Nový multibiomarkerový test pro neinvazivní kvantitativní sledování poškození ledvin

Drew Watson¹, Joshua YC Yang^1,2,3a kol

Abstraktní:Současný standard péče opatření proledvinafunkceproteinurie a sérový kreatinin (SCr) jsou špatnými prediktory raného stadialedvinachoroba. Opatření, která lze odhalitchronickýledvinachorobav jeho dřívějších stádiích jsou potřebné k umožnění terapeutického zásahu a snížení nežádoucích výsledkůchronickýledvinachoroba. Vyvinuli jsme test poškození ledvin (KIT) a nové skóre KIT založené na složeném měření a validaci více biomarkerů v jedinečné sadě 397 vzorků moči. Test se provádí na vzorcích moči, které nevyžadují žádné zpracování v místě odběru a bez cílového sekvenování nebo amplifikace. Snažili jsme se ověřit, že předem definovaný test KIT, skóre KIT a klinické prahy korelují se stanovenýmichronickýledvinachoroba(CKD) a může poskytnout prediktivní informace o stavu časného poškození ledvin nad rámec samotného měření proteinurie a funkce ledvin. Statistické analýzy šesti markerů DNA, proteinů a metabolitů byly provedeny na podskupině vzorků reziduální skvrny moči sCKDkteré splnily kontroly kvality provedení testu od pacientů navštěvujících klinické laboratoře na University of California, San Francisco (UCSF) v rámci probíhající prospektivní studie schválené IRB. Kritéria pro zařazení zahrnovala výběr pacientů s potvrzenýmCKDa normální zdravé kontroly; vylučovací kritéria zahrnovala neúplné nebo chybějící informace pro klasifikaci vzorků, logistická zpoždění při přepravě/zpracování vzorků moči nebo malý objem vzorku a akutní poškození ledvin. Vícerozměrná logistická regreseledvinazraněnístatistiky stavu a poměru pravděpodobnosti byly použity k posouzení příspěvku skóre KIT pro predikciledvinazraněnístav a stádium CKD a také zhodnotit potenciální přínos skóre KIT pro detekci raného stadiaCKDnad rámec tradičních měření funkce ledvin. Vzorky moči byly zpracovány proprietární imunosondou pro měření bezbuněčné DNA (cfDNA), methylované cfDNA, klusterinu, CXCL10, celkového proteinu a kreatininu. KIT skóre a stratifikovaná skupina rizika KIT skóre (vysoké versus nízké) měly citlivost a specifičnost pro detekci stavu poškození ledvin (zdravé neboCKD) 97,3 procenta (95procentní CI: 94,6–99,3 procenta) a 94,1 procenta (95procentní CI: 82,3–100 procent). Navíc u pacientů s normální funkcí ledvin (odhadovaná rychlost glomerulární filtrace (eGFR) > 90) skóre KIT jasně identifikuje pacienty s predisponujícími rizikovými faktoryCKDeGFR nebo proteinurie (p < 0,001).="" skóre="" kit="" odhaluje="" břemeno="" poškození="" ledvin,="" které="" může="" být="" dosud="" neúplně="" rozpoznáno,="" a="" otevírá="" dveře="" pro="" dřívější="" detekci,="" intervenci="" a="" zachování="" funkce="">

klíčová slova:KIT test; chronickýledvinachoroba; biomarker; neinvazivní; moč; eGFR; cfDNA

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

1. Úvod

Chronickýledvinachoroba(CKD) je celosvětový problém veřejného zdraví s celosvětovou zátěží 850 milionů lidí.CKDje nyní uznávána jako „skrytá epidemie“, protože většina pacientů s časnými stádii CKD (~ 11 procent světové dospělé populace) zůstává nerozpoznána, protože nemají příznaky a nejsou si vědomi zvýšeného rizika srdečních problémů, infekcí hospitalizace a selhání ledvin. CKD se proto často nepovažuje za hlavní zdravotní problém, i když postihuje dvojnásobný počet diabetiků (422 milionů) a více než 20krát větší počet lidí s rakovinou (42 milionů) nebo HIV/AIDS (36,7 milionů).

CKD is defined as a reduced renal reserve, persisting for >3 měsíce a/nebo předchozí diagnóza stavu se známým rizikem proledvinadamage [1]. CKD is defined in a five-stage classification system for the assessment of kidney injury as patients advance towards the need for dialysis or transplantation [2]. The current standard of care tests, the blood-based serum creatinine (SCr) assay (and its use to calculate the estimated glomerular filtration rate or eGFR [3]) and protein in the urine, detect CKD 3–5 (eGFR of s60 mL/min/1.73 m2 of body surface area). However, most cases of CKD 1–2 (CKD >60 ml/min/1,73 m2 tělesného povrchu) zůstávají nezjištěny. eGFR má špatnou citlivost pro časnou detekci CKD, protože inherentní redundance renální rezervy maskuje časný vzestup SCr. Biopsie ledvin, často spouštěné v pokročilejších stadiích CKD, mají hodnotu pro posouzení patologie, jsou však invazivní, nákladné [4] a nelze je použít k sériovému monitorování progrese CKD.

Vícenásobné spouštěče a rizikové faktory spouští kaskáduledvinapoškození vCKDs progresí do selhání ledvin (CKD 5). Na celém světě je více než 10 milionů lidí, kteří potřebují záchrannou léčbu ledvin s celoživotní podporou dialýzy nebo transplantace ledvin. Přestože dialýza a transplantace poskytují funkční náhradu ledvin, obě jsou stále zatíženy různými nepříznivými dopady na morbiditu a mortalitu pacientů. Existuje také výrazný dopad CKD na další orgánové systémy v těle;CKDpacienti mají vyšší riziko infekcí, kardiovaskulárních úmrtí a rakoviny [5].

Včasné odhalení poškození ledvin je klíčové, protože léčba vCKD1–2 může vést k zachování ledvin buď zvrácením nebo zpomalením progrese poškození ledvin [6]. V současné době nejsou dostupné testy moči schopny detekovat nízké úrovně poškození ledvin [7–14] a byly hodnoceny především u akutního poškození ledvin (AKI), se špatným rozlišením na CKD [9]. Existuje tedy kritická nesplněná potřeba vyvinout citlivou, kvantitativní, neinvazivní diagnostiku k detekci CKD 1–3. Včasná detekce a včasná léčba CKD by zmírnily globální zátěž nemocí a snížily masivní finanční zátěž národních rozpočtů zdravotní péče [15–21].

The primary aim of this study was to perform an assessment of multiple novels and known urine biomarker measurements to conduct an inexpensive, portable assay, called the Kidney Injury Test (KIT) in consecutive patients presenting with CKD at a large tertiary health care system, and develop and independently validate a quantitative KIT Score to reflect the diferent CKD stages. The KIT assay performance was also directly compared to the current standard of care tests (eGFR and proteinuria). A secondary aim was to explore the accuracy of the KIT assay to detect and quantitate kidney injury in CKD 1–2, i.e., subjects with normal eGFR (>60), ale s predisponujícími rizikovými faktory pro CKD. Tato zpráva popisuje proces výběru biomarkerů, vývoj algoritmu a nezávislou validaci skóre KIT jako nové diagnostiky pro hodnocení a kvantifikaci raného i pozdního stadialedvinapoškození.

2. Experimentální část

2.1. Výběr pacienta

Reziduální náhodná skvrnitá moč byla shromážděna od 1169 po sobě jdoucích pacientů z klinických laboratoří na Kalifornské univerzitě v San Franciscu (UCSF), během 3 měsíců, od října 2016 do ledna 2017, jako součást rutinního klinického testování na Parnassus a Mission Bay. kampusové klinické laboratoře. Výběr vzorků pro diagnostiku CKD byl obohacen o výběr vzorků moči získaných z nefrologické, diabetologické nebo kardiologické kliniky UCSF. Pro usnadnění statistické síly byla studie obohacena o pacienty se zvýšeným rizikem onemocnění ledvin pomocí následujících kritérií: pacient měl potvrzenou diagnózu CKD (kód ICD10 N18 [22]), žádnou diagnózu CKD, ale současnou diagnózu diabetu , hypertenze nebo autoimunitní onemocnění, bez CKD, ale s pozitivní rodinnou anamnézou CKD, bez CKD, ale ve věku nad 60 let nebo ze statusu etnické menšiny. Pacienti s AKI nebyli do této studie zahrnuti s následujícím zdůvodněním: (1) tato první studie na KIT je zaměřena na vývoj a validaci kvantitativních a funkčních metrik KIT skóre v chronickém kontinuu progrese onemocnění ledvin. AKI má odlišnou trajektorii s akutním nástupem a ústupem; (2) AKI může mít úplné nebo neúplné vymizení poranění, takže snížení KIT skóre po vyřešení AKI se stane klinicky interpretovatelné, když rozsahy KIT skóre budou v tomto dokumentu stanoveny pro různá funkční stadia CKD; (3) AKI je jednou z příčin rizika CKD, ale většina případů CKD, jako je diabetes a hypertenze, nezačíná AKI. Jako navazující studie je plánována studie KIT Score v AKI.

Pro účely vývoje KIT Score byla relevantní příčina CKD nebo predisponující rizikový faktor pro CKD zachycena z elektronických zdravotních záznamů (EHR) spolu s demografickými proměnnými a SCr, aby bylo možné vypočítat eGFR [23]. U každého pacienta byla přítomnost a příčina onemocnění ledvin potvrzena klinickým přehledem lékařských a laboratorních záznamů. Nejčastějšími příčinami CKD v této kohortě byly: imunitně zprostředkovaná systémová onemocnění, která mohou způsobit poškození ledvin (jako je lupusová nefritida, revmatoidní artritida, Sjogrenův syndrom), hypertenze, diabetes (typ 1 a 2), glomerulární onemocnění (tyto případy byly biopsie potvrzená IgA nefropatií, membranoproliferativní glomerulonefritidou nebo fokální segmentální glomerulosklerózou) a obstrukční uropatií (neurogenní měchýř, zadní uretrální chlopně a hydronefróza). V kohortě pacientů s CKD mělo 74,8 procent pacientů 2 nebo více klinických diagnóz, které by byly relevantní pro rozvoj a progresi CKD, zatímco 13,3 procent pacientů mělo diabetes a hypertenzi jako duální rizikové faktory poškození ledvin při absenci klinické diagnózy CKD. , což odráží vysokou prevalenci těchto komorbidit v běžné populaci. Příčina CKD nebyla odfiltrována a byly zachyceny všechny přispívající příčiny CKD.

To avoid degradation of the biomarkers in the KIT assay, urine samples were either processed within an hour of collection or stored at 4 C and processed within 24 h. Samples were discarded or not included for analysis in this study if the sample volume was less than 2 mL, there were insufficient data to confirm patient CKD diagnosis, or there was a>24h zpoždění ve zpracování vzorku z logistických důvodů. Po výše uvedeném procesu filtrace jsme měli konečný výběr 343 unikátních vzorků moči od 343 pacientů. Získali jsme také další vzorky moči od 54 zdravých kontrol vybraných od dobrovolníků, kteří měli dobrý zdravotní stav, s normálním SCr, bez proteinurie a bez identifikovatelných rizikových faktorů CKD. Studie se držela Helsinské a Istanbulské deklarace a byla schválena institucionálním kontrolním výborem UCSF (IRB 16-21108) a IRB od požadavku informovaného souhlasu upustila.

2.2. Metody testu KIT

2.2.1. Zpracování vzorku

Vzorky moči byly odebírány do sterilních nádob (čistý záchyt, prázdnota ve středním proudu), bez ohledu na mikro- nebo makroskopickou hematurii nebo proteinurii. Vzorky moči byly centrifugovány při 2000× g po dobu 30 minut při 4 oC. Supernatant byl oddělen od pelety moči obsahující buňky a zbytky buněk. pH supernatantu bylo upraveno na 7,0 pomocí Tris-HCl a skladováno při _80oC v UCSF Biorepository až do další analýzy.

2.2.2. Biomarkery KIT

KIT zavádí normalizovaná měření 6 primárních biomarkerů moči. Prvním biomarkerem byla bezbuněčná DNA (cfDNA): jako míra celkové apoptotické zátěže poškození ledvin [24], měřeno patentovanou 5' biotinylovanou oligonukleotidovou komplementární chemiluminiscenční imunosondou pro specifické cílení fragmentů cfDNA při poškození ledvin [25]. Tento přístup překonává omezení časově náročného zpracování vzorků, nákladné PCR amplifikace [26], detekce SNP ([27,28] nebo metody sekvenování DNA [29], jinak používané k měření cfDNA v krvi [27,30]. Markery měřené metodou ELISA zahrnují methylovanou cfDNA (m-cfDNA), aby se zpřesnil podíl cfDNA, který může být relevantnější pro poškození renálního parenchymu [31,32]; CXCL10 jako marker zánětu [33–37]; klusterin jako marker renálního tubulárního poškození [38,39], celkový protein jako pozdní marker glomerulárního poškození [40,41] a kreatinin jako normalizační marker, protože může být ovlivněn tělesnou hmotou, výživou a/nebo hydratací a využit. abychom se vyhnuli nutnosti časovaného sběru moči [42,43].

2.3. Statistická analýza

2.3.1. Vývoj skóre KIT

Náhodný výběr vzorků byl použit k rozdělení 397-kohorty pacientů do cvičné (n=233, s 37 zdravými kontrolami) stratifikované podle stavu poškození ledvin. Náhodné modelování lesa bylo použito k identifikaci vztahů mezi různými markery pro detekci CKD s vysokou citlivostí. Prediktivní modely byly trénovány pomocí statistických metod a metod strojového učení pro vývoj algoritmu KIT Score, napříč všemi šesti vybranými DNA a proteinovými biomarkery a multidimenzionální rozdělení těchto testových měření bylo založeno na identifikovaných klinických prahových hodnotách začleněním SCr a dalšího známého rizika. proměnné pro CKD, jako je rasa, pohlaví a věk. Nakonec byl do skóre KIT vyvinut jednoduchý lineární model zahrnující výsledný oddíl s dalším prahem pro hodnocení nízkého a vysokého rizika CKD.

2.3.2. Ověření skóre KIT

Nezávislá validační podskupina 164 pacientů se 17 zdravými kontrolami byla následně použita k prospektivní validaci předem specifikovaného testu KIT a skóre KIT. Logistická regrese byla použita k porovnání (úplného) modelu se současným standardem testů péče, samotnou bílkovinou v moči a eGFR. Hodnota p < 0.01="" pro="" odpovídající="" test="" poměru="" pravděpodobnosti="" byla="" považována="" za="" významnou.="" byly="" provedeny="" logistické="" regresní="" analýzy="" k="" posouzení="" přesnosti="" předem="" specifikovaného="" prahu="" skóre="" kit="" pro="" kategorické="" (nízké="" a="" vysoké)="" rizikové="" skupiny="" skóre="" kit.="" byla="" vypočtena="" citlivost="" a="" specifičnost="" výsledného="" kvantitativního="" a="" kvalitativního="" skóre="" kit="" spolu="" s="" 95procentním="" intervalem="">

T-test and logistic regression were used to compare the pre-defined KIT Score and model patient status (individuals predisposed to CKD versus healthy subjects), to assess its ability to distinguish subjects with early stages of CKD (eGFR 60–90, CKD 2) and normal eGFR but with predisposing risk factors for developing kidney damage (>90, CKD 1), od zdravých dobrovolníků (eGFR > 90), kteří nemají žádné známé predisponující rizikové faktory. Hodnota p < 0,01="" byla="" považována="" za="">

3. Výsledky

Z 1169 přijatých pacientů a odebraných vzorků moči 201 vzorky splnily vylučovací kritéria nízkého objemu moči a byly tříděny z další analýzy, takže zbylo 968 pacientů (demografické údaje v tabulce 1). Distribuce proteinurie u těchto 968 pacientů (0 až 5469,73; medián (IQR) 4,69 (0–39,11) mg/mmol) a rozsah eGFR (vypočteno pro všechny pacienty s CKD [23] (obrázek 1C) ) zdůrazňuje, že jsme zachytili spektrum onemocnění CKD (obrázek 1A). Z této kohorty 397 unikátních pacientů a vzorků přežilo vylučovací kritéria (viz Metody). Etiologie jejich poškození ledvin zahrnovala široký a mnohočetný rozsah onemocnění, přičemž hypertenze byla příčinou u 42 procent pacientů (obrázek 1B). Více než 60 procent pacientů mělo k poškození ledvin více než jednu příčinu. Vzhledem k tomu, že toto je realita u většiny pacientů s CKD, zvláště když progredují do pozdějších stadií CKD, bylo skóre KIT modelováno tak, aby detekovalo poškození ledvin bez ohledu na základní příčinu. Navzdory tomu, že proteinurie je současným zlatým standardem pro neinvazivní hodnocení poškození ledvin, neexistovala žádná korelace mezi eGFR a poměrem protein/kreatinin v moči (R2=0.0087) a jak ukázali jiní výzkumníci [44 ], proteinurie byla špatná při kategorizaci stádií CKD (obrázek 2).

Primárním cílem této studie bylo vyvinout kompozitní škálování KIT skóre od {{0}} (nízké riziko) do 100 (vysoké riziko) a prospektivně posoudit schopnost kvantitativního skóre KIT pro detekci poškození ledvin s vysokým stupněm citlivosti a specifičnosti. Ukazujeme, že ačkoli současná měření renálních funkcí (eGFR a proteinurie) jsou prediktivní pro pozdní stadium CKD (tabulka 2), kvantitativní škálování KIT skóre od 0 (nejnižší riziko) do 100 (nejvyšší riziko) poskytuje prediktivní informace

na stav poškození ledvin nad rámec proteinurie a samotné funkce ledvin (poměr pravděpodobnosti x {{0}} 0,507, p-hodnota < 0,0001)="" a="" překonává="" současný="" standard="" testů="" péče="" (tabulka="" 3).="" kreatinin="" v="" moči="" se="" používá="" pro="" účely="" normalizace="" v="" algoritmu="" kit="" a="" kontrolách="" pro="" diurnální="" variace="" a="" hydrataci="" (čímž="" odpadá="" nutnost="" jakéhokoli="" časovaného="" odběru="" vzorků="" moči)="" a="" nebyl="" významný="" pro="" stadium="" ckd="" v="" multivariačních="" analýzách="" (p-hodnota="0).">

We also developed a qualitative KIT Score, an approach that can have important implications for population kidney risk assessment. A pre-defined risk threshold of 18.5 was established in the training data, allowing the separation of the KIT Scores into low (s18.5) and high risk (>18.5) skupiny poškození ledvin. To bylo potvrzeno v testovací sadě, aby poskytla prediktivní informace o stavu poškození ledvin nad proteinurií a eGFR i mimo něj (poměr pravděpodobnosti byl x=44,244, p-hodnota <>

Odhadovaná citlivost a specifičnost skóre KIT pro detekci CKD je 97,3 procent (bootstrap 95 procent CI: 94,6, 99,3 procent) a 94,1 procent (bootstrap 95 procent CI: 82,3, 100 procent). Naproti tomu senzitivita a specifičnost proteinurie byla u stejných vzorků 46,9 procenta (bootstrap 95 procent CI: 38,8, 55,8 procenta) a 88,2 procenta (bootstrap 95 procent CI: 70,6, 100 procent). Podobně byla citlivost SCr 65,6 procent (bootstrap 95 procent CI: 57,4, 73,8 procent). Odhad negativních a pozitivních prediktivních hodnot KIT skóre je závislý na míře prevalence onemocnění, proto lze jako příklad použít míru prevalence hypertenze. Prevalence hypertenze v běžné populaci USA je přibližně 33 procent. V důsledku toho by odhadovaná pozitivní a negativní prediktivní hodnota kvantitativního skóre KIT pro hypertenzi byla ~89,1 procenta a 98,2 procenta.

Níže uvádíme příspěvek jednotlivých biomarkerů ke skóre KIT (tabulka 4). Množství cfDNA v moči bylo vysoce variabilní napříč různými kategoriemi renálního onemocnění a nezávisle nekorelovalo se stádiem CKD. Korelace mezi jednotlivými biomarkery byly malé (největší korelace R2=0.14 byla mezi eGFR a proteinem), což naznačuje, že každý z biomarkerů poskytuje nezávislé informace k predikci stavu poškození ledvin. Analýzy hlavních složek (PCA) (obrázek 2B) objasňují vztah nezávislých lineárních kombinací biomarkerů k celkové variabilitě měření v testu a zdůrazňují důležitý příspěvek m-cfDNA, cf-DNA a CXCL10 jako nezávislé hodnoty v generace složeného skóre KIT. Clusterin byl jediným biomarkerem stavu poškození ledvin, který nebyl významný v multivariačních analýzách (p-hodnota=0.1671). Tyto faktory zdůrazňují, že navzdory publikovaným údajům o korelacích mezi množstvím krevní cfDNA a dysfunkcí ledvin [27,28] by močová cfDNA v těchto podmínkách sama o sobě nestačila a že je užitečné zahrnout více biomarkerů pro vývoj složeného skóre KIT pro posouzení CKD.

CXCL10 is a key inflammatory cytokine dysregulated in immune-mediated renal injury [45–51]. To evaluate where CXCL10 identifies a specific cause of CKD, such as immune-mediated causes of renal injury from systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-positive vasculitis, we evaluated which CKD categories had a high abundance of urinary CXCL10. Interestingly, only ~30% of the immune-mediated cohort had very high CXCL10 values (>100 pg/ml), zatímco u mnoha vzorků imunitně zprostředkovaného poškození ledvin byly tyto hodnoty nízké a mohou odrážet remisi onemocnění nebo expozici imunoterapii. K našemu překvapení ~ 30 procent hypertenzních a diabetických kohort mělo také vysoké hladiny CXCL10 v moči, bez jakýchkoli identifikovaných systémových imunitně zprostředkovaných onemocnění. Mezi hladinami CXCL10 v moči a stádiem CKD nebyla žádná souvislost.

Figure 2C displays the KIT Score, shown here as a function of CKD stage (based on the eGFR) and matched with presence (red dots) or absence (black dots) of proteinuria (threshold cut of urine protein/creatinine ratio of >0.2). The healthy controls are marked in green and are shown in a pre-CKD 1 or CKD 0 stage where the eGFR is >90 ml/min/1,73 m2 jako u CKD 1, bez proteinurie nebo identifikovaného rizika poškození ledvin. Je důležité poznamenat, že ~ 15 procent zdravých kontrol zde testovaných má mírné zvýšení skóre KIT (těsně nad prahem vysokého rizika 18,5). V této fázi studie nemůžeme identifikovat, zda tyto zdravé kontroly s vyšším skóre KIT mají neodhalené rizikové faktory pro poškození ledvin, protože všichni jedinci byli deidentifikováni.

Tabulka 5 ukazuje rozdělení průměrného skóre KIT podle stádia CKD au zdravých dobrovolníků a zaznamenali jsme významnou trajektorii zvyšování skóre KIT postupujícím stádiem CKD. Skóre KIT dokáže snadno rozlišit CKD 1 a 2 (28,9; 95procentní CI: 27,9, 29,9) od zdravých dobrovolníků bez CKD (11.0; 95procentní CI: 9,5, 12,6); p-hodnota < 0.00001).="" ve="" srovnání="" se="" zdravými="" kontrolami="" existuje="" silná="" souvislost="" mezi="" skóre="" kit="" a="" predispozicí="" k="" poškození="" ledvin,="" a="" to="" i="" u="" subjektů="" s="" normální="" funkcí="" ledvin="" v="" ckd="" 1="" (egfr=""> 90), s poměrem pravděpodobnosti x=148.4 (LR p-hodnota < 0,0001)="" a="" práh="" testu="" 18,5="" měly="" senzitivitu="" a="" specifičnost="" 92,9="" (přesná="" 95%="" ci:="" 87,0="" procenta,="" 96,7="" procenta)="" a="" 94,4="" procenta="" (přesná="" 95procentní="" ci:="" 84,6,="" 98,8="" procenta),="" v="" tomto="" pořadí="" tento="" stejný="" efekt="" byl="" dále="" zesílen="" pro="" schopnost="" testů="" kit="" detekovat="" ckd="" 1="" i="" 2,="" s="" poměrem="" pravděpodobnosti="" x="196,5" (lr="" p-hodnota="">< 0,0001),="">

the >18.5 KIT Score threshold having a sensitivity of 95.8% (exact 95% CI: 92.2, 98.1%) for early CKD detection. A total of 60% of patients in CKD 1 have elevated KIT Scores >18,5, přestože mají „normální“ renální funkce a nemají proteinurii. Toto jsou přesně ti cíloví pacienti, které chceme pomocí testu KIT zachytit, protože jejich rané stádium CKD by současné testy standardní péče neodhalily. Ve skutečnosti skóre KIT identifikuje 92 procent pacientů s CKD 1, kteří nemají proteinurii, jako pacienty s časným poškozením ledvin. U CKD 2–3, ačkoli přibližně 60 procent pacientů nemá žádnou proteinurii, skóre KIT detekuje všechny pacienty jako vysoce rizikové a poskytuje různá kvantitativní měření zátěže poranění CKD každého pacienta. U CKD 4–5 jsou proteinurie a skóre KIT více shodné, protože poškození ledvin je pokročilé a proteinurie je rozpoznána jako pozdní marker poškození ledvin.

Tyto souhrnné výsledky tedy jasně demonstrují, že test dosahuje svých primárních a sekundárních cílů předpovídat poškození ledvin s větší citlivostí než současný standard testů péče (eGFR, SCr, proteinurie), a na rozdíl od našich současných klinických testů může skóre KIT přesně identifikovat velmi raná stadia CKD v populačních screeningech.

4. Diskuze

Hnací silou vývoje testu KIT a skóre KIT bylo uznání masivního a rostoucího břemene nerozpoznaného poškození ledvin [52], ke kterému se přidala slabost současných standardů testů péče [53] při odhalování skutečné a „skryté“ břemeno onemocnění ledvin. Sledování poškození ledvin u jednotlivců pomocí odběru vzorků moči bylo vždy vysoce žádoucím cílem, protože biologický signál z moči může poskytnout vysoce informativní okno do zdraví ledvin. Nicméně test moči k predikci poškození ledvin, bez ohledu na základní příčinu, zůstává klinicky nenaplněnou potřebou a biochemickou výzvou k provedení, protože v moči je mnoho interferujících látek, jako jsou proteázy [54,55], což vede k degradaci biomarkerů a vysoká interindividuální variabilita pH moči – to vše může zmást vývoj robustního laboratorního testu. Cílené proteomické studie [56–59], podporované protokolovaným odběrem moči z prospektivních klinických studií, trvajících deset let (v našich laboratořích na Stanfordské univerzitě a UCSF), vedly k vývoji standardních operačních postupů (SOP) pro sběr moči, stabilizaci , zpracování, hodnocení rušivých látek, konzervace a transport ze vzdálených míst do centrální zpracovatelské laboratoře [60]. Kromě toho více než deset let transkripčních a LC-MS/MS založených proteomických studií moči [48,50,58,61–64] vedlo k hlubšímu biologickému pochopení poškození ledvin napříč různými příčinami CKD, což vedlo k výběru biomarkerů pro zahrnutí do testu KIT, aby reprezentovaly poškození v různých intrarenálních kompartmentech.

Toto komplexní hledání nás vedlo k šesti biomarkerům: cDNA, methylovaná cfDNA, klusterin, CXCL10, kreatinin a urinární protein. Bezbuněčná DNA byla rozpoznána jako citlivý marker zátěže onemocněním v plazmě pacientů s autoimunitními onemocněními [65,66] a nádory [67]. Jejich využitelnost v plazmě je však omezena v podmínkách mnoha onemocnění a morbidit, protože celková zátěž cfDNA by odrážela kumulativní procesy různých onemocnění, zatímco orgánově nebo místně specifické měření bezbuněčné DNA v plazmě vyžaduje pokročilé sekvenační technologie a bioinformatika [68,69]. Protože však cfDNA v moči specificky odráží příspěvky ledvin, umožňuje stanovení cfDNA KIT extrémně citlivou detekci poškození ledvin pomocí levného testu založeného na ELISA. Měření metylovaných fragmentů cfDNA poskytuje další specifičnost ohledně typu poranění. Zatímco globální hypermetylace byla spojena s imunitním poškozením ledvin a zvýšenou fibrózou, globální hypomethylace je spojena s poklesem ledvin souvisejícím se stárnutím a renálním ischemicko-reperfuzním poškozením [31,32,70]. Stejně jako u našeho zdůvodnění při měření cfDNA jsme zjistili, že globální změny v methylačním stavu cfDNA umožňují přesné rozlišení mezi stavy onemocnění ledvin bez potřeby loci-specifického sekvenování nebo PCR.

CXCL10 se dobře osvědčil jako marker imunitně zprostředkovaného poškození v různých kontextech díky své roli jako ligandu pro receptor CXCR3 [33,34,37,45,51,71]. Již dříve jsme ukázali, že CXCL10 a cfDNA, měřené pomocí testu KIT, mohou detekovat chronickou dysfunkci plicního aloštěpu při transplantaci plic i rejekci při transplantaci ledvin [35,72,73]. V této studii jsme překvapivě zjistili, že existuje významný počet pacientů s tradičně neimunitními onemocněními ledvin, jako je hypertenze a diabetes typu 2, kteří měli zvýšené CXCL10, což potenciálně ukazuje na širší využití při detekci časných stádium poškození ledvin. Předchozí studie zjistily, že diabetes 2. typu má významnou složku zprostředkovanou CXCL{18}} [74] a identifikovaly CXCL10 produkovaný endoteliálními buňkami jako přispěvatel k esenciální hypertenzi [75]. Naše zjištění naznačují, že CXCL10 dokáže identifikovat nejen pacienty s imunitně zprostředkovaným poškozením ledvin, ale také pacienty s jinými příčinami, které mají tendenci se záludně projevovat pozdními klinickými příznaky souvisejícími s progresí onemocnění.

Celkový protein v moči a klusterin jsou dobře zavedené markery dysfunkce ledvin [38,40,41] a kreatinin je v oboru dobře validován jako normalizační biomarker [42,43]. Překvapivě jsme zjistili, že klusterin po multivariačních analýzách není v našem modelu poškození ledvin v kontextu našich dalších biomarkerů významný. To může být způsobeno řadou příčin, včetně jeho korelace s poměrem celkového proteinu ke kreatininu, jehož složky jsou již v modelu zahrnuty [38], a také vysokou bodovou variací způsobenou ultradiánními rytmy těsně korelovaly hladiny klusterinu v plazmě a v moči [76,77].

Včasná detekce poškození ledvin má velmi důležité důsledky pro omezení rychlosti progrese CKD a pozitivní dopad na zdravotní péči na celém světě. Vzhledem k tomu, že hemodynamické změny ledvin jsou akutně citlivé na systémové poruchy, okamžitým přínosem by bylo zlepšení léčby hlavních příčin CKD, zejména zlepšená a přísná kontrola krevního tlaku [78], stabilita a přísná kontrola hyperglykémie [79] a včasná detekce a okamžitá imunomodulace k odstranění renálního zánětu a poškození u imunitně zprostředkovaných systémových onemocnění, jako je systémový lupus erythematodes [80] a revmatoidní artritida [81]. Přetrvávající a časné zvýšení skóre by mohlo spustit zobrazování ledvin k vyhodnocení obstrukční uropatie, s okamžitou intervencí k prevenci vysokého intrarenálního tlaku a progresivní renální intersticiální fibrózy a tubulárního výpadku. Včasná detekce poškození ledvin s největší pravděpodobností nastane v prostředí primární péče, kde dostupnost rychlého, jednoduchého testu s kvantitativním odečtem skóre rizika ledvin může vyvolat dřívější odeslání k nefrologovi ke kontrole krevního tlaku, dietnímu modifikace, léčba koronárního a/nebo periferního vaskulárního onemocnění, základní příčina CKD a zvážení renálních konzervačních terapií [82,83]. Schopnost kvantitativně sledovat rozlišení KIT skóre v průběhu času poskytuje příležitost sledovat řešení poškození ledvin. Kromě možnosti použití léků nebo podpory k lepší kontrole systémového onemocnění nové renoprotektivní léky, jako jsou inhibitory SGLT2 a další [84], dále zdůrazňují, jak zásadní je být schopen detekovat velmi časné poškození ledvin, léčit a obrátit to.

Zpoždění detekce poškození ledvin a následně doporučení pacienta je významnou překážkou pro získání nových pacientů do účinných léčebných režimů, zatímco oni mají stále šanci maximalizovat přínosy renálních konzervačních terapií. Aby se zdůraznilo, kolik pacientů „propásne“ příležitost k diagnóze CKD v časnějších stádiích jejich onemocnění, pacienti s ESRD využívají pohotovostní oddělení v míře šestkrát vyšší, než je celostátní průměrná frekvence dospělých v USA – polovina z nich vede k přijetí do nemocnice. [85]. Kromě použití skóre KIT ke sledování zotavení ledvin má tedy obrovskou hodnotu použití tohoto testu také ke sledování progrese poškození ledvin, aby bylo možné podle potřeby zavést intervence ke stabilizaci progrese trajektorie skóre KIT. Pozorování, že třetina pacientů s CKD etiologií v důsledku hypertenze nebo diabetu má také silné imunitní/zánětlivé prostředí jako součást jejich poškození ledvin, naznačuje, že hodnocení biologické heterogenity různých kategoriálních onemocnění pomocí jednotlivých hodnot biomarkerů v testu KIT, a další vyšetřovací studie, umožní přizpůsobenější přístupy k léčbě pacientů s CKD.

Probíhající studie jsou plánovány a probíhají, přičemž sériové hodnocení předem definovaného skóre KIT pomocí předem definovaného testu KIT nám umožní posoudit hodnotu jednotlivých biomarkerů v testu během poškození ledvin a zotavení ledvin. Kromě toho navazujeme spolupráci s farmaceutickými partnery, kde může být sériové hodnocení testu KIT použito jako prostředek k neinvazivnímu a přesnému sledování časného poškození ledvin nefrotoxicitou léčiv, která je vlastní mnoha imunomodulátorům, jako je kalcineurin. inhibitory [86] a anti-TNF činidla [87]; chemoterapeutika, jako je cisplatina [88], aminoglykosidy [89] a novější imunoterapie [90], stejně jako expozice radionuklidovým kontrastním látkám pro účely zobrazování [91]. Pro analýzu se shromažďují další kohorty, kde byli pacienti dlouhodobě sledováni v průběhu progrese CKD, což nám umožní lépe porozumět granulární trajektorii skóre KIT a případně pomoci zpřesnit stadia CKD.

Protože byly vybrány biomarkery testu a test byl vyvinut se specifickým záměrem detekovat velmi časné poškození ledvin, pozorovali jsme také, že test KIT dokáže detekovat, že malé procento „normálních“ kontrol zobrazuje skóre KIT v moči, které se pohybuje na vysokých hodnotách rizikový práh 18,5. I když to není potvrzeno, je možné, že se nejedná o šum testu a tyto případy jsou skutečně pozitivní s velmi časnou identifikací rizika poškození ledvin ve stádiu pre-CKD 1 nebo CKD 0. Vzhledem k tomu, že 96 procent lidí s chronickým onemocněním ledvin si neuvědomuje, že ho mají [92], jedním z významných problémů při vývoji modelů poškození ledvin je vysoká pravděpodobnost, že pacienti přijatí jako zdravá kontrolní skupina skutečně trpí onemocněním ledvin v časném stadiu. Například projekt lidské dlouhověkosti, vedený Craigem Venterem s testem Health Nucleus, rozsáhle sekvenoval a provedl další screeningové testy dospělých bez příznaků a našel klinické koreláty potenciálního onemocnění u 21 procent jejich „zdravých“ účastníků studie, včetně urologických /onemocnění ledvin, což naznačuje potřebu zvýšeného screeningu. To platí zejména o onemocněních, kde včasný zásah může oddálit nebo dokonce zvrátit progresi onemocnění. Shledáváme CKD a poškození ledvin jako celek jako příklad onemocnění, u kterého to platí, protože četné životní styly a terapeutické intervence mohou zabránit další progresi poklesu funkce ledvin [6,82,83,92].

Omezením současného designu studie je použití populace obohacené o subjekty s CKD z místa terciární péče. Subjekty získané z více screeningu a komunitního prostředí mohou být reprezentativnější pro běžnou populaci, zejména pro detekci raného stadia CKD. Kromě toho byla studie průřezová a nemusela plně reprezentovat časné a pozdní stadium CKD. Plánují se longitudinální studie sledující pacienty se známkami raného stadia CKD za účelem lepšího posouzení schopností časné detekce KIT skóre a vlivu časné detekce na progresi CKD. Konečně může být možné dále rozšířit skóre KIT o další biomarkery, aby bylo možné zlepšit diferenciální diagnostiku CKD a minimalizovat potřebu měření sérového kreatininu a proteinurie.

Pozitivní ekonomický dopad včasné detekce poškození ledvin a jeho léčby nelze podtrhnout. Téměř třetina rozpočtu Medicare je věnována na léčbu poranění a onemocnění ledvin v USA. Ztráta funkce ledvin u CKD 5 zvyšuje fiskální zátěž o ~80 $,000 ročně kvůli podpoře dialýzy. Ačkoli transplantace ledvin umožňuje pacientům vystoupit z dialýzy, nedostatek dárců ledvin, žijících i mrtvých, transplantace ledvin s počáteční cenou ~100 $,000, následovanou náklady na udržovací léky ve výši ~20 $,{{ 6}}/rok, vede pouze k malému snížení rozpočtu na dialýzu Medicare [93]. Očekává se, že trajektorie počtu pacientů s CKD bude celosvětově dále stoupat, s rostoucím trendem obezity, což povede ke zvýšení počtu lidí s hypertenzí a diabetem [94]. Kromě toho etnické rozdíly v onemocnění ledvin způsobují problémy národní zdravotní péče, což vyžaduje screening populace pomocí biopsií ledvin pro včasnou detekci poškození ledvin způsobené onemocněním ledvin IgA v jihovýchodní Asii [95], kde je onemocnění ledvin IgA hlavní příčinou selhání ledvin. . Zahrnutí citlivého neinvazivního testu na poškození ledvin, který by nahradil invazivní, nákladné a vysoce morbidní bioptické postupy, by mělo pro tyto rizikové populace za následek významné socioekonomické výhody.

Cistanche tubulosa zabraňuje onemocnění ledvin a zranění, klikněte sem a získejte vzorek

Závěrem lze říci, že tato studie poskytuje plán pro biomarkery testu KIT, proces vývoje algoritmu testu KIT, definici skóre KIT a jeho výkonnost pro včasnou detekci poškození ledvin a jeho přímé srovnání se současným standardem testů péče. Tato studie navrhuje, že by KIT test mohl být použit (1) jako screeningový test, pokud existuje obava ze souběžných onemocnění, o kterých je známo, že zvyšují riziko CKD, jako je kardiovaskulární morbidita, obezita, diabetes, bez dokumentace abnormálních ledvin funkce současnými testy; (2) jako doplňkový test ke sledování zátěže a přesné progrese CKD u pacientů, u kterých současné testy standardní péče již odhalily poškození ledvin, tj. u pacientů se známým preexistujícím CKD v různých stádiích onemocnění ledvin; (3) umožnit citlivé posouzení zotavení z poškození ledvin při vystavení různým renoprotektivním terapiím a možnostem léčby. Jsou potřebné a plánované další studie pro longitudinální screening pacientů v průběhu času, aby bylo možné lépe porozumět přirozené historii progrese CKD, výhodám včasné detekce, intervence a monitorování a infekčním bodům, kde se poškození CKD fixuje a progreduje. .

Příspěvky autora:MMS, JYCY, DW a TKS navrhly studii a experimenty; JML, ID, VL, SS, DL, KS, RS, AC, PC.L. a ML, provedli experimenty; DW, JYCY, RDS a MMS analyzovaly data; DW, JYCY a MMS vytvořily údaje; JYCY, DW, RDS, TKS a MMS vypracovaly a revidovaly tento dokument; všichni autoři rukopis kriticky revidovali z hlediska důležitého intelektuálního obsahu a schválili konečnou verzi rukopisu. MMS měla plný přístup ke všem datům ve studii a přebírá odpovědnost za integritu dat a přesnost analýzy dat.

Financování:MMS a TKS mají výzkumnou podporu od NIH (NIAID a NIDDK). Financovatelé neměli žádnou roli při návrhu studie, sběru dat, analýze, rozhodování o publikování nebo přípravě rukopisu.

Poděkování:Jsme vděční za pomoc lékařů, klinických koordinátorů, výzkumného personálu, pacientů a rodin pacientů.

Střet zájmů:MMS, DW a JYCY jsou zakladateli společnosti KIT Bio, Inc. (Los Altos, CA, USA), jejíž IP je výlučně vlastněno Regents, University of California San Francisco a licencováno společnosti KIT Bio. Všichni ostatní autoři neprohlašují žádný střet zájmů

1. KIT Bio, 665 3rd Street, San Francisco, CA 94107, USA; drew@kit.bio (DW); joshua.yang@ucsf.edu (JYCY)

2. Katedra chirurgie, University of California San Francisco, San Francisco, CA 94143, USA;

reuben.sarwal@ucsf.edu (RDS); tara.sigdel@ucsf.edu (TKS); juliane.liberto@ucsf.edu (JML);

izabella.damm@ucsfmedctr.org (ID); victorialouie11@gmail.com (VL); shristisigdel@gmail.com (SS); peichen@berkeley.edu (P.-CL)

3. Masters in Translation Medicine Program, University of California Berkeley, Berkeley, CA 94720, USA; devonlivingstone@berkeley.edu (DL); katherine_soh@berkeley.edu (KS); archakra@berkeley.edu (AC); liangmichael@berkeley.edu (ML)

Reference

1. KDIGO 2012. Směrnice klinické praxe pro hodnocení a léčbu chronického onemocnění ledvin; KDIGO: Brusel, Belgie, 2013.

2. Levin, A.; Stevens, PE Shrnutí pokynů KDIGO 2012 CKD: Zákulisí, potřeba vedení a rámec pro posun vpřed. Kidney Int. 2014, 85, 49–61. [CrossRef]

3. Levey, AS; Stevens, LA; Schmid, CH; Zhang, YL; Castro, AF; Feldman, HI; Kušek, JW; Eggers, P.; Van Lente, F.; Greene, T.; a kol. Nová rovnice pro odhad rychlosti glomerulární filtrace. Ann. Internovat. Med. 2009, 150, 604–612. [CrossRef] [PubMed]

4. Khati, NJ; Gorodenker, J.; Hill, MC Ultrazvukem vedené biopsie břicha. Ultrazvuk Q. 2011, 27, 255–268. [CrossRef] [PubMed]

5. Fried, LF Funkce ledvin jako prediktor nekardiovaskulární úmrtnosti. J. Am. Soc. Nephrol. 2005, 16, 3728–3735. [CrossRef]

6. Qaseem, A.; Hopkins, RH; Sweet, DE; Starkey, M.; Shekelle, P. Screening, monitorování a léčba CKD stadia 1 až 3: Směrnice pro klinickou praxi od CGC v AKT. Ann. Internovat. Med. 2013, 159, 835–847. [PubMed]

7. Mishra, J.; Dent, C.; Tarabishi, R.; Mitsnefes, MM; Ma, Q.; Kelly, C.; Ruf, SM; Zahedi, K.; Shao, M.; Bean, J.; a kol. Neutrofilní gelatináza-asociovaný lipokalin (NGAL) jako biomarker pro akutní poškození ledvin po srdeční operaci. Lancet 2005, 365, 1231–1238. [CrossRef]

8. Parikh, ČR; Jani, A.; Melnikov, VY; Faubel, S.; Edelstein, CL Močový interleukin-18 je markerem lidské akutní tubulární nekrózy. Dopoledne. J. Kidney Dis. 2004, 43, 405–414. [CrossRef] [PubMed]

9. Han, WK; Bailly, V.; Abichandani, R.; Thadhani, R.; Bonventre, JV Kidney Injury Molecule-1 (KIM-1): Nový biomarker pro poškození lidského renálního proximálního tubulu. Kidney Int. 2002, 62, 237–244. [CrossRef] [PubMed]

10. Matteucci, E.; Carmellini, M.; Bertoni, C.; Boldrini, E.; Mosca, F.; Giampietro, O. Rychlost vylučování močí z více renálních indikátorů po transplantaci ledviny: Klinický význam pro časné výsledky štěpu. Ren. Selhat. 1998, 20, 325–330. [CrossRef]

11. Lybarger, JA; Lichtveld, MY; Amler, RW Renální selhání Biomedicínské testování ledvin u osob vystavených nebezpečným látkám v životním prostředí. Ren. Selhat. 1999, 21, 263–274. [CrossRef]

12. Donadio, C.; Tramonti, G.; Lucchesi, A.; Giordani, R.; Lucchetti, A.; Bianchi, C. Gama-glutamyltransferáza je spolehlivým markerem tubulárních účinků kontrastních látek. Ren. Selhat. 1998, 20, 319–324. [CrossRef] [PubMed]

13. Nouwen, EJ; De Broe, ME Lidské střevo versus tkáňově nespecifická alkalická fosfatáza jako komplementární močové markery pro proximální tubuly. Kidney Int. Suppl. 1994, 47, S43–S51. [PubMed]

14. Gatta, A.; Mazzella, G.; Amodio, P.; Menon, F.; Angeli, P.; Schiaffino, E.; Schmid, C. Detekce časných kroků kadmiové nefropatie – srovnání světelných a elektronových mikroskopických obrazců s vylučováním enzymů v moči. Nephron 1989, 51, 20–24. [CrossRef] [PubMed]

15. Locatelli, F.; Del Vecchio, L.; Pozzoni, P. Význam včasného záchytu chronického onemocnění ledvin. Nephrol. Vytáčení. Transplantace. 2002, 17 (Suppl. 11), 2–7. [CrossRef]

16. Remuzzi, G.; Ruggenenti, P.; Perico, N. Chronická onemocnění ledvin: Renoprotektivní přínosy inhibice renin-angiotenzinového systému. Ann. Internovat. Med. 2002, 136, 604–615. [CrossRef]

17. Gansevoort, RT Příliš mnoho nefrologie? Epidemie CKD je skutečná a znepokojivá. PRO pohled. Nephrol. Vytáčení. Transplantace. 2018, 34, 577–580. [CrossRef]

18. Coresh, J.; Byrd-Holt, D.; Astor, BC; Briggs, JP; Eggers, PW; Lacher, DA; Hostetter, TH Povědomí o chronickém onemocnění ledvin, prevalence a trendy mezi dospělými v USA, 1999 až 2000. J. Am. Soc. Nephrol. 2005, 16, 180–188. [CrossRef] [PubMed]

19. Coresh, J.; Wei, GL; McQuillan, G.; Brancati, FL; Levey, AS; Jones, C.; Klag, MJ Prevalence vysokého krevního tlaku a zvýšené hladiny kreatininu v séru ve Spojených státech: zjištění ze třetího národního průzkumu zdraví a výživy (1988–1994). Oblouk. Internovat. Med. 2001, 161, 1207–1216. [CrossRef] [PubMed]

20. McClellan, WM; Rytíř, DF; Karp, H.; Brown, WW Včasná detekce a léčba onemocnění ledvin u hospitalizovaných diabetiků a pacientů s hypertenzí: Důležité rozdíly mezi praxí a publikovanými doporučeními. Dopoledne. J. Kidney Dis. 1997, 29, 368–375. [CrossRef]