Obacunon zmírňuje jaterní fibrózu se zvýšenými antioxidačními účinky GPx-4 a inhibicí EMT
Jun 17, 2022
Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací
Abstraktní:Obacunon, limoninový triterpenoid extrahovaný z rostliny Phellodendronchinense Schneid nebo Dic-tamnus dasycarpusb Turcz, vyvolává řadu farmakologických účinků, jako jsou protizánětlivé, antineoplastické, antioxidační a proti plicní fibróze. Nicméně antifibrotický účinek oba-cone a podrobný základní mechanismus jaterní fibrózy zůstává nejasný. Jaterní fibróza je vysilující onemocnění ohrožující lidské zdraví. Transformující růstový faktor (TGF)-/P-Smad je hlavní cestou fibrózy, která se vyznačuje epiteliálně-mezenchymálními transformacemi (EMT) a ukládáním kolagenu, doprovázenými nadměrným množstvím volných kyslíkových radikálů. Nrf-2 působí jako klíčový antioxidační regulátor, který řídí expresi různých genů souvisejících s antioxidanty. Glutathionperoxidáza-4(GPx{16}}) je členem skupiny glutathionperoxidáz, která přímo inhibuje oxidaci fosfolipidů za účelem zmírnění oxidačního stresu. V této studii jsme se zaměřili na prozkoumání role páteře v modelu myší jaterní fibrózy indukované tetrachlormethanem (CCl4) a v jaterních hvězdicových buňkách (buněčná linie LX2) vystavených TGF-. Obacunon prokázal silné zlepšující účinky na jaterní fibrózu jak v aktivovaném LX2, tak v myších jaterních tkáních se sníženými hladinami -SMA, kolagenu1 a vimentinu. Obacunon také pozoruhodně potlačil signály TGF-/P-Smad a proces EMT. Mezitím obacunon projevil silný antioxidační účinek snížením hladin reaktivních forem kyslíku (ROS) v obou modelech. Antioxidační účinek páteře byl připsán aktivaci GPx-4 a Nrf-2. Kromě toho byl terapeutický účinek páteře na buňky LX2 významně odstraněn in vitro plus s antagonistou GPx-4 RSL3, paralelně s opětovně zvýšenými hladinami ROS.puritans vitamín CProkázali jsme tedy, že páteř je schopna zmírnit jaterní fibrózu zesílením signálu GPx-4 a inhibicí dráhy TGF-/P-Smad a procesu EMT.
klíčová slova:páteř;fibróza jater; EMT; jaterní hvězdicové buňky; GPx-4;TGF-;oxidační stres
1. Úvod
Chronická hepatitida je obvykle způsobena virovou hepatitidou, nealkoholickou steatózou, alkoholickou hepatitidou a autoimunitní hepatitidou. Přetrvávající poškození jater může skončit jaterní fibrózou nebo dokonce rakovinou jater, která fatálně ovlivnila lidské zdraví [1]. Jaterní fibróza je typem nehojící se reakce na ránu pod kontinuálními faktory poranění charakterizovanými přehnanou akumulací extracelulární matrix (ECM) a tvorbou jizev [2]. Hepatické hvězdicové buňky (HSC) jsou za normálních podmínek obvykle v klidovém stavu, při chronickém poškození jater se aberantně aktivovaly a vyznačovaly se vysokou proliferací a sekrecí ECM [3], označované jako myofibroblasty [4]. Pochopení mechanismu aktivace HSC má velkou hodnotu pro vývoj nových terapeutik pro léčbu jaterní fibrózy.
Transformující růstový faktor (TGF- ) podporuje zánětlivé reakce stimulací exprese interleukinu-1 (IL-1) a interleukinu-6(IL-6) v monocytech [5]. Navíc indukuje rakovinné metastázy prostřednictvím epiteliálně-mezenchymální transformace (EMT) a imunitního úniku nádoru [6-8]. EMT označuje dynamický fyziologický proces, při kterém epiteliální buňky ztrácejí svou polaritu a transformují se na mezenchymální buňky, jako jsou fibroblasty a myofibroblasty, což vede k rozvoji fibrózy [9]. Výskyt EMT je vždy spojen s downregulací E-cadherinu a upregulací markerů mezenchymálních buněk, jako je N-cadherin a hlemýžď[10]. Aktivace TGF- -Smad je jednou z hlavních intracelulárních cest při EMT a také při tvorbě myofibroblastů [11].
Oxidační stres je považován za jednu z primárních příčin fibrózy s nadprodukcí reaktivních forem kyslíku (ROS)[12]. Vysoká hladina ROS způsobuje strukturální poškození biomolekul, jako jsou proteiny, lipidy a DNA, což nakonec vede k poškození buněk a podpoře fibrózy [13]. Při oxidačním stresu je dimer Nrf-2-Keep-1 disociován, nukleární respirační faktor-2(Nrf{5}}) je transportován do jádra a indukuje expresi různých antioxidační enzymy vazbou s prvky antioxidační odezvy (ARE) snižují hladiny ROS[14]. Glutathionperoxidáza-4 (GPx-4) působí jako antioxidační protein s aktivitou glutathionperoxidázy, která je zodpovědná hlavně za inhibici oxidace fosfolipidů a tvorby ROS v procesu ferroptózy [15].sistancheStudie na myších ukázaly, že fibróza se zhoršuje po ztrátě Nrf-2 nebo GPx-4 [16,17].
Cistanche může proti stárnutí
V současné době je k dispozici několik léků pro léčbu jaterní fibrózy, včetně léků s protizánětlivými vlastnostmi [18], antioxidačních [19] a agonistů receptorů aktivovaných peroxisomovým proliferátorem (PPAR) [20]. V nedávné studii Prof. Yu zjistil, že pacienti s jaterní cirhózou mají v klinických vzorcích vyšší hladiny oxidace lipidů ve srovnání se zdravými kontrolami [21]. Několik antioxidačních léků, jako je resveratrol[19] a kyselina ursolová |13]prokázalo dobré účinky na fibrózu. Tyto důkazy kumulativně naznačují, že antioxidace je slibnou strategií pro léčbu antifibrózy.
Pirfenidon (PFD) je pyridinový lék na idiopatickou plicní fibrózu (IPF), přičemž v mnoha studiích vykazuje také dobrý terapeutický účinek na jaterní fibrózu [22,23]. PFD je tedy v této studii vybrán jako pozitivní kontrolní lék. Obacunone (Oba) je přírodní limonoidní sloučenina extrahovaná z rutatických rostlin jako Phellodendri a Dictamnus-dasycarpus [24], které mají různé biologické vlastnosti, jako jsou protizánětlivé |25, antioxidační [26] a protinádorové [27]. Nedávné zprávy odhalily, že Oba je silný agonista Nrf{9}}, který účinně zmírňuje plicní fibrózu indukcí CCL4 a oxidační poškození buněk MDA-MB{12}} způsobené H, O2. Ještě důležitější je, že Oba je netoxický pro myši [28]. Nejsou však hlášeny žádné zprávy o účinku Oba na jaterní fibrózu, zejména o GPx-4 zprostředkovávajícím antifosfolipidovou oxidaci, signálech TGF- -Smad a procesu EMT. Zde máme v úmyslu prozkoumat účinky Oba na jaterní fibrózu a definovat základní molekulární mechanismy.
2. Výsledky
2.1. Oba inhibovaná aktivace TGF- -indukovaná Lx-2
Since the activated HSCs (aHSCs)played a critical role in liver fibrosis [3], we first observed the effects of Oba on liver fibrosis in aHSCs. In this experiment, we used the Cell Counting Kit-8(CCK8) to detect the toxicity of Oba on LX-2 cells, a type of human HSCs line. We found that LX-2 cells survival was not significantly affected by Oba at the concentration range of 10 to 160 uM during 24/48/72 h treatment (Figure 1A). Then, the LX-2 cells were stimulated with 10 ng/mL TGF-β for 24 h and then treated with Oba or not. the protein expression of α-Smooth muscle actin (α-SMA) was effectively inhibited at concentrations of >20 uM Oba. Je zajímavé, že se zvýšenou koncentrací Oba se inhibiční účinek a-SMA významně nezvýšil (obrázek 1B).co je cistanchePro následující experiment jsme tedy vybrali koncentraci 20 μM s PFDservingem jako pozitivní kontrolou. Oba účinně inhibovaly hladiny proteinů -SMA, kolagenu-1, vimentinu a růstového faktoru pojivové tkáně (CTGF) (obrázek 1C) v aHSC[3,4]. Oba navíc snížili hladiny exprese mRNA -SMA, kolagenu-1 a vimentinu (obrázek 1D). Výsledky imunofluorescence dále potvrdily, že signály pozitivního barvení -SMA byly zjevně sníženy Oba (ve srovnání se skupinou TGF-, protože počet červených krvinek se po léčbě Oba snížil) v Lx-2 (obrázek 1E). Tyto výsledky naznačují, že Oba má dobrý inhibiční účinek na aktivaci Lx-2.
2.2. Oba inhibované signály TGF-/Smad, proces EMT a projevený protizánětlivý účinek
Pro definování molekulárních mechanismů, které jsou základem výše uvedených antifibrózových účinků, byly pozorovány hladiny proteinové exprese receptoru TGF, P-Smad a -SMA, které byly významně inhibovány Oba v aHSC (obrázek 2A). hladiny exprese N-cadherinu a hlemýždě byly sníženy, zatímco hladina exprese proteinu E-cadherinu byla podpořena (obrázek 2B), což ukazuje, že dráha EMT byla také blokována [3]. Kromě toho jsme zjistili, že Oba vyvolali sníženou hladinu IL-6 (obrázek 2C).Čistota proti stárnutíAbychom dále vyhodnotili účinek Oba na zánět, nejprve jsme stimulovali buňky HepG-2 (typ buněčné linie lidského hepatocelulárního karcinomu) pomocí 20 nmol CCl4, poté následovalo ošetření 20 uM Oba. Tyto výsledky ukázaly, že Oba by mohly snížit hladiny exprese mRNA a proteinů IL-6 v CCl4-stimulovaném HepG-2 (obrázek 2D). Celkově oba vykazoval četné antifibrózní účinky inhibicí signálů TGF-/Smad a procesu EMT a rovněž působí protizánětlivě.
2.3. Antifibrózní účinky Oba byly závislé na zvýšené antioxidační kapacitě aktivací GPXx-4
In order to further define the underlying molecular mechanisms of Oba in aHSCs, we discovered that Oba activated the Nrf-2/Keap-1 pathway and reduced the protein expressions of Nox-2 (Figure 3A).In addition, we found that Oba increased the protein expression level of GPx-4(Figure 3B). To validate the importance of the GPx-4-mediated signal, RSL3, which is an inhibitor of GPx-4 [29], was selected to deal with Lx-2. Examination by using the CCK8 （Figure 3C）revealed that at concentrations of RSL3>{{0}},75 μM, buněčná životaschopnost Lx-2 byla významně snížena; proto bylo vybráno 0.75-μM RLS, aby zasáhlo do exprese GPx-4. Výsledky Western blotu ukázaly, že když byl RSL3 přidán do aHSC, exprese proteinu GPx-4 byla snížena a profibrotické markery včetně -SMA a vimentinu byly všechny významně obráceny, což ukazuje na důležitost GPx-4 při zprostředkování antifibrózních účinků Oba (obrázek 3D). Mezitím Oba zjevně snížil hladinu ROS aHSC pomocí fluorescenčních detektorů ROS a tento účinek byl zjevně blokován RSL3 (obrázek). Tyto údaje naznačovaly, že nižší hladina fosfolipidového ROS zprostředkovaná GPx-4 byla hlavní antifibrózou signál Oba.
2.4. Oba tlumí CCl4-indukovanou fibrózu jater myší
CCl4-indukovaná jaterní fibróza je jedním z nejčastěji používaných myších modelů ke studiu jaterní fibrózy [3]. Na histologické úrovni Oba významně zmírnily patologii jater, o čemž svědčí zlepšené depozice kolagenu indikované Massonovým barvením a anti-SMA barvením. (Obrázek 4A-D). Poté byly stanoveny sérové hladiny alanintransaminázy (ALT)/aspartáttransaminázy (AST), aby se otestovaly úrovně poškození jater, ve srovnání s CCL4 myšmi, skupinou Oba s nízkou dávkou a skupinou PFD významně snížily hladiny ALT (p<0.05)(figure 4e).="" expectedly,="" oba="" inhibited="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" collagen-1,="" ctgf,="" and="" α-sma="" in="" mouse="" fibrotic="" livers,="" which="" were="" consistent="" with="" the="" immunohistologic="" results="" (figure="" 4f).="" these="" in-vivo="" results="" illustrated="" that="" oba="" significantly="" improved="" the="" ccl4-induced="" mouse="" liver="">
2.5. Oba zlepšili expresi GPx-4, snížili zánět, expresi proteinů souvisejících s EMT a snížili hladiny oxidace lipidů u CCl4-indukované jaterní fibrózy
Jak je znázorněno na obrázku 5A, Oba inhibovali proteinové exprese IL-6 a výskyt EMT ve fibrotických játrech myší se sníženými hladinami hlemýžďů a N-cadherinu, ale vyššími hladinami E-cadherinu. Kromě toho byly proteinové exprese Nrf-2 a GPx-4 zjevně zvýšeny po léčbě středními a vysokými dávkami Oba (obrázek 5B).cistanche benefíciosVýsledky imunohistochemického barvení (IHC) prokázaly, že ve srovnání s modelovou skupinou byly počty GPx-4 pozitivních buněk (hnědé) ve skupinách s vysokou a střední dávkou Oba významně zvýšeny (obrázek 5C, E). Dále jsme testovali úrovně oxidačního stresu v myších játrech a zjistili jsme, že ve srovnání s kontrolou byla intenzita fluorescence ROS modelové skupiny zjevně vyšší. Na druhé straně byla hladina ROS významně snížena po léčbě Oba (obrázek 5D, F).
3. Diskuse
Fibróza je intimní onemocnění ve světě. Bez ohledu na etiologii, včetně virové infekce, alkoholické nebo nealkoholické hepatitidy a autoimunitních reakcí, všechny končí fibrózou v důsledku chronického poškození jater [1]. Aktivace HSC je ústřední událostí, která je základem fibrózy jater. HSC jsou aktivovány aberantní produkcí různých fibrogenních faktorů a ukládáním ECM [2,3]. Uvádí se, že na výše uvedených procesech se podílí kanonická aktivační signalizace Smad související s TGF, proces EMT a také chronický zánět související s IL-6- [3,4]. Abychom mohli vyhodnotit antifibrózové účinky Oba na jaterní fibrózu, nejprve se zaměřujeme na definování jeho účinků na aktivaci Lx-2 indukovanou TGF-, a poté na ověření jeho antifibrózových účinků in vivo pomocí Nakonec model jaterní fibrózy vyvolaný CCl4-.
Oba je přírodní limonoidní sloučenina [24] a její biologické účinky zahrnují především protizánětlivé [25], antioxidační [26] a protinádorové [27] funkce. Nedávno bylo zjištěno, že Oba je silným a účinným agonistou Nrf{6}} a má účinky proti plicní fibróze u myší [28]. Stále však chybí důkazy o jeho účincích proti fibróze jater a souvisejících molekulárních mechanismech. Zde byly nadměrné exprese -SMA, kolagenu 1 a CTGF všechny inhibovány Oba v modelech Lx-2 stimulovaných TGF-. Posílená EMT signalizace je také účinně potlačena Oba.
Bylo potvrzeno, že oxidativní stres významně přispívá k fibróze [12]. Reactive oxygen species (ROS) je zastřešující termín pro oxidované molekuly nebo ionty s biologickou aktivitou a nadprodukce různých ROS v hepatocytech může vést k jejich smrti a vyvolat jaterní fibrózu [13]. Naopak, klidové HSC jsou aktivovány po poškození jaterních buněk a nadměrné ROS zesiluje více aktivace HSC a končí fibrózou jater [12]. Proto se tlumení přehnaného oxidačního stresu stává účinnou léčbou fibrózy.
Nrf-2 je kritickým regulátorem antioxidačního stresu, aktivovaný fosforylovaný Nrf-2 je translokován do jádra, aby poháněl up-regulaci downstream antioxidačních proteinů, GST, HO1[15]. Uvádí se, že mnoho přírodních chemických aktivátorů Nrf2 má antifibrózní účinky, jako je terc-butylhydrochinon a kurkumin. Ze všech antioxidačních proteinů je glutathionperoxidáza-4(GPx-4) členem skupiny glutathionperoxidáz (GPx1-8) a usnadňuje redoxní rovnováhu snížením glutathionu [ 30-32]. Je prokázáno, že vyšší exprese glutathionperoxidázy-7 inhibovaly nealkoholické ztučnění jater snížením produkce ROS [33]. GPx-4 redukoval fosfolipidový peroxid na lipidové membráně, aby chránil buňky před oxidačním poškozenímJ15]. Kazuya Tsubouchi a kol. zjistili, že exprese GPx-4 je snížena ve tkáních myší s plicní fibrózou vyvolanou bleomycinem a fibróza je závažnější, když je vyřazen gen GPx-4. Kromě toho, peroxidace lipidů a dráha TGF-/P-Smad jsou významně zesíleny v plicních fibroblastech, když je depletován gen GPx-4 [17]. Nedávno více důkazů podpořilo, že ROS odvozené od fosfolipidů se podílejí na speciální buněčné smrti, nazývané ferroptóza. Inhibitor GPx-4, RSL3, se také používá jako induktor ferroptózy [21,34].
V našich experimentech jsme zjistili, že Oba projevili antioxidační kapacitu zvýšením regulace Nrf-2 a GPx-4 a snížením hladiny Nox-2. Je pozoruhodné, že antifibrózní účinek Oba byl významně oslaben, když byl gen GPx-4 inhibován RSL3, inhibitorem GPx-4. Důsledně byla také osvětlena snížená hladina ROS léčbou Oba. Tato pozorování in vitro vysoce podpořila, že GPx-4-zprostředkované antifosfolipidové ROS byly kritické pro ochranné účinky Oba.
Aby bylo možné ověřit výše uvedené výsledky antifibrózní léčby Oba v buňkách LX2, byla také vyšetřena fibróza jater myší indukovaná CCl{2}}. CCl4 je typ hepatotropního jedu, degradace zprostředkovaná mikrozomálním enzymem P450 produkovala vysoce reaktivní volné radikály, které ničí integritu buněčné membrány a následně spouští řadu jaterních dysfunkcí a poškození, které se nakonec vyvinou do jaterní fibrózy [35]. V našem experimentu Oba vykazovaly dobré léčebné účinky na jaterní fibrózu indukovanou CCl. Zmírnil poškození jater nižší hladinou AST, zmenšila se plocha svazků kolagenových vláken a proteinové exprese a-SMA, CTGF, kolagen-1, hlemýžď, N-kadherin a IL{{10 }} byly všechny sníženy. Zatímco antioxidační signalizace, proteinové exprese Nrf-2 a GPx-4 byly také zvýšeny, vyšší hladiny ROS poklesly. Tyto výsledky dále potvrdily in vitro antifibrózní účinky Oba a související signalizaci, zejména inhibici EMT a antioxidační účinky Nrf-2 a GPx-4.
V souhrnu jsme došli k závěru, že Oba zmírnil TGF- -indukovanou aktivaci HSC a CCl4-indukovanou jaterní fibrózu prostřednictvím různých mechanismů. Za prvé Oba inhibovaly klasickou dráhu TGF-/Smad, EMT a produkci IL-6. Za druhé, vykazoval vynikající antioxidační kapacitu zvýšením exprese Nrf-2 a GPx-4. GPx-4zprostředkované anti-fosfolipidové ROS přispívaly hlavně k jeho antifibrózním účinkům. Oba proto mohou sloužit jako kandidátní chemické činidlo pro prevenci a léčbu fibrózy.
Oba prokázali určitý léčebný účinek na fibrózu jater vyvolanou CCl{0}} u myší C57. Oba by mohly down-regulovat expresi biomarkerů proteinu fibrózy, jako jsou: -SMA, CTGF atd. Mezitím Oba snížil proteinovou expresi I-6, E-cadherinu atd. Bylo zajímavé, že Mid-Oba vykazuje známky lepších výsledků než u low-Oba a high-Oba, pokud jde o relativní expresi těchto proteinů, i když to není statisticky významné. Ukázalo se však, že optimální dávkování by mohlo být kritickým faktorem v tomto procesu a tento jev prozkoumáme v dalším experimentu. Navíc jsme zjistili, že nižší ROS a stupeň jaterní fibrózy s upregulujícími expresemi Nrf-2 a GPx-4. Věříme tedy, že Oba by mohly zmírnit jaterní fibrózu regulací Nrf-2 a GPx-4. PFD však může mít lepší terapeutický účinek než Oba in vivo i vitro. Oba byl však lepší než PFD v antioxidačním účinku, přispívá ke zvýšení možnosti nalezení nového léku na antifibrogenní účinek na játra z antioxidační strany a trochu přispívá k lidskému zdraví.
4. Materiály a metody
4.1. Chemikálie a činidla
Oba (č. B20553, čistota větší nebo rovna 98 procentům) a RSL3 (č. S81241, čistota větší nebo rovna 98 procentům) byly zakoupeny od YUANYE Bio-Technology Co., Ltd. (Shanghai, Čína) a rozpuštěny v dimethylsulfoxidu (DMSO) (č. R21950; YUANYE) na koncentraci 72,64 mg/ml a 6 mmol, v daném pořadí. Po sterilizaci filtrací byl výsledný roztok uchován při -20 stupni C. Roztok byl přidán do kultivačního média, aby se dosáhlo konečné koncentrace DMSO<1%. tgf-β="" was="" purchased="" from="" peprotech="" china="" (suzhou,="" china).="" ccl4="" was="" purchased="" from="" jiangsu="" qiangsheng="" chemical="" (jiangsu,="" china).="" a="" ros="" fluorescence="" probe="" kit="" was="" purchased="" from="" applygen(beijing,="" china).="" trizol,="" sybr="" premix="" ex="" taq="" reagents,="" revertaid="" first="" strand="" cdna="" synthesis="" kit,="" ripa,="" bca="" protein="" assay="" kit,="" and="" sds-page="" kit="" were="" purchased="" from="" thermo="" fisher="" scientific(waltham,="" ma,="" usa).="" the="" cell="" counting="" kit-8="" (cck8)was="" purchased="" from="" saint-bio="" (shanghai="" china).="" the="" primers="" were="" designed="" and="" synthesized="" by="" tsingke="" (xi'an,="" china).dapi,="" goat="" anti-mouse="" igg="" h&l(alexa="" fluor="" 594)(ab150120),="" anti-alpha="" smooth="" muscle="" actin="" antibody(ab7817),="" anti-vimentin="" antibody="" (ab20346),="" anti-il-6="" antibody="" (ab233706),anti-collagen-1="" antibody="" (ab34710),anti-smad3="" (phospho)="" antibody="" (ab52903),="" and="" anti-nox2/gp91phox="" antibody(ab80508)="" were="" purchased="" from="" abcam(cambridge,="" ma,="" usa).="" e-cadherin="" polyclonal="" antibody="" (20874-1-ap),="" n-cadherin="" polyclonal="" antibody="" (22018-1-ap),="" gpx4="" antibody="" (14432-1-ap),β-actin="" polyclonal="" antibody(20536-1-ap),="" nrf2="" polyclonal="" antibody="" (16396-1-ap),="" and="" keap1="" polyclonal="" antibody="" (10503-2-ap)="" were="" purchased="" from="" proteintech="" (rosemount,="" min,="" usa).ctgf="" polyclonal="" antibody(wl02602)="" and="" snail="" polyclonal="" antibody="" (wlo1863)were="" purchased="" from="" wanleibio="" (shenyang,="">
4.2. Buněčné kultury a experimentální design
Lidská jaterní hvězdicová buněčná linie Lx-2 a lidská jaterní rakovinová buněčná linie Hepg-2 (všechny zdroje pocházejí z Katedry farmacie, The Fourth Military Medical University, Čína) byly kultivovány v Dulbeccově modifikovaném Eagle médiu ( DMEM) doplněné 10 procenty fetálního hovězího séra a 1 procentem penicilinu (Thermo Fisher Scientific) a streptomycinu (Thermo Fisher Scientific) a poté udržovány při 37 °C ve zvlhčené atmosféře 5 procent CO2 a 95 procent vzduchu. Aby se vyhodnotil účinek Oba na životaschopnost buněk Lx-2, byl Lx-2 zakryt 1×10* buňkami/jamku v 96-jamkové destičce a inkubován po dobu 24 hodin před přidáním z Oba. Poté byly Lx-2 ošetřeny různými koncentracemi Oba (10, 20, 40, 80 a 160 wM a kultivovány po dobu 24, 48 nebo 72 h. Životaschopnost buněk byla testována pomocí CCK8. K vyhodnocení účinek Oba na aktivaci Lx-2, Lx-2 byl předkultivován v médiu bez séra po dobu 12 hodin, následovala stimulace TGF- (10 ng/ml, 24 h) a ošetření Oba nebo PFD. K vyhodnocení účinku Oba na zánět byl Hepg-2 stimulován CCl4(20 nm,8 h) a ošetřen 20 μM Oba. Na konci kultivace byly buňky shromážděny a podrobeny Western blotting a analýza qPCR v reálném čase.
4.3. Zvířata a experimentální design
Samci myší C57 o hmotnosti 20±0,5 g (The Laboratory Animal Center of The Fourth Military Medical University) byli umístěni za vhodných podmínek při teplotě 25 stupňů ± 2 stupně a 12-hodinovém cyklu světlo/tma s volný přístup k vodě a potravinám. Každý experiment v této studii byl proveden v souladu s protokoly schválenými Výborem pro péči o zvířata Čtvrté vojenské lékařské univerzity. Myši c57 byly náhodně rozděleny do 6 skupin (n=6 v každé skupině) následovně: i) falešná kontrolní skupina, i) modelová skupina, ii) skupina s vysokým obsahem Oba (CCl4 plus 6 mg/kg Oba),io ) střední skupina-Oba (CCl4 plus 3 mg/kg Oba), ø) skupina s nízkým obsahem Oba （CCl4 plus 1,5 mg/kg Oba) a vi) skupina PFD (CCl4＋ PFD) Modelová skupina byla léčena CCl4 (30 procento CCl4/olivový olej, 5 ml/kg intraperitoneální injekce) třikrát týdně po dobu 6-týdne k vyvolání jaterní fibrózy. Ostatní skupiny byly krmeny různými dávkami Oba nebo PFD a stejnými objemy intraperitoneální infekce CCil4 pro 6-týdenní období. Stejný objem olivového oleje místo CCl4 byl do C57 podáván ipasem falešnou kontrolou. Každý experiment v tomto článku byl proveden v souladu s protokoly schválenými výborem Fourth Military Medical University Committee on Animal Péče.
4.4. Western blotování
Játra C57 nebo kultivované buňky byly homogenizovány nebo lyžovány v RIPA pufru za použití tkáňového lapovacího zařízení nebo buněčného seškrabu (Service, KZ-2). Koncentrace proteinu byla měřena pomocí soupravy BCA Protein Assay Kit. Lyzát byl centrifugován (4 stupně, 12, 000 rpm, 5 min) a byl odebrán supernatant. Operační kroky byly provedeny tak, jak bylo uvedeno dříve [14]. Vzorky byly skenovány pomocí chemiluminiscenčního zobrazovacího a analytického systému (Beijing Sage Creation Science Co, MiniChemi 610).
4.5. Analýza qPCR v reálném čase
C57 játra nebo kultivované buňky byly homogenizovány nebo lyžovány v Trizol činidle s pomocí tkáňového lapovacího zařízení pro extrakci celkové RNA. Celková RNA byla reverzně transkribována do cDNA pomocí RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit. -aktin byl použit pro interní referenci. RT-qPCR byla provedena na systému 7500 Real-time qPCR System (Applied Biosystems) s činidly SYBR Premix Ex Taq. Použité primery lidských genů byly uvedeny v tabulce 1.
Tento článek je extrahován z Molecules 2021, 26, 318. https://doi.org/10.3390/molecules26020318 https://www.mdpi.com/journal/molecules
