roztoku MTT. Po 3 hodinách inkubace byl roztok MTT odstraněn a purpurové krystaly formazanu z každé jamky byly rozpuštěny ve 100 ul DMSO. Absorbance při 550 nm každé jamky byla poté měřena pomocí mikrodestičkového spektrofotometru (BioTek uQuant, Winoski, VT, USA). Životaschopnost buněk byla vypočtena podle následujícího vzorce:
2.3. Stanovení obsahu reaktivních druhů kyslíku (ROS).
PM (Standard Reference Material, SRMB1649b) byly zakoupeny od National Institute of Standards and Technology. Tento produkt byl shromážděn v letech 1976 a 197 ve Washingtonu, DC Made. Celkem 10 mg/ml PM bylo suspendováno v PBS a poté před použitím sonikováno po dobu 10 minut. Celkem 1 × 10 plus keratinocytů HaCaT bylo kultivováno v 96-jamkových destičkách po dobu 24 hodin při 37 stupních a 5 procentech CO2. Buňky byly ošetřeny různými koncentracemi OA v DMSO, OA v PBS a OAnf v PBS po dobu 24 hodin, v daném pořadí. Poté byly inkubovány s 20 uM roztokem dichlordihydrofluorescein diacetátu (DCFH-DA; Sigma, Tokio, Japonsko) po dobu 30 minut. Dále bylo do každé jamky přidáno 50 ug/cm² PM a inkubováno po dobu 1 h. Poté byly buňky promyty dvakrát s PBS a intenzita fluorescence každého vzorku byla analyzována pomocí čtečky fluorescenčních destiček (excitace: 485 nm; emise: 528 nm) (BioTek, Winooski, VI, USA). Pro výpočet procenta inhibice byla použita následující rovnice. Výroba ROS:
2.4. Analýza Western Blot
Celkem 4 x 105 HaCaT keratinocytů bylo kultivováno v 6-jamkových destičkách po dobu 24 hodin. Buňky byly poté ošetřeny OA nebo OAnf v médiu bez séra po dobu 24 hodin, po čemž následovalo přidání PM. Po různých časových bodech byly buňky lyžovány pufrem RIPAlysis (Merck Millipore, Burlington, MA, USA), poté centrifugovány při 12, 000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut. Pro stanovení koncentrace proteinu byla použita souprava pro stanovení proteinu BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Poté byly proteiny odděleny elektroforézou na dodecylsulfát-polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) a poté blotovány na membrány polyvinylidendifluoridu (PVDF) (Merck Millipore). Membrány byly blokovány po dobu 1 hodiny a promyty fyziologickým roztokem pufrovaným Tris ( TBS) s 1 procentem Tween-20. Membrány byly přes noc inkubovány s primárními protilátkami při 4 stupních. Primární protilátky použité v této studii zahrnovaly cyklooxygenázu-2 (COX-2), matrix metaloproteinázu-9 (MMP-9), tkáňový inhibitor metaloproteinázy-1 (TIMP-1), stresem aktivovaná proteinkináza/Jun-amino-terminální kináza (SAPK/JNK) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), GAPDH (Santa Cruz Bi-otechnology, Dallas, TX, USA), matrix metaloproteináza-1 (MMP-1) (Proteintech Group,Rosemont, IL, USA), p380, extracelulárně regulované proteinkinázy (ERK) a nukleární faktor kappa-lehký řetězec- zesilovač aktivovaných B buněk (NF-kB) (Merck Millipore, Burlington, MA, USA). Dále byly přidány sekundární protilátky na 1 hodinu při teplotě místnosti a reagovaly se zesílenými chemiluminiscenčními činidly (ECL; Thermo Fisher Scientific). Protilátky proti GAPDH byly použity jako vnitřní kontroly. Exprese každého proteinu byla analyzována pomocí Touch Imager (e-BLOT; Shanghai, Čína) a exprese byla kvantifikována pomocí ImageJ.
2.5. Příprava nanovláken kyseliny oleanolové (OAnf)
OAnfs byly elektrostatické s různými poměry OA:PVP:HBPCD (1:8:5, 1:8:10 a 1:8:20). Elektrostaticky zvlákňovaný roztok byl připraven následovně: 25 mg OA bylo rozpuštěno v 5 ml methanolu a byl přidán HPBCD a míchán magnetickým míchadlem za získání čirého roztoku; poté byl okamžitě přidán PVPK90 a směs byla míchána po dobu 1 hodiny.vedlejší účinky cistanche deserticolaNanovlákna byla tkaná pomocí FES-COS Electro-spinning zařízení (Falco Tech Enterprise Co., Taipei, Taiwan) za následujících podmínek: 10 ml injekční stříkačka s jehlou o vnitřním průměru 0. 22 mm bylo použito pro elektrostatické zvlákňování; průtoková rychlost byla upravena na 0,2 ml/h; použité napětí bylo nastaveno na 12 kV; vzdálenost hrot-kolektor byla 10 cm. Po procesu elektrostatického zvlákňování byla nanovlákna shromážděna pomocí hliníkové fólie. Nově syntetizovaná nanovlákna byla umístěna do uzavřeného plastového sáčku a uložena v nádobě odolné proti vlhkosti.
2.6. Vysoce výkonná kapalinová chromatografie (HPLC) Analýza kyseliny oleanolové
Analytický systém HPLC (LaChrom Elite L{{0}}, Hitachi, Tokio, Japonsko) se skládal z čerpadla L-2130, automatického vzorkovače L-2200 a L{{3 }} ultrafialový-viditelný (UV-vis) detektor. Analytická kolona byla kolona Mightysil RP-18 GP (250×4,6 mm id., 5 um). Mobilní fáze byla složena z methanolu a 0,1% roztoku ledové kyseliny octové v pevném poměru (95:5; w/v). Průtok mobilní fáze byl 1 ml/min a detekční vlnová délka UV detektoru byla nastavena na 215 nm. Absorpční pík kyseliny oleanolové se objevil po 7,5 minutě. Kalibrační křivka kyseliny oleanolové vykazovala dobrou lineární （r =0.999） v rozsahu 0.01-100 ug/mL.
2.7.Měření morfologie, průměru vlákna a velikosti částic OAnf
Různé vzorky nanovláken byly pokryty platinou pomocí iontového povlaku (E{{0}}, HITACH, Tokio, Japonsko); podmínka byla nastavena na 10 mA o 120 s později. Morfologie a tvar každého vzorku byly pozorovány rastrovacím elektronovým mikroskopem (Hitachi S4700 Hitachi, Tokio, Japonsko). Průměr každého vzorku byl vypočten pomocí softwaru image j. K měření velikosti částic OAnf byl použit analyzátor Zetasizer 3000HS (Malvern, Worcestershire, UK). Velikost částic OA a OAnf byla měřena při koncentraci 1 mg/ml a 0,1 mg/ml, v daném pořadí.cistanche dávkování redditKromě toho jsme také pozorovali jednotnost morfologie OAnf po rozpuštění ve vodě pomocí transmisního elektronového mikroskopu (TEM,JEM{{0}}EXII instrument,JEOL Co., Tokio, Japan). Testovaný vzorek byl upraven na 1 ug/ml OA v deionizované vodě a poté byl nakapán do měděné síťky a poté byla okamžitě nakapána 0,5% (w/v) kyselina fosfowolframová. Po vysušení byl každý vzorek umístěn na TEM pro pozorování.
2.8. Účinnost zavádění léčiva a enkapsulace OAnf
Je velmi důležité určit obsah léčiva a účinnost enkapsulace dodávacího systému pro hodnocení výkonnosti farmaceutického procesu. Náplň léčiva byla vypočtena jako procento stanoveného obsahu a teoretického obsahu OA obsaženého v nanovláknech OA. Pro stanovení obsahu léčiva bylo 100 μl každého vzorku přidáno do 900 μl methanolu a koncentrace OA byla, kde CoA je koncentrace OA z OAnf, WoA je teoretické množství přidaného OA, VoAnf je objem roztoku OAnf.
Účinnost zapouzdření ukazuje, zda nanovlákna úspěšně zapouzdřovala aktivní sloučeniny. Vzorky OAnf byly rozpuštěny v deionizované vodě a přidány do odstředivých filtračních zařízení (Microcon YM-10, Millipore, Billerica, MA, USA) a poté centrifugovány při 12,00 otáčkách za minutu po dobu 10 minut. chlazená odstředivka (Centrifuge 5430R, Eppendorf, Hamburg, Německo). Zapouzdřená část byla zadržena v horní trubici a nezapouzdřená část byla shromážděna ze spodní trubice kvůli rozdílu v molekulové hmotnosti. Množství nezapouzdřeného OA bylo detekováno výše uvedenou metodou HPLC. Pro výpočet účinnosti zapouzdření byla použita následující rovnice:
kde AoA je teoretické množství OA (získaného z podmínek krmení) začleněného do nanovláken a Aunentrapped OA je množství nezapouzdřeného OA.
2.9. Rozpustnost OAnf ve vodě
Surový OA (1 mg) a různé poměrové formulace OAnf (obsahující ekvivalent 1 mg kyseliny oleanolové) byly rozpuštěny v 1 ml deionizované vody a poté sonikovány pod ultrazvukem (Branson 5510, Emerson Electric, St. Louis, MO, USA) 20 min. Každý vzorek byl filtrován přes 0,45 um membránu (Pall Corporation, Washington, NY, USA) a zředěn 10-krát. Zředěné roztoky byly analyzovány pomocí HPLC a standardní křivka byla použita ke stanovení množství kyseliny oleanolové pro porovnání jejich rozpustnosti ve vodě.
2.10. Stanovení krystalické přeměny na amorfní
Rentgenová difraktometrie (Siemens D500, Karlsruhe, Německo) byla použita k analýze krystalické formy OA, pomocných látek a OAnf. Analýza byla provedena pomocí záření Cu-Ka filtrovaného niklem, za použití napětí 40 kV a proudu 25 mA. Rychlost skenování byla 1 stupeň/min a rozsah snímaných úhlů byl od 5 stupňů do 50 stupňů. 2.11. Intermolekulární interakce mezi OA a pomocnými látkami
K potvrzení intermolekulární interakce mezi aktivními složkami a pomocnými látkami se obvykle používá infračervená spektroskopie s Fourierovou transformací (FTIR) a 1H nukleární magnetická rezonance (1H NMR). Kyselina oleanolová, PVP, HPBCD a různé poměrové formulace OAnf byly smíchány s bromidem draselným (KBr) v objemovém poměru 1:9 pomocí hmoždíře a slisovány do tablet. Každý vzorek byl poté analyzován spektrofotometrem FTIR (spektrofotometr Perkin-Elmer 200, Perkin-Elmer, Norwalk, CT USA). Rozsah skenování byl 400-4000 cm-4. každý vzorek byl rozpuštěn v 0,8 ml 99,8% DMSO-dg (Merck, St.Louis, MO, USA) a analyzován spektrometrem JEOL Alpha 400 (Nihon Denshi Co., Tokyo, Japonsko).
2.12. Ex Vivo kůží pronikání kyseliny oleanolové a jejího nanovlákna
Tento experiment byl proveden podle standardního protokolu směrnic European Cosmetic Toiletry and Perfumery Association (COLIPA). Systém Franzových difuzních cel lze rozdělit na skleněné nádoby horní dárcovské komory a spodní receptorové komory. Celkem 1,5 ml pufrového roztoku obsahujícího 0,14MNaCl,2mMK-HP04, 0,4mM KH2PO4 (pH7,4) bylo umístěno do receptorové komory a mícháno magnetickou tyčinkou při 600 ot./min. pokus. Čerstvá kůže z boku z prasete byla získána od místního řezníka na trhu a během experimentu byla zchlazena. Každý vzorek kůže byl rozřezán na kousky o rozměrech 2 cm x 2 cm a umístěn mezi dvě komůrky tak, že stratum corneum směřovalo nahoru. Franzova difúzní cela byla udržována na 32 stupních s cirkulující vodní lázní.výhody extraktu z cistanchePoté bylo do donorové komory přidáno 200 μl 1 mg/ml OA nebo OAnf na 1, 2 nebo 4 hodiny. Poté byla prasečí kůže odstraněna z Franzovy difúzní cely a stratum corneum bylo získáno 15krát stripováním pásky. Každý zbytkový vzorek kůže byl zahříván na 95 stupňů pomocí tepelné podložky a epidermis a dermis byly odděleny pomocí skalpelu. Každý vzorek byl ponořen do methanolu a sonikován po dobu 1 hodiny pro extrakci OA a obsah kyseliny oleanolové v každém vzorku byl stanoven metodou HPLC. 2.13. Statistická analýza
Všechna data byla zobrazena jako průměr ± standardní odchylka (SD). Statistická významnost mezi různými skupinami byla analyzována analýzou rozptylu (ANOVA) s Tukeyho post hoc testem.<0.05 indicated="" statistical="" significance.="">
3.1. Kyselina oleanolová může potlačit zánět, stárnutí a signální dráhy ROS/MAPK v poškození keratinocytů vyvolaných PM
Pro nalezení správného koncentračního rozmezí pro hodnocení biologické aktivity byla stanovena cytotoxicita OA rozpuštěného v DMSO v lidských keratinocytových buňkách HaCaT pomocí MTT testu. Jak je znázorněno na obrázku 1A, 40 a 80 uM OA bylo spojeno s 32 až 16 procenty životaschopnosti buněk. OA při méně než 20 μM měla stále míru přežití buněk přes 85 procent. Tyto výsledky ukázaly, že OA v koncentraci 5-20 μM nemá žádné cytotoxické účinky na lidské keratinocyty HaCaT (obrázek 1A). V souladu s tím byl OA studován v koncentraci 5-20 uM, aby se prozkoumala jeho antioxidační a antioxidační aktivita při poškození keratinocytů vyvolaném PM. Nedávno mnoho studií prokázalo, že PM jsou běžnou látkou znečišťující ovzduší, která způsobuje nadprodukci ROS a následné poškození kožního systému prostřednictvím řady oxidativního stresu, včetně peroxidace lipidů, karbonylace proteinů a mutace DNA [14-16]Jak je uvedeno na Obrázek 1B, léčba PM významně zvýšila produkci ROS ve srovnání s neošetřenou skupinou (str<0.05).in contrast,="" pretreatment="" with="" oa="" effectively="" decreased="" pm-induced="" ros="" overproduction="" in="" a="" dose-dependent="" manner=""><0.05).there-fore, these="" results="" suggested="" that="" oa="" possessed="" antioxidant="" activity="" to="" prevent="" pm-induced="" oxidative="" stress="" by="" reducing="" the="" ros="" overproduction.="" in="" addition,="" ros="" overproduction="" after="" pm="" exposure="" can="" activate="" the="" phosphorylation="" of="" mapks="" proteins,="" including="" p-erk,="" p-p38,="" and="" p-jnk,="" triggering="" the="" protein="" expressions="" of="" inflammation="" and="" aging[17,18]the="" present="" study="" also="" found="" that="" pm="" treatment="" can="" increase="" the="" expression="" of="" inflam-matory="" proteins="" (cox-2="" and="" nf-kb),skin="" aging-related="" proteins="" (mp-1,mmp-9="" and="" timp-1),and="" phosphorylation="" of="" erk,jnk,="" and="" p38=""><0.05). our="" present="" results="" also="" demonstrated="" that="" oa="" at="" 10="" and="" 20="" um="" significantly="" inhibited="" the="" protein="" expression="" of="" nf-kb="" and="" cox-2="" when="" compared="" with="" the="" pm="" treatment="" group="" (p=""><0.05)(figure 1c)furthermore,="" oa="" pretreatment="" also="" effectively="" reversed="" pm-induced="" alteration="" on="" mmp-1="" and="" timp-1="" expression=""><0.05) but="" had="" no="" effect="" on="" mmp-9(figure="" 1d).="" we="" further="" de-termined="" the="" effects="" of="" oa="" treatment="" on="" phosphorylation="" of="" mapks="" during="" pm="" exposure,="" and="" our="" results="" indicated="" that="" oa="" could="" inhibit="" the="" phosphorylation="" of="" jnk=""><05), but="" had="" no="" effect="" on="" erk="" or="" p38="" (figure="" 1e).="" according="" to="" the="" above="" results,="" when="" dissolved="" in="" dmso,="" oa="" displayed="" good="" skin-protective="" activity="" and="" could="" ameliorate="" pm-induced="" ros="" overproduction,="" jnk="" activation,="" and="" inflammatory="" and="" skin-aging="" protein="" expression="" in="">
3.2. Nanovlákna kyseliny oleanolové zvýšila rozpustnost ve vodě a penetraci surové kyseliny oleanolové kůží zlepšením fyzikálně-chemických vlastností
3.2.1. Morfologie povrchu kyseliny oleanolové a jejích nanovláken
Při pozorování SEM představoval vzhled HPBCD sférický a porézní excipient a jeho velikost byla asi 20 až 50 μm (obrázek 2A). PVPK90 je excipient s nepravidelnými polygonálními částicemi a velikostí částic větší než 60 um (obrázek 2B) .Syrová kyselina oleanolová je nepravidelně kulatý zrnitý prášek o velikosti 3-60 um. Obrázek 2D-F ukazuje střední průměr vlákna různých hmotnostních poměrů kyselina oleanolová:HPBCD:PVPK90 byly 174,83±19,53nm, 219,23±18,93nm, respektive 403,17±32,99nm. Bylo zjištěno, že vyšší poměr HPBCD(1 :20) vedlo k OAnf s větším průměrem vlákna (tabulka 1).
3.2.2. Velikost částic a morfologie OAnf rekonstituovaného ve vodě
Aby bylo možné pozorovat tvar a velikost částic OAnf (OA:PVP:HPBCD, 1:8:20) rozpuštěného ve vodě, snímek OAnf pod transmisním elektronovým mikroskopem (TEM) ukázal že částice kyseliny oleanolové byly kulovité a rovnoměrně rozptýlené ve vodě (obrázek 3). Velikost částic byla také potvrzena laserovým analyzátorem velikosti částic (tabulka 2). Velikosti částic OA a OAnf byly 5079,50±384,87 nm, respektive 302,37±11,91 nm. Indexy polydisperzity (PDI) OA a OAnf byly 1,63±0,21 a 0,32±0,02, v daném pořadí. Tyto výsledky ukazují, že proces elektrostatického zvlákňování účinně redukoval velikost částic OA s rovnoměrnou distribucí částic a vedl ke zvětšení plochy povrchu.
3.2.3. Nanášení léčiv, účinnost enkapsulace a rozpustnost nanovláken kyseliny oleanolové ve vodě
Jak je ukázáno v tabulce 3, procenta plnění OA v různých poměrech pomocných látek byla 72,36 ± 10,45 procenta, 84,23 ± 3,62 procenta, respektive 98,19 ± 4,82 procenta. Výsledky ukázaly, že vyšší poměr HPBCD vykazoval lepší účinek lékové zátěže. Účinnost enkapsulace všech formulací byla vyšší než 95 procent, což naznačuje, že PVPK90 a HPBCD účinně enkapsulovaly OA. Kromě toho rozpustnost OAnf ve vodě s různými poměry pomocných látek byla 296,14 ± 57,75 ug/ml, 395,87 ± 32,77 ug/ml a 998,7 ± 58,32 ug/ml, v daném pořadí.cistanche džingischánTyto výsledky ukázaly, že zvýšení HPBCD ve formulaci dramaticky zvýšilo rozpustnost surového OA ve vodě. Naproti tomu rozpustnost surového OA ve vodě nemohla být stanovena, protože byla pod detekčním limitem (0,01 ug/ml) v metodě HPLC. Tento výsledek ukázal, že 1:8:20 OAnf měl více než 1000-násobné zlepšení rozpustnosti ve vodě ve srovnání se surovým OA. V následujících studiích byl tedy 18:20 OAnf použit ke stanovení biologické aktivity v modelu poškození keratinocytů indukovaného PM.
3.2.4.Krystalická změna kyseliny oleanolové a jejích nanovláken
Obrazce rentgenové difrakce (XRD) surového OA, pomocných látek a jeho nanovláken jsou znázorněny na obrázku 4. Surový OA vykazoval několik vysoce intenzivních charakteristických difrakčních píku při skenovacím úhlu 5 stupňů -20 stupně, což naznačuje, že surový OA byla krystalická sloučenina. Na druhou stranu, difrakční obrazce PVPK90 a HPBCD nemají žádné zjevné charakteristické difrakční píky. Navíc u surového OA při zpracování elektrostatickým zvlákňováním všechny charakteristické difrakční píky surového OA zcela zmizely, což naznačuje, že povaha surového OA OA byl transformován z krystalického na amorfní (obrázek 4). Podle těchto výsledků jsme mohli dojít k závěru, že surová kyselina oleanolová byla úspěšně zapouzdřena do HPBCD a zapouzdřena pomocí PVPK90 po procesu nanovláken.
3.2.5. Tvorba intermolekulární vodíkové vazby mezi kyselinou oleanovou a pomocnými látkami
Intermolekulární interakce surového OA a HPBCD s PVPK90 byla stanovena pomocí FTIR spektroskopie a výsledky jsou ukázány na obrázku 5. FTIR spektrum jasně ukázalo absorbanci několika chemických funkčních skupin surového OA, včetně absorpčního pásu při 3463 cm{{{ 3}} (——OH natahovací vibrace), 1696 cm-1 (——C=O natahovací vibrace) a 1462 cm-l (—CHz natahovací vibrace) (obrázek 5). Když byly OA, PVPK90 a HPBCD komplexovány za vzniku nanovláken, absorbance těchto chemických funkčních skupin se zjevně posunula k nižší absorpci. Tato zjištění naznačovala intermolekulární interakce vodíkových vazeb mezi OA a HPBCD s PVPK90. Kromě toho tato studie také používala 'H NMR k potvrzení intermolekulární interakce OA a pomocných látek. 1HNMR spektrum surového OA (obrázek 6C) ukázalo karboxylový signál při 812 ppm (H28), dvojitě vázané protony při 85,15 ppm (H12), hydroxyprotonový signál při 83,38 ppm (H3) a methylové protony (81 ppm). HNMR spektrum nanovláken OA ukázalo, že karboxylový signál OA zmizel a chemické posuny dvojitých vazeb, hydroxy a methyl protonů byly zjevně posunuty nahoru (obrázek 6). Tyto výsledky prokázaly tvorbu intermolekulárních vodíkových vazeb mezi OA a pomocnými látkami, což podpořilo úspěšnou enkapsulaci OA pomocí HPBCD a PVPK90.
3.2.6. In vitro penetrace surové kyseliny oleanolové a jejích nanovláken kůží
Biologická aktivita topické formulace většinou závisí na absorpci pokožkou. Průniky surového OA a jeho nanovláken kůží byly stanoveny v ex vivo prasečí kůži. Jak ukazuje obrázek 7, nižší obsah OA（<5 μg/cm2）was="" detected="" in="" the="" epidermis="" and="" dermis="" after="" 1,2,="" and="" 4h="" of="" topical="" administration,="" and="" these="" results="" also="" indicated="" that="" raw="" oa="" could="" not="" penetrate="" the="" skin="" in="" a="" time-dependent="" manner.="" the="" result="" showed="" that="" the="" skin="" absorption="" of="" raw="" oa="" was="" extremely="" poor.="" by="" contrast,="" the="" nanofiber="" formulation="" dramatically="" increased="" the="" content="" of="" oa="" in="" the="" epidermis="" and="" dermis="" with="" 19.63="" ug/cm2,31.56="" ug/cm2,and="" 45.27="" ug/cm2="" after="" 1,2,and="" 4h="" of="" topical="" administration,="" respectively.="" these="" results="" demonstrated="" that="" the="" oanf="" formulation="" significantly="" increased="" skin="" absorption="" when="" compared="" with="" the="" raw="" oa="" topical="" administration=""><>
3.3. Nanovlákna kyseliny oleanolové v necytotoxických koncentracích měla lepší anti-znečišťující aktivitu tím, že zlepšila antioxidační, protizánětlivou aktivitu a aktivitu proti stárnutí
Podobně jako OA rozpuštěný v DMSO, OAnf rozpuštěný v PBS při 40 uM a 80 uM snížil životaschopnost HaCaT buněk na 14,1 procenta a 5,6 procent, v daném pořadí (obrázek 8A). Proto bylo 10 uM OAnf hodnoceno na další antioxidační a protiznečišťující aktivitu, abychom pochopili, zda OA a jeho nanovlákna mají schopnost inhibovat nadměrnou produkci ROS způsobenou PM. Obrázek 8B ukazuje, že OAnf v 10 uM výrazně snížil nadprodukci ROS vyvolanou PM. Také jsme vypočítali rychlost inhibice produkce ROS, abychom porovnali antioxidační aktivitu mezi PBS-rozpuštěným OA a OAnf. Deset mikromolárních OA v PBS vedlo k 28,3% inhibici produkce ROS a OAnf dosáhl 97,6% inhibice (obrázek 8B). Tyto výsledky ukázaly, že OAnf má lepší antioxidační aktivitu než OA v PBS v PM-indukovaném oxidativním stresu v keratinocytech. Kromě toho jsme také porovnávali protizánětlivou aktivitu poškození keratinocytů indukovaného PM. Předběžné ošetření nezpracovaným OA v PBS nemohlo inhibovat PM-indukovanou proteinovou expresi NF-KB a COX-2 Naproti tomu předléčení OAnf v PBS významně snížilo expresi NF. kB a COX-2 v buňkách ošetřených PM (str<0.05).these results="" supported="" that="" oanf="" in="" pbs="" had="" better="" anti-inflammatory="" activity="" than="" raw="" oa="" in="" pbs="" (figure="" 8c).then,="" we="" also="" compared="" their="" anti-skin-aging="" activity.="" pretreatment="" with="" oa="" in="" pbs="" had="" no="" effects="" on="" pm-induced="" mmp-1="" or="" timp-1="" alteration.="" however,="" oanf="" in="" pbs="" could="" reduce="" the="" expression="" of="" mmp-1="" and="" rescue="" the="" expression="" of="" timp-1="" when="" compared="" with="" the="" pm-induced="" keratinocytes="" damage="" group=""><0.05)(figure 8d).these="" findings="" indicated="" that="" oanf="" possessed="" better="" anti-skin-aging="" properties="" than="" raw="" oa="" in="" pbs.="" finally,="" we="" analyzed="" the="" phosphorylation="" of="" erk,="" jnk,="" and="" p38="" to="" confirm="" the="" regulation="" of="" mapks="" signaling.="" figure="" 8e="" showed="" that="" the="" treatment="" of="" raw="" oa="" in="" pbs="" could="" not="" downregulate="" pm-induced="" phosphorylation="" of="" these="" mapks="" protein.="" however,="" pretreatment="" with="" oanf="" only="" reduced="" pm-induced="" phospho-jnk="" (p-jnk)="" expression="" but="" had="" no="" effect="" on="" p-erk="" and="" p-p38="" (figure="" 8e).the="" percentage="" changes="" of="" protein="" expression="" induced="" by="" oa="" in="" dmso,="" oa="" in="" pbs,and="" oanf="" in="" pbs="" are="" summarized="" at="" table="" 4.="" oanf="" in="" pbs="" markedly="" reversed="" pm-induced="" protein="" alterations,="" which="" was="" barely="" observed="" in="" oa="" in="" the="" pbs="" group.="" in="" addition,="" the="" effects="" of="" oanf="" in="" pbs="" were="" comparable="" to="" the="" equivalent="" amount="" of="" oa="" in="" dmso,="" which="" indicated="" that="" the="" electrospinning="" process="" increased="" the="" water="" solubility="" of="" oa="" without="" altering="" its="" bioactivities.="" accordingly,="" oanf="" effectively="" inhibited="" the="" expressions="" of="" inflammatory="" proteins="" and="" skin-aging="" proteins="" and="" downregulated="" the="" mapks="" signaling="" pathway="" in="" pm-induced="" keratinocytes="">
4. Diskuze
Sledování koncentrace pevných částic v ovzduší se v poslední době stalo jedním z nejdůležitějších ukazatelů používaných pro hodnocení indexu kvality ovzduší. Kůže je největším imunitním orgánem člověka a nadměrné vystavení PM by mohlo poškodit kožní funkce. Jin a kol. odhalili, že různé typy PM nejen zůstávaly ve vnější stratum corneum epidermis, ale také pronikaly do stratum spinosum a vlasových folikulů [14]. Je-li vystaven nadměrné PIA po dlouhou dobu, způsobí dysfunkci kožní bariéry a je spojen s mnoha kožními chorobami, jako je atopická dermatitida, psoriáza, akné a stárnutí [19,20]. Dijkhoff a kol. jasně ukázal, že PM může spouštět exogenní a endogenní tvorbu ROS, což vede k progresi oxidačního stresu, včetně peroxidace lipidů, oxidace proteinů, mitochondriální dysfunkce, poškození DNA, aktivace zánětu a urychlení procesu stárnutí [15]. V souladu s tím je boj proti nadprodukci ROS vyvolané PM dobrou strategií a první volbou, jak zabránit poškození oxidativním stresem během nadměrné expozice PM. Předchozí studie také prokázaly, že antioxidační léčba, jako je diflorethohydroxykarmalol [21], dieckol [22], extrakt z Opuntia humifusa [23] a extrakt z višně [24], může účinně zmírnit dysfunkci keratinocytů vyvolanou PM. Naše výsledky také zjistily, že OA v DMSO může snížit produkci ROS vyvolanou PM a zabránit poškození způsobené PM. NF-kB je navíc všudypřítomný a indukovatelný transkripční faktor regulující expresi prozánětlivých proteinů, jako je COX-2, které hrají zásadní roli u mnoha kožních onemocnění. Naše výsledky uvedly, že OA může snížit PM-indukovanou aktivaci NF-kB k inhibici exprese zánětlivého proteinu COX-2[25]. Navíc aktivace MAPK signalizace může zvýšit expresi AP-1 a vede k transkripční regulaci MPs[18]. V této studii byla OA schopna potlačit expresi proteinu proti stárnutí kůže MP-1 a zvýšit expresi proteinu proti stárnutí kůže TIMP-1, aby se zabránilo stárnutí keratinocytů vyvolanému PM. Naše výsledky také ukázaly, že OA účinně inhibovala fosforylaci JNK. Proto může OA inhibovat záněty a stárnutí kůže vyvolané PM snížením regulace signální dráhy ROS/JNK při poškození keratinocytů indukovaném PM.
Podle našich nejlepších znalostí je špatná rozpustnost účinných látek ve vodě spojena s nízkou biologickou dostupností, což omezuje jejich použití v lékařství, potravinářství a kosmetickém průmyslu [26,27]. Je dobře známo, že sloučeniny se špatnou rozpustností ve vodě mají několik společných fyzikálně-chemických vlastností, jako je nadměrně velká velikost částic, nižší povrchová plocha, lipofilní struktura a krystalická forma [28]. Naše výsledky také ukázaly, že surový OA měl tyto fyzikálně-chemické vlastnosti, včetně velké velikosti částic (5079,50±384,87 nm), 3-60 um nepravidelného granulovaného prášku s nižším povrchem (obrázek 2C) a zjevná krystalická forma. Tyto výsledky ukázaly, že rozpustnost OA ve vodě byla nižší než 0,01 ug/ml a mohla být klasifikována jako prakticky nerozpustná aktivní sloučenina podle klasifikace rozpustnosti ve vodě podle United States Phar-macopeia (USP)[29]. Pokud by se tyto nedostatky nepodařilo vyřešit, byly by aktivity OA na kůži značně omezeny. Tato studie úspěšně použila PVPK90 a HPBCD jako nosiče pomocí procesu elektrostatického zvlákňování k přípravě OAnf. Zlepšení rozpustnosti ve vodě je hlavním indexem používaným k potvrzení optimální farmaceutické formulace a naše výsledky ukázaly, že OA:PVPK90:HPBCD v poměru 1:8:20 má nejlepší rozpustnost ve vodě. To naznačuje, že OAnf účinně zvyšuje rozpustnost surového OA v závislosti na poměru HPBCD. Podobně předchozí studie také odhalily, že vyšší poměr cyklodextrinu zvyšuje kapacitu zapouzdření formulace a vede k významnému zvýšení rozpustnosti ve vodě a biologické aktivity kurkuminu [30], resvera-trolu [12], thymolu [31]. a difenokonazol[32]. Kromě toho tato studie také porovnávala fyzikálně-chemické vlastnosti surového OA a jeho nanovláken, aby se objasnily mechanismy zlepšení rozpustnosti OA ve vodě. Nanovlákna OA vyrobená v této studii byla všechna vlákna s jednotnou nano-velikostí. Výsledky analýzy velikosti částic také uvedly, že OAnf rekonstituovaný ve vodě vykazoval nanočástice s vynikající homogenitou distribuce. Tyto výsledky ukázaly, že OAnf měl větší povrch než surový OA. Kromě toho by tvorba intermolekulárních vodíkových vazeb mezi aktivními sloučeninami a nosiči mohla také přispět ke zlepšení rozpustnosti ve vodě. Spektrum FTIR a HNMR OAnf prokázalo, že surový OA byl účinně zapouzdřen do HPBCD a vytvořil stabilizovanou nanovlákennou strukturu s PVPK90 vytvořením intermolekulární vodíkové vazby mezi OA a HPBCD/PVPK90. Krystalická forma přeměněná na amorfní formu aktivní sloučeniny byla také indikátorem zlepšení rozpustnosti ve vodě. XRD obrazec OAnf ukázal, že krystalická struktura surového OA se po vytvoření nanovláken přeměnila na amorfní strukturu. Tento podobný výsledek byl také pozorován u několika aktivních látek v nanovláknech [12,30]. Celkově vzato, formulace nanovláken účinně zlepšila rozpustnost surového OA ve vodě zlepšením fyzikálně-chemických vlastností, včetně zmenšení velikosti částic, zvětšení plochy povrchu, tvorby vodíkových vazeb s nosiči a amorfní transformace.
Lokální formulace obsahující antioxidanty jsou účinné při dodávání do epidermis a dermis, aby působily proti oxidačnímu stresu vyvolanému PM, zánětu a stárnutí kůže [33]. Na základě znalostí absorpce kůží je stratum corneum limitujícím faktorem, který omezuje pronikání kůží a absorpci aktivních látek, což vede ke snížení biologické aktivity [34]. Výsledek in vitro penetrace kůží ukázal, že OAnf prošel stratum corneum snadněji a rychleji než surový OA a zůstal ve velkém množství v epidermis a dermis. Tento výsledek potvrdil, že OAnf může účinně zlepšit vstřebávání surového OA pokožkou. Dále, aby bylo možné určit, zda má OAnf lepší aktivitu proti znečištění než surový OA, v této studii byl k porovnání jejich biologických aktivit použit model poškození keratinocytů vyvolaný PM. Naše výsledky ukázaly, že OAnf v PBS má lepší účinky proti znečištění než surový OA, včetně snížené nadprodukce ROS, snížené exprese zánětlivých proteinů (COX-2 a NF-kB) a proteinu stárnutí pleti (MP-1), zvýšená exprese proteinů proti stárnutí pleti (TIMP-1) a downregulovaná fosforylace JNK. Proto by OAnf mohl být topickou formulací jako antioxidační činidlo pro prevenci poškození keratinocytů vyvolaného PM.
Stručně řečeno, OAnf zlepšil své fyzikálně-chemické vlastnosti, aby vyřešil špatnou rozpustnost surového OA ve vodě a také významně zlepšil absorpci surového OA pokožkou. OAnf měl lepší antioxidační, protizánětlivé a anti-aging aktivity při poškození keratinocytů vyvolaném PM. V důsledku toho navrhujeme, aby OAnf mohl být použit jako produkt péče o pleť nebo jako farmaceutická formulace k prevenci poškození kůže vyvolaného PM v budoucnu.
Tento článek je extrahován z Antioxidants 2021, 10, 1411. https://doi.org/10.3390/antiox10091411 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants
