Knockout myši Nlrc3 vykazovaly renální patologické změny po infekci HTNV

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Hantaan virus (HTNV) infikuje lidi a způsobuje hemoragickou horečkuledvinovésyndrom(HFRS). Vývoj dobře charakterizovaných zvířecích modelů HFRS by mohl urychlit testování kandidátských vakcín a terapeutických činidel a poskytnout užitečný nástroj pro studium patogeneze HFRS. Protože NLRC3 má více imunoregulačních rolí, zkoumali jsme náchylnost myší Nlrc3-/- k infekci HTNV, abychom vytvořili nový model HFRS. U myší Nlrc3−/− došlo ke ztrátě hmotnosti,ledvinové krvácení,a dilataci tubulů po infekci HTNV, rekapitulující mnoho klinických příznaků lidského HFRS. Navíc infikované myši Nlrc3−/− vykazovaly vyšší virovou zátěž v séru, slezině a ledvinách než myši divokého typu C57BL/6 (WT) a některé z nich vykazovaly více hematologických poruch a významných patologických změn ve více orgánech než myši WT. Naše výsledky ukazují, že u myší Nlrc3-/- infikovaných HTNV se mohou vyvinout klinické příznaky a patologické změny podobné pacientům s HFRS, což naznačuje nový model pro studium patogeneze a testování kandidátních vakcín a terapeutik.

klíčová slova:HFRS, HTNV, NLRC3, renální krvácení, dilatace renálních tubulů

ÚVOD

Hemoragická horečka sledvinovésyndrom (HFRS) představuje akutní intersticiální nefropatii po zoonotickém přenosu hantavirů z hlodavců na člověka. Onemocnění se vyskytuje především v Asii a Evropě (1, 2). Nejčastějšími patogeny způsobujícími HFRS jsou Dobrava virus (DOBV), Puumala virus (PUUV), Soul virus (SEOV) a Hantaan virus (HTNV), z nichž každý způsobuje jinou závažnost HFRS. Charakteristiky onemocnění se liší v Severní a Jižní Americe, kde infekce hantavirem způsobuje hantavirový plicní syndrom (HPS), zejména virem Andes (ANDV) a virem Sin Nombre (SNV) (3).

HFRS se vyskytuje s charakteristikou vysoké horečky, hypotenze,selhání ledvin a krvácení(4). Lze ji rozdělit do pěti klinických stadií: febrilní, hypotenzní šok, oligurický, diuretický a rekonvalescentní. Akutní epizoda infekce HTNV vedoucí k HFRS je často doprovázena trombocytopenií, leukocytózou, anémií, zvýšeným sérovým kreatininem a jaterními enzymy (5). Tyto klinické symptomy a příznaky lze částečně vysvětlit skutečností, že HTNV napadá především ledviny a vyvolává poškození ledvin charakterizované akutní tubulointersticiální nefritidou zahrnující infiltraci zánětlivých buněk (6), následně postihující řadu dalších orgánů (7).

Hlodavci jsou přirozenými rezervoáry pro hantaviry, které trvale infikují zvířata, aniž by způsobily onemocnění (8). Jejich exkrementy, jako jsou sliny, moč a výkaly, se stávají potenciálními kontaminanty, které mohou infikovat lidi, kteří vdechují aerosoly malých částic kontaminovaných exkrementů. Hantaviry obecně způsobují asymptomatické infekce u dospělých myší BALB/c a C57BL/6 (9), ale smrtelné neurologické onemocnění nebo přetrvávající infekce u sajících a novorozených myší (10, 11). Přestože u makaků cynomolgus infikovaných experimentálně PUUV (Macaca fascicularis) byly prokázány nefropatické abnormality, tato zvířata vykazovala pouze mírnou proteinurii, infiltraci imunitních buněk a tubulární poškození ledvin, podobně jako mírný případ HFRS (12). Kromě toho křečci infikovaní HTNV nazální cestou vedli k přetrvávající asymptomatické infekci, charakterizované sporadickou virémií, ale vysokými hladinami kopií virového genomu v plicích, mozku a ledvinách. Fretky infikované vysokou dávkou HTNV prostřednictvím svalové injekce vykazovaly postupný pokles tělesné hmotnosti (5-12 procent v průběhu času), ale neporušenéfunkce ledvin,nepřítomnost virémie a nedostatek přenosu viru do orgánů. U kosmanů vedla intramuskulární injekce HTNV k vysokému stupni sérokonverze a produkci neutralizačních protilátek; trvale tato zvířata neměla žádné poškození ledvin, virémii nebo přenos viru do orgánů (13).

Navzdory své nedokonalosti byly zvířecí modely využívající krysy a myši široce využívány ke studiu patogeneze hantavirů (14). Yoshimatsu a kol. prokázali, že infekce SCID myší HTNV způsobila letální chřadnoucí nemoc s plicním edémem (15, 16) a deplece neutrofilů bránila rozvoji plicního edému, ale nebyly nalezeny žádné charakteristické hemoragické léze HFRS (15). Shimizu a kol. zjistili, že HTNV izolovaná od pacientů s HFRS může infikovat 6-týdenní samice myší BALB/c intravenózně, což způsobuje virémii po dobu 6-9 dnů a vykazuje známky onemocnění včetně dočasné ztráty hmotnosti, vrásek vlasů, exsudace ledvin (17 ). Ve stejném myším modelu došlo k makroskopickému krvácení na hranici meziledvinová kůraa medulla, ale zda pozorované histopatologické změny byly spojeny se sníženou funkcí ledvin, nebylo zkoumáno. U humanizovaných myší vede infekce HTNV ke ztrátě hmotnosti, snížené aktivitě, rozcuchané srsti a poškození plic, což se zdá být hlavním cílovým orgánem pro virovou infekci (18). Proto je stále zapotřebí vhodný zvířecí model infekce HTNV, který zachycuje většinu chorobných rysů HFRS.

cistanche recenzeprodilatace renálního tubulu

NLR jsou nejvýznamnější rodinou intracelulárních vrozených imunitních receptorů a slouží odlišným funkcím při regulaci vrozené imunity. Ačkoli nejznámější NLR (např. NLRP3) vykazují pozitivní regulační funkci při zánětlivé a imunitní aktivaci, neobvyklá podskupina NLR, definovaná jako inhibiční NLR, vykazuje inhibiční funkci při zánětlivých odpovědích. Abychom porozuměli mechanismu vrozené imunitní suprese zprostředkované NLR, byly zkoumány ligandy pro inhibiční NLR, jako jsou NLRC3 a NLRX1 (19). NLRC3 je negativní regulátor, který zeslabuje odpověď interferonu typu I (IFN-I) sekvestrací a aktivací stimulátoru interferonových genů (STING) (19). NLRX1, jako centrální homeostatický strážce mezi mitochondriální biologií a imunologickou odpovědí, se podílí na širokém spektru nemocí, ať už řízených patogeny, nebo jiných (20). Protože onemocnění HTNV projevuje velkou dysregulaci zánětu a imunitní aktivace, vybrali jsme myši Nlrc3-/- ke zkoumání molekulárních mechanismů onemocnění.

Tato studie prokázala, že model myší Nlrc3−/− se podobá systematickému poranění pozorovanému u pacientů s HFRS, charakterizovaným trombocytopenií,dilatace renálních tubulů a krvácení.Analýza virové zátěže odhalila, že myši Nlrc3−/− vykazovaly vyšší virovou zátěž ve více tkáních, včetně séra, sleziny a ledvin. Naše studie vytvářejí myší model pro infekci HTNV užitečný pro hodnocení kandidátních vakcín a terapeutik.

METODY

Akcie VVirus

Kmen HTNV {{0}} byl darován Changshou Hang (Čínské centrum pro kontrolu a prevenci nemocí) a poté konzervován a rozšířen v naší laboratoři. Buňky Vero E6 byly použity pro propagaci viru a infekční titry byly kvantifikovány pomocí 50% infekční dávky pro tkáňové kultury (TCID50) imunofluorescenčními testy (IFA). Konverze mezi TCID50 a jednotkami tvořícími plaky (PSU) byla založena na následujícím výpočtu: 1 PFU ≈0,7×TCID50 (21).

generace modelu myši Nlrc3 Knockout

Divoký typ myší C57BL/6J a modely myší Nlrc3 knockout (Nlrc3−/− ) byly navrženy a vyvinuty společností Shanghai Model Organisms Center, Inc (Shanghai, Čína). Pro získání Nlrc3-/- myší byly Cas9 mRNA a sgRNA připraveny in vitro transkripcí. Dvě sgRNA zaměřené na odstranění exonů 2-3 genu Nlrc3: 5'- GTTGGTCTAATAAGCATCCTGGG {{10}}', 5'- TCCCATGAAACCATGTCAGAAGG -3'. Zygoty myší C57BL/6J byly přijaty a injikovány in vitro transkribovanou Cas9 mRNA a sgRNA a přeneseny na pseudotěhotné příjemce. Genotyp získaných F0 myší byl identifikován a potvrzen pomocí PCR a sekvenování pomocí párů primerů: F-5'- GTGATGTCTGCTTACC CCGTCTCC -3'; R-5'- GCCTGTGCCGCCTCTCA -3'. Křížením s C57BL/6J myšmi byly vybrány pozitivní F0 myši pro získání F1 heterozygotních Nlrc3 knockout myší. PCR a sekvenační analýza potvrdily získané F1 myši. Pro získání heterozygotních myší Nlrc3−/− byly samice a samci heterozygotních myší F1 náhodně kříženi. Ve všech studiích byly použity myši ve věku 6–8 týdnů.

Infekce zvířat a příprava vzorků

Celkem 5×105 PFU HTNV v 50 ul média bylo naočkováno intraperitoneální cestou. Myši v kontrolních skupinách dostaly stejná množství PBS. Bylo použito dvacet až dvacet pět myší Nlrc3-/- nebo WT. Každý typ myší byl rozdělen do pěti skupin pro odběr vzorků v 0, 3, 6, 9 a 12 dnech po infekci. Denně byly zaznamenávány tělesné hmotnosti a anální teploty. V každém časovém bodě bylo za účelem testování usmrceno čtyři až pět zvířat z obou skupin. Pro virologickou analýzu byly odebrány vzorky čerstvé tkáně ze srdce, jater, sleziny, plic, ledvin a mozku a poté okamžitě zmraženy na -80 stupeň. Myši byly perfundovány studeným PBS a orgány byly fixovány ve 4% paraformaldehydu po dobu 4 hodin pro histologickou a imunohistochemickou analýzu. Vzorek krve byl odebrán pro testování virové zátěže a rutinní vyšetření krve a sérum bylo izolováno pro biochemickou analýzu.

Cytokinový test

Celkem 25 ml séra od každé myši bylo testováno na 13 různých cytokinů pomocí LEGENDplex™ Mouse Anti-Virus Response Panel (13-plex) (BioLegend) podle pokynů výrobce. K detekci byl použit cytometr FACS Calibur (Becton Dickinson Biosciences, CA). Data byla analyzována pomocí LEGENDplex v8.0. Software.

Test RT-PCR v reálném čase

Vzorky tkání od každé myši byly zváženy a ponořeny do PBS a homogenizovány automatickým homogenizérem-TissueLyser II (QIAGEN, Německo), s použitím frekvence 30/sa času 5 min. Pro celkovou extrakci RNA byly 200 ml tkáňových homogenátů přeneseny do 50}0 ml činidla TRIzol, následovala extrakce chloroformem a vysrážení isopropanolem. 140 ml vzorků séra bylo přeneseno do 560 ml AVL pufru obsahujícího nosičovou RNA (Qiagen, UK) pro extrakci RNA pomocí sady QIAamp Viral RNA Mini (Qiagen, UK). Nakonec byla RNA znovu rozpuštěna ve vodě bez RNázy. Pro detekci virové RNA z každého vzorku byl proveden test RT-PCR specifický pro HTNV v reálném čase. Sekvence primerů specificky zacílené na segment HTNV byly přijaty následovně: F-5'- GATCAGTCACAGTCTAGTCA- 3' a R-5'-TGATTCTTCCACCATTTTGT-3'. Pro test qRT-PCR byl použit One-Step TB Green PrimeScript™ RT-PCR Kit II (Perfect Real Time) (Takara, Japonsko). Finální hlavní směs (20 ml) obsahovala 2 ml RNA, 5,6 ml dH2O bez RNázy, 0,8 ml dopředného a reverzního primeru (10 mM), 0,8 ml PrimScript 1 Step Enzyme Mix 2 a 10 ml 2×One Step TB Green RT-PCR Buffer 4. Použité podmínky cyklování byly 42 stupňů po dobu 5 minut, 95 stupňů po dobu 10 sekund, poté následovalo 40 cyklů 95 stupňů po dobu 0 sekund, 65 stupňů po dobu 15 sekund a 95 stupňů po dobu 0 sekund. Reakce byly spuštěny a analyzovány na platformě LightCycler (Roche Diagnostics, USA).

Absolutní kvantifikace virové zátěže

Oligonukleotidy virové RNA jako standard RNA byly získány in vitro transkripcí z DNA pomocí soupravy MAXIscript Kit (Thermo Scientific, UK), která obsahovala 562 bází HTNV RNA, na které byl test zaměřen (22), a poté kvantifikovány spektrofotometrem na ultramikromikroplatní ( BioTek Epoch, USA), koncentrace standardního zásobního roztoku RNA byla 800 ng/ml. Pro hodnocení virové zátěže v každém vzorku byla připravena standardní RNA s 10-násobným sériovým ředěním v rozsahu od 1010 kopií do 103 kopií na reakci. Naše standardní RNA má detekční limit 1010 kopií až 101 kopií na reakci, a proto jsme pro tento test nastavili práh detekce na 100 kopií genomu na reakci. V průběhu analýzy byly stanoveny standardní křivky se sklonem -3,6624, průsečík Y 41,68 cyklů a hodnotou R2 0,9996.

Analýza hladin proteinů metodou Western blotting

Tkáňové lyzáty byly připraveny ze vzorků myší tkáně. Pro detekci koncentrace proteinu byla použita souprava pro stanovení proteinu kyseliny bicinchoninové (BCA) (Thermo Scientific, UK). Pro analýzu proteinů bylo 30 mg celkového proteinu z každého vzorku naneseno na SDS-polyakrylamidový gel a přeneseno na NC membrány. Poté byl použit 5% roztok odstředěného mléka pro blokování při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Dále byla přidána 1:1000 zředěná monoklonální protilátka 1A8 proti HTNV-NP (připravená a purifikovaná naší laboratoří) (23, 24) a inkubována při 4 stupních přes noc. Nakonec byly membrány inkubovány se sekundárními protilátkami, HRP-konjugovaným králičím anti-myším IgG nebo HRP-konjugovaným myším anti-králičím IgG při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. K detekci proteinů byl poté přidán chemiluminiscenční substrát HRP. Denzitometrická analýza intenzity proteinového pásu byla provedena pomocí softwaru Image J (NIH, USA). b-aktin byl použit jako kontrola zatížení pro normalizaci.

Imunohistochemický test

Vzorky tkání byly zality v parafínu a nakrájeny na 4 mm pro imunohistochemické barvení. Řezy procházejí deparafinizací a rehydratací a inaktivací endogenních peroxidáz. Řezy byly podrobeny získávání antigenu v citrátovém pufru (PH=6) při 95 stupních po dobu 10 minut. Poté bylo použito 5% normální kozí sérum pro blokování při teplotě místnosti po dobu 40 minut. mAb 1A8 byla použita jako primární protilátka pro HTNV NP antigen a inkubována s tkáňovými řezy při 4 stupních přes noc. Poté následovalo barvení FITC anti-myším IgG (Invitrogen) při 37 stupních po dobu 1 hodiny a poté DAPI po dobu 10 minut při teplotě místnosti. Pro pořízení snímků byl použit 3DHISTECH (Maďarsko) a pro analýzu dat CaseViewer2.4.

Histologické vyšetření

Aby se zachovala buněčná a tkáňová morfologie, byl k fixaci vzorků tkáně pro histopatologickou analýzu použit 4% neutrální pufrovaný formalín. Tyto tkáně byly zpracovány na 5 mm řezy a poté obarveny hematoxylinem a eosinem (H&E). Nakonec byly řezy zkoumány světelnou mikroskopií a snímky byly zachyceny 3DHISTECH (Maďarsko), analyzovány pomocí CaseViewer2.4. Stupeň lézí byl hodnocen vizuálně pomocí předem nastaveného 4-systému stupňů: v normálních mezích jako 0, minimální jako 1, mírné jako 2, střední jako 3, závažné jako 4.

Studie na zvířatechVšechny pokusy na zvířatech byly schváleny Výborem pro laboratorní experimenty 4. vojenské lékařské univerzity Animal Center. (č. 20210403).

StatistikaData byla analyzována pomocí softwaru GraphPad Prism 9. Pokud není uvedeno jinak, všechny údaje byly prezentovány jako průměr ± standardní odchylka (SD). Byly použity t-testy nebo jednocestná ANOVA, jak je uvedeno v legendách obrázků. P-hodnota menší než 0,05 byla považována za významnou.

VÝSLEDEK

Detekce virové zátěže v různých orgánech myší Nlrc3−/− po intraperitoneální infekci HTNV

Aby se charakterizovala náchylnost myší Nlrc3−/− k infekci HTNV, byla skupina myší Nlrc3−/− intraperitoneálně infikována 5×105 PFU HTNV na myš s použitím myší WT jako kontroly. U všech zvířat byly denně sledovány klinické příznaky, změny teploty a tělesné hmotnosti. Myši byly usmrceny 3, 6, 9 a 12 dnů po infekci (dpi), aby se analyzovaly různé laboratorní parametry, virové zátěže a patologie. Myši Nlrc3−/− začaly hubnout na 4 dpi a při 6 dpi byl zaznamenán úbytek hmotnosti > 5 procent jejich počáteční tělesné hmotnosti. Pro srovnání, myši WT nevykazovaly žádnou ztrátu hmotnosti (obrázek 1A). V obou skupinách nebyla zaznamenána žádná horečka (obrázek 1B). Aby bylo možné vyhodnotit šíření a replikaci HTNV u myší s infekcí virem, bylo odebráno sérum a hlavní orgány (včetně srdce, jater, sleziny, plic, ledvin a mozku) pro absolutní kvantifikaci počtu kopií virové RNA. Výsledky ukázaly, že virémie se vyskytla na 3 dpi v obou skupinách (myši Nlrc3−/−: 943 ± 140 ekvivalentů kopií na ml; myši WT: 803 ± 277 kopií na ml). Pozoruhodné je, že sérová virová zátěž myší WT dosáhla vrcholu na 3 dpi a poté rychle klesla, zatímco u myší Nlrc3−/− si virová zátěž udržovala střední úroveň až do 6 dpi a poté progresivně klesala na nízkou úroveň 9 dpi (obrázek 1C). Kromě toho jsme odebrali plnou krev myší infikovaných HTNV ve dnech 0, 3, 6 a 9 po infekci, abychom určili virovou replikaci v krvi. Výsledky ukázaly, že virová zátěž se zvýšila na 3 dpi a poté se snížila, což naznačuje replikaci viru v krevních buňkách. Jak je znázorněno na doplňkovém obrázku 1, počet virových kopií u myší Nlrc3-/- byl vyšší než u myší WT (myši Nlrc3-/-: 5752 ± 502 kopií na ml; myši WT: 3589 ± 869 kopií na ml) při 3 dpi. Navíc byla detekována 2-krát vyšší virová zátěž ve slezinách myší Nlrc3−/− (3033 ± 175 ekvivalentů kopií na mg) než myší WT (1520 ± 425 kopií na mg) na 6 dpi; stejný vzorec byl pozorován v ledvinách na 9 dpi (myši Nlrc3-/-: 500 ± 87 ekvivalentů kopií na mg; myši WT: 270 ± 40 kopií na mg) (obrázek 1C). Celkově byla u myší Nlrc3−/− detekována mírně vyšší virová zátěž než u myší WT.

Dále jsme zkoumali hladiny HTNV nukleoproteinu (NP). Jak je znázorněno na obrázcích 2A, C, myši Nlrc3−/− vykazovaly vyšší hladiny virového antigenu než myši WT ve slezině a ledvinách. Statistická analýza virových antigenů v ledvinách a slezině byla ukázána na obrázcích 2B, resp. Nízké hladiny virových antigenů byly detekovány v srdci, játrech, plicích a mozku myší Nlrc3−/− (doplňkový obrázek 2). Hladiny virového proteinu NP v srdci, plicích a mozku myší Nlrc3−/− byly nižší než u myší WT na úrovni proteinu (doplňkové obrázky 2B, F, H), ale statistické významnosti byly ukázány mezi srdcem a mozkem na mRNA a hladiny proteinů (doplňkové obrázky 2A, E, I). Toto zjištění naznačovalo, že aktivní virová

replikace se objevila v krvi, slezině a ledvinách myší Nlrc3−/− po infekci HTNV. Nakonec jsme použili imunofluorescenci k detekci hladin exprese HTNV NP ve slezině a ledvinách. Intenzita fluorescence HTNV NP FL byla vyšší v ledvináchledvinovétubuly (obrázek 2E) a slezinová červená dřeň (obrázek 2F) myší Nlrc3−/− než myší WT na 6 dpi a 9 dpi. Tyto výsledky společně naznačují, že myši Nlrc3-/- jsou náchylnější k intraperitoneální infekci HTNV.

Rutinní krevní testy myší Nlrc3−/− po infekci HTNV

Bylo široce přijímáno, že patologie HFRS je z velké části zprostředkovaná imunitou, včetně imunitních komplexů, aktivace komplementu, odpovědi T buněk (24–26) a produkce cytokinů indukované HTNV (26, 27), což způsobuje poškození mnoha orgánů. Kromě toho je trombocytopenie běžným klinickým rysem u pacientů infikovaných viry virové hemoragické horečky (VHF). Nejprve jsme tedy provedli hematologický test s použitím plné krve odebrané myším Nlrc3−/− a WT při rozlišení 3, 6, 9 a 12 dpi. Výsledky ukázaly, že počty PLT u myší WT se snižovaly na 3 dpi a poté se postupně obnovovaly, ale nadále se snižovaly u myší Nlrc3−/−, dokud nedosáhly nejnižší hodnoty na 9 dpi, což je výrazně nižší než u WT na 9 dpi (P<0.05) (figure="" 3a).="" the="" decrease="" of="" wbc="" counts="" was="" observed="" on="" 3="" dpi="" and="" then="" gradually="" recovered="" to="" normal="" levels="" in="" both="" mouse="" strains="" (figure="" 3b).="" to="" further="" dissect="" the="" subset="" changes="" in="" wbcs,="" we="" analyzed="" on="" 0,="" 3,="" 6="" dpi="" the="" number="" of="" monocytes,="" neutrophils,="" lymphocytes,="" and="" t="" cells="" by="" routine="" blood="" tests="" combined="" with="" fellow="" cytometry="" assay.="" the="" number="" of="">

se významně zvýšil u myší Nlrc3−/− na 6 dpi, ale ne u myší WT (obrázek 3C). Neutrofily u obou typů myší mírně poklesly, ale obnovily se na průměrnou úroveň při 6 dpi (obrázek 3D). Počet lymfocytů se významně snížil na 3 dpi, zatímco u WT myší začaly stoupat na 6 dpi, počty lymfocytů zůstaly na nízké úrovni na 6 dpi u myší Nlrc3−/− (obrázek 3E). Poměr CD3 plus CD4 plus T lymfocytů oproti CD3 plus CD8 plus T lymfocytům v periferní krvi byl stanoven kolegyní cytometrií a bylo zjištěno, že se zvýšil při 3 dpi a poté se rychle obrátil při 6 dpi, což je v souladu se změnami často pozorovanými u pacientů s HFRS (obr. 3F), u kterých se CD4 plus T buňky dramaticky snížily a CD8 plus T buňky zůstávají nezměněny nebo kompenzačně expandovány, což vede k obrácenému poměru CD4/CD8. Tato zjištění naznačují, že intraperitoneální inokulace HTNV do myší Nlrc3-/- do určité míry indukovala hlavní klinické rysy pacientů infikovaných HTNV, jako je trombocytopenie a obrácený poměr CD4/CD8 T buněk.

Patologické změny v ledvinách infikovaných myší Nlrc3−/− vykazují výrazné ledvinové intersticiální krvácení a dilataci renálních tubulůDále byly patologické změny u myší infikovaných HTNV hodnoceny barvením H&E a bylo zjištěno, že existují v ledvinách všech infikovaných myší Nlrc3−/−, které se projevují jako edémledvinovétubulárních epiteliálních buněk. Na 6 dpi byly pozorovány hemoragické léze vledvinovémedulla (obrázek 4A).Renální tubulusdilatace byla pozorována již při 3 dpi, její závažnost dosáhla vrcholu při 9 dpi a přetrvávala až do 12 dpi a je výraznější u myší Nlrc3−/− než u myší WT (obrázky 4B, C). Tato zjištění naznačovala

že akutní nefropatie charakterizovanáledvinové tubulydilatace aledvinové intersticiální krváceníbyl indukován u myší Nlrc3-/- infikovaných HTNV. Pokud jde o další patologické změny v játrech, slezině, plicích, tyto dvě skupiny myší vykazovaly podobné výsledky. Ty zahrnovaly především extramedulární hematopoézu ve slezině, ztluštění alveolární stěny v plicích a degeneraci jater (doplňkové obrázky 3A–F). Na základě výše uvedeného se patologické rysy pozorované v ledvinách myší Nlrc3−/− během akutní fáze infekce HTNV velmi podobaly klinicko-patologickým změnám u lidských případů HFRS.

Na základě toho jsme dále zkoumali související indexy krve a moči u myší na funkční poruchy ledvin. Myší séra byla odebrána pro hodnocení alaninaminotransferázy (ALT), frakce kreatinkinázy MB (CK-MB), močoviny a také kyseliny močové (UA). Jak je znázorněno na obrázku 4D, ve srovnání s kontrolními WT myšmi byla hladina UA v séru významně zvýšena na 3 dpi u myší Nlrc3−/−, sérová CK-MB byla významně zvýšena na 9 dpi u myší Nlrc3−/−, ale hladiny v séru ALT, UREA a CREA nevykazovaly žádné zvýšení (doplňková tabulka 1).

Renálníúčast na HFRS infikovaných PUUV zahrnuje přechodnou proteinurii, mikroskopickou, ale zřídka viditelnou hematurii a oligurickou AKI, následovanou polyurií a zotavením. Typickým znakem proteinurie u tohoto onemocnění byl její rychlý pokles po akutní fázi onemocnění (6). Ve velké kohortě pacientů s akutní tubulointersticiální nefritidou způsobenou různou etiologií byla proteinurie nalezena pouze u jedné čtvrtiny pacientů a pouze u 2 % všech pacientů byla proteinurie nefrotického rozsahu zjištěna (28). Shromáždili jsme moč v 0, 3, 6 dpi a zjistili jsme, že hladiny bílkovin v moči se zvýšily ve 3 dpi, akutní fázi infekce. Koncentrace proteinu v moči byla významně zvýšena a průměrná hodnota se blížila 0,3 g/l při 3 dpi u infikovaných myší Nlrc3−/− a myší WT (obrázek 4E).

K vyšetření zánětlivých buněk infiltrovaných doledvinovéintersticiální po infekci HTNV jsme provedli imunohistochemické (IHC) barvení pomocí CD3, F4/80 a CD11b. Výsledky ukázaly, že skupina imunitních buněk pozitivních na CD3 infiltrovala doledvinovéintersticiální po infekci HTNV (obrázek 5A) a myeloidní buňky pozitivní na CD11b se objevily v kortikálním tubulointersticiálním (obrázek 5B). Podíl infiltrujících CD3 plus T buněk a CD11b plus myeloidních buněk je významně vyšší u infikovaných myší Nlrc{5}}/- než u myší WT, ale makrofágy pozitivní na F4/80 byly distribuovány po celé ledvinové kůře a dřeni a nevykazovaly žádné významné rozdíl mezi těmito dvěma typy myší (obrázek 5C).

Infekce HTNV indukovala silnou cytokinovou odpověď u myší Nlrc3−/−

Nadprodukce zánětlivých cytokinů je běžně hlášena u subjektů s HFRS a dala vznik hypotéze, že dysregulace cytokinů může hrát klíčovou roli v patogenezi onemocnění. Vaheri a kol. (8) zjistili, že různé buňky, jako jsou makrofágy, monocyty a lymfocyty, produkovaly četné cytokiny v reakci na prozánětlivé signály, jako je virová infekce. Wang a kol. uvedli, že sérové ​​koncentrace TNF-a, IL-6, IFN-g, IL-8, IP-10 a RANTES (ale ne IL-4) byly mnohem zvýšené u pacientů s HFRS (29) ve srovnání s kontrolami; a že nejvyšší koncentrace byly obvykle nalezeny během febrilní, hypotenzní a oligurické fáze, zejména v případech těžkého a kritického typu HFRS. Vysoké hladiny IL{10}} v plazmě byly spojeny se závažnýmiledvinovéselhání a trombocytopenie u PUUV-indukovaného HFRS a mohl by být použit jako marker závažnosti onemocnění.

Naše výsledky ukázaly, že infekce HTNV vedla ke zvýšené produkci cytokinů, včetně CXCL-1, CCL-5, IL-6, IL-12, TNF-a a IFN-g v Nlrc3-/- myši a hladiny těchto cytokinů dosáhly vrcholu při 6 nebo 9 dpi; ve srovnání s tím měly myši WT slabší cytokinové reakce v průběhu infekčního procesu (obrázek 6).

Závěrem jsme v této studii zjistili, že po intraperitoneální inokulaci HTNV se u myší Nlrc3−/− vyvine ztráta hmotnosti,ledvinové krvácenía dilataci tubulů. Tyto rysy připomínají klinické příznaky HFRS více než jakékoli jiné dříve publikované zvířecí modely. Kromě toho myši Nlrc3−/− také vykazovaly vyšší virovou zátěž v séru, slezině a ledvinách než myši WT a u myší Nlrc3−/− se vyvinula hematologická porucha a významné patologické změny ve více orgánech, čímž byla prokázána infekce Nlrc3−/ HTNV − myši jako nový model pro studium HFRS.

DISKUSE

Zde popsaný myší model HFRS ukazuje, že myši Nlrc3-/- infikované HTNV představují vhodný malý zvířecí model, který lze použít k hodnocení vakcín a léčiv proti HFRS. Nlrc3−/− myší model připomíná systematické poškození pozorované u lidí, charakterizované trombocytopenií, lymfocytopenií, zvýšenými hladinami AST v séru (jaterní dysfunkce), LDH, kreatinkinázovou MB frakcí a UA(dysfunkce ledvin). Kromě toho u myší Nlrc3−/− došlo ke ztrátě hmotnosti a zjevnéledvinové krvácení. Virová replikace a histopatologické změny v cílových orgánech byly detekovány v plicích, slezině, játrech a ledvinách. Kromě toho byla v krvi, slezině a ledvinách myší Nlrc3−/− nalezena mírně vyšší hladina virové RNA zátěže. Pro srovnání, u WT myší se vyvinuly mírné histologické změny navzdory detekci virové RNA v krvi, slezině a ledvinách.

Our findings are generally in agreement with what would be expected for HTNV infection-induced HFRS and signify an improvement over previously published animal models. It has been reported that hemorrhagic fever (HF) virus infection in animal models can lead to a spectrum of diseases from asymptomatic to mild and severe and often transient viremia. A transient weight loss usually manifests mild illness, but severe disease showed more significant weight loss (>20 procent) (30). Například křečci infikovaní HTNV nazální cestou vedli k přetrvávající asymptomatické infekci, charakterizované sporadickou virémií, ale vysokými hladinami kopií virového genomu v plicích, mozku a ledvinách. Fretky infikované vysokou dávkou HTNV prostřednictvím svalové injekce vykazovaly postupný pokles tělesné hmotnosti (5-12 procent v průběhu času), ale neporušenérenální funkcenepřítomnost virémie a nedostatek přenosu viru do orgánů. U kosmanů vedla intramuskulární injekce HTNV k vysokému stupni sérokonverze a produkci neutralizačních protilátek; trvale tato zvířata neměla žádné poškození ledvin, virémii nebo přenos viru do orgánů (13).

Pokud jde o pozorování, že hematologické změny pozorované pouze v jednom časovém bodě a změny cytokinů nejsou významné, domníváme se, že je lze vysvětlit povahou infekce HTNV, která je podobná mnoha jiným virovým infekcím, které postihují více orgánů, a proto často obtížné najít trvalé změny jediného parametru. Celkově jsou naše zjištění obecně v souladu se stávajícími znalostmi v oboru. Navíc objev myší Nlrc3−/−, které mají větší náchylnost k infekci HTNV a vykazují mnoho změn podobných patologickým změnám HFRS, je novým příspěvkem do této oblasti. Obecně se uznává, že primárními cíli hantaviru jsou lidské vaskulární endoteliální buňky , což vede k různým stupňům generalizované kapilární dilatace a edému (31).

Virové antigeny lze nalézt v endotelu kapilár různých tkání (Hantaviry řídí permeabilitu endoteliálních buněk senzibilizací buněk na faktor vaskulární permeability VEGF, zatímco angiopoetin 1 a sfingosin 1-fosfát inhibují permeabilitu řízenou hantaviry). Histologická analýza ukázala, že byly pozorovány ledviny myší Nlrc3−/−ledvinové tubulydilatace při 9 dpi, myši Nlrc3−/− s vážnějšími patologickými změnami než myši WT a přetrvávaly na 12 dpi. U myší Nlrc3−/− byl v ledvině pozorován edém renálních tubulárních epiteliálních buněk a pozoruhodné renální intersticiální krvácení. Dále byla pozorována výrazná extramedulární hematopoéza v červené dřeni sleziny při 6, 9 a 12 dpi a dilatace zárodečných center a zvýšený počet mnohojaderných obřích buněk při 12 dpi. Játra také vykazovala závažnou hepatocytární degeneraci a rozptýlenou nekrózu ve dnech 3, 6, 9 a 12 dpi. Zánět plic a ztluštění alveolární stěny byly pozorovány na 6 dpi. Toto zjištění naznačuje, že infekce HTNV měla významný a dlouhodobý dopad na játra a ledviny u myší Nlrc3-/- infikovaných HTNV. Kromě toho byly nápadné myši Nlrc{17}}/-dilatace renálního tubuluintersticiální krvácení a renální dysfunkce po infekci HTNV. Hladina UA v séru byla signifikantně zvýšená na 3 dpi, což je jasná známka renální dysfunkce. Koncentrace proteinu v moči byla významně zvýšena a průměrná hodnota se blížila 0,3 g/l při 3 dpi u infikovaných myší Nlrc3-/-. Stejný trend nárůstu UA nebyl pozorován u WT myší. Tyto výsledky naznačují, že náš model rekapituluje více patologických rysů lidské infekce HTNV.

N protein (NP) je hojně produkován v buňkách infikovaných hantavirem a může být detekován již 4 hodiny po infekci (32). Tyto vlastnosti jsou hlavním důvodem, proč je cílem ELISA detekce proteinu hantaviru N a imunofluorescenční testy pro hodnocení počtu virových částic a progrese virové infekce. Různé metody mohou ovlivnit získané výsledky a dosažené závěry. Virový protein a virémie jsou dva různé parametry virové infekce a nemusí se vždy měnit synchronně. Výsledky kvantitativní PCR v reálném čase ukázaly, že k přechodnému zvýšení hladin NP došlo na 6 dpi ve slezině, kde virus mohl projít přechodnou replikací, po které následovala jeho clearance. Jak se očekávalo, akumulace virového proteinu byla pozorována po vrcholu virémie, který se objevil na 3 dpi. Replikace viru ve slezině a ledvinách byla udržována na střední úrovni na 9 a 12 dpi, doprovázená syntézou N proteinu (slezina při 9 dpi: WT myši: 192 ± 128 kopií na mg; Nlrc3-/- myši: 431 ± 229 kopií na mg; slezina při 12 dpi: myši WT: 160 ± 85 kopií na mg; myši Nlrc3−/−: 226 ± 118 kopií na mg). Množství HTNV NP na úrovni proteinu však dosáhlo maxima v den 6 pi a zůstalo zvýšené během 9 a 12 dpi. Rozdíl v kinetice kopií virové RNA a množství proteinu může odrážet jejich rozdílný rozpad v různých orgánech.

Role cytokinů je v modelech onemocnění obvykle složitější. U PUUV-indukovaného HFRS, těžkéselhání ledvina trombocytopenie jsou spojeny s vysokými hladinami IL{0}} v plazmě (33). Naše analýza ukázala, že infekce HTNV vedla ke zvýšené produkci cytokinů, včetně CXCL-1, CCL-5, IL-6, IL-12, TNF-a a IFN-g v Nlrc3−/− myši, ale ne tolik u WT myší. Stojí za zmínku, že při rozlišení 9 dpi vykazovaly myši Nlrc3−/− pozoruhodné patologické změny ve slezině a ledvinách, doprovázené v tomto okamžiku silnou cytokinovou odpovědí. Tato zjištění naznačují, že vysoká hladina cytokinů může souviset s patogenezí onemocnění.

Stručně řečeno, výsledky, které zde uvádíme, ukazují, že po naočkování HTNV intraperitoneální cestou se u Nlrc3−/− myší rozvine úbytek hmotnosti, trombocytopenie, rdysfunkce ledvin a krvácení.Ty se více podobají klinickým symptomům HFRS než jakékoli jiné dříve publikované zvířecí modely. Tento model lze použít k hodnocení potenciálních vakcín a terapeutik a hloubkové studii patogeneze HFRS in vivo.