Vzorec exprese - tubulin, inversin a jeho cíl rozcuchaný-1 a morfologie primární řasinky při normálním vývoji lidských ledvin a onemocněních

edmund.chen@wecistanche.com

Abstraktní:Časoprostorová exprese -tubulinu, inverze a rozcuchané-1 (DVL-1) proteiny spojené se signální dráhou Wnt a morfologie primární řasinky byly analyzovány při vývojiledviny(14.–38. vývojový týden), zdravý postnatální (1.5- a 7-letý) a patologicky změněný člověkledviny,včetně multicystické dysplastikyledviny(MCDK), fokální segmentální glomeruloskleróza (FSGS) a nefrotický syndrom finského typu (CNF). Analýza byla provedena dvojitou imunofluorescencí, elektronovou mikroskopií, semikvantitativními a statistickými metodami. Cytoplazmatická koexprese -tubulinu, inverze a DVL-1 byla pozorována v proximálních stočených tubulech (pct), distálních stočených tubulech (dct) a glomerulech (g) analyzovaných tkání. Běhemledvinase celková exprese -tubulinu, inverze a DVL-1snížila, zatímco v postnatálním období mírně vzrostla. Nejvyšší exprese -tubulinu a inverze charakterizovaly dct a g, zatímco vysoké DVL-1 charakterizovaly pct. -tubulin, inverze a vzory exprese DVL-1 v MCDK, FSGS a CNFledvinyse významně lišily od zdravé kontroly. Ve srovnání se zdravýmiledviny, patologicky změněnoledvinyměl dysmorfní primární řasinky. Rozdílná dynamika výrazu -tubulin, inverze a DVL-1 běhemledvinavývoj by mohl naznačovat, že přepínání mezi kanonickou a nekanonickou Wnt signalizací je pro normální stav zásadníledvinamorfogeneze. Naproti tomu jejich narušená exprese u patologickýchledvinymůže být spojena s abnormálními primárními řasinkami, což vede k chronickýmonemocnění ledvin.

klíčová slova:vývoj lidských ledvin; -tubulin; inversin; DVL-1; MCDK; FSGS; CNF; ledvina, ledvina

CISTANCHE ZLEPŠÍ ONEMOCNĚNÍ LEDVIN/RENÁL

Úvod 

Vývoj definitivního nebo metanefrickéholedvinyzačíná během pátého gestačního týdne (GW), který se pak průběžně diferencuje za vzniku trvalých ledvin [1,2]. Signální interakce mezi metanefrickým mezenchymem a ureterickým pupenem zajišťují správnou funkciledvinavývoj během nefrogeneze. Stručně řečeno, ureterický pupen indukuje mezenchymový-epitelový přechod (MET) v metanefrickém mezenchymu, který kondenzuje a tvoříledvinovévezikuly, následované tělísky ve tvaru čárky a S a nakonec vedoucí k tvorbě glomerulů [3]. Na oplátku mezenchym indukuje další větvení pupenu ureteru. Metanefrické ledviny se stávají funkčními vylučovacími jednotkami v 11. týdnu lidského vývoje. Nefrogeneze je však dokončena během 34. až 36. týdne vývoje plodu, kdy je ukončeno mnohočetné větvení, ale další proces diferenciace ledvin pokračuje do postnatálního období [4,5]. Narušení těchto komplexních interakcí vede k různým vrozeným abnormalitám ledvin a močových cest (CAKUT), včetně dysplazie, polycystické choroby ledvin, multicystické dysplastikynemoc ledvin(MCDK), což následně vede k chronickýmnemoc ledvin(CKD) [6].

V této studii jsme se zaměřili na primární vzhled řasinek a Wnt signální dráhu, která hraje důležitou roli během normální nefrogeneze aledvinaopravný proces po akutním nebo chronickémnemoc ledvin[7]. Existence primárních řasinek během nefrogeneze a velký počet vývojovýchledvinadefekty vyskytující se u pacientů s onemocněním řasinek poukazují na to, že pro normální fungování je nezbytná skutečná primární funkce řasinekledvinaorganogeneze [8,9]. Primární cilium je organela na bázi mikrotubulů důležitá pro tkáňovou homeostázu, kde je základní složkou -tubulin [10]. Ztráta acetylace -tubulinu v imortalizovaných buňkách spouští přechod z epitelu na mezenchym (EMT), což znamená, že acetylovaný tubulin je důležitý při stabilizaci mikrotubulů [11]. V průběhu lidského vývoje umožňuje primární ciliami zprostředkovaná Wnt dráha buněčnou proliferaci, diferenciaci a tkáňovou morfogenezi [12]. U značného počtu dětí s poruchou primární funkce řasinek a narušenou Wnt-signální dráhou se vyvine CKD, kde je vrozenáledvinovéporuchy jsou zodpovědné za téměř polovinu případů [13]. Nejčastějším vrozeným cystickým onemocněním u dětí je multicystická dysplastikanemoc ledvin(MCDK) [14]. Mnohočetné cysty, které spolu nekomunikují [15] a postrádají normální stavledvinovéparenchym jsou charakteristické mikroskopické nálezy pro MCDK. Fokální segmentální glomeruloskleróza (FSGS) je jedním z nejčastějších glomerulárních onemocnění, které vedou ke konečnémunemoc ledvin[16]. Na začátku je FSGS charakteristické tím, že je fokální, zahrnuje pouze menšinu glomerulů a segmentální, zahrnuje změny pouze v segmentu glomerulárního kruhu [17]. Kongenitální nefrotický syndrom finského typu (CNF) je méně častý autozomálně recesivně dědičnýnemoc ledvinreprezentované prenatálním propuknutím rozsáhlé ztráty proteinů [18], spojené s cystogenezí proximálních tubulů [19]. U mnoha forem primárních glomerulárních onemocnění se rozvine proteinurie v důsledku poškozené glomerulární filtrační bariéry [20]. Z velkého množství studií vyplývá, že poškození a dysfunkce podocytů mají vnitřní roli v patogenezi proteinurie CKD [21]. Studie Vukojeviče a kol. ukazuje zvýšený počet ciliovaných a málo diferencovaných podocytů v CNF [22]. Předchozí studie ukázaly, že Wnt/-catenin signální dráha má zásadní roli ve zmírnění dysfunkce podocytů s proteinurií [23]. Existují dvě hlavní Wnt-signalizační dráhy, jedna známá jako kanonická -catenin-dependentní a druhá nekanonická, -catenin-nezávislá. Během myšiledvinavývoj, kanonická signalizace Wnt je aktivní na špičkách pupenů ureteru a v tělíscích tvaru S [24]. Kromě toho má Wnt prostřednictvím kanonické signalizace význam pro udržení MET během nefrogeneze [25]. Konkrétně vazba proteinového komplexu obsahujícího Dvl na membránový receptor je povinná pro aktivaci Wnt dráhy, zatímco vyřazení klíčových komponent této dráhy vede k časné perinatální mortalitě v důsledku absence nefrogenní zóny vledvina[25]. 

Bylo zjištěno, že klíčovým proteinem jako molekulární přepínač mezi kanonickou a nekanonickou Wnt signální dráhou je inverze [26]. Přestože byly zjištěny interakce různých proteinů s inverzí, jeho přesná funkce nebyla dosud zcela objasněna. Vledvinovéepiteliálních buněk, inverze se nachází v primární řasence, působí jako řasinkový protein [27]. Kromě toho inverze tvoří stálý komplex s tubulinem v kulturáchledvinovébuňky a kolokalizují se in vivo [27,28]. Zdá se, že inverze hraje zásadní roli v časné morfogenezi pronefrického systému a určení levo-pravé symetrie během vývoje [29,30]. Významná událost pro kanonické i nekanonické Wnt-signální dráhy při náboru cytoplazmatického Dvl do buněčné membrány. Vzhledem k tomu, že předchozí zjištění ukázala, že inverze a Dvl se kolokalizují v renálních epiteliálních buňkách, lze spekulovat, že inverze by také mohla mít roli v nekanonické signalizaci. Dysregulace Wnt-signalizace zprostředkovaná inverzí spouští aberantní proliferaci v tubulech [31]. Genetické testy odhalily mutaci DVL-1 u pacientů s autozomálně dominantním Robinowovým syndromem, představující heterogenní poruchy u některých pacientů spojené s urogenitálními aledvinovéanomálie [32].

CISTANCHE ZLEPŠÍ DIALÝZU LEDVIN/RENÁL

Vzorec vývojové exprese -tubulinu, inverze a DVL-1 byl zkoumán na různých zvířecích modelech. Jejich exprese v pronefros Xenopus laevis byla potvrzena použitím intravitální mikroskopie [31], zatímco byly nalezeny v buněčných liniích odvozených z myších proximálních tubulárních buněk pomocí konfokální mikroskopie a hmotnostní spektrometrie [33]. Světelná mikroskopie a dvojitá imunofluorescence navíc odhalily jejich přítomnost v řezech myšíledviny[34]. Studie na inverzních knockout myších uváděly zvětšené, difúzní cysty vledvinovédřeně a kůry spojené s viscerální inverzí situs [35]. U lidí byla mutace inverze prezentována s infantilní nefronoftózou, která vedla k ukončení těhotenství [36]. Navzdory četným studiím oledvinové-tubulin, inverze a vzor a funkce DVL{1}} exprese, podle našich nejlepších znalostí nebyl vzorec exprese těchto proteinů v lidské fetální a postnatální lidské tkáni dosud prozkoumán a přiveden ke korelaci. Kromě toho nebyly hlášeny žádné důkazy týkající se projevu inverze a DVL-1 v raném vývoji člověka. Proto se tato studie zaměřila na analýzu prostorového a časového vzorce exprese -tubulinu, inverze a DVL-1 během fetálních a postnatálních fází zdravého člověkaledviny, stejně jako vledvinatkání MCDK, FSGS a CNFledvinyza účelem vytvoření případné chybějící vazby mezi těmito subjekty. Konkrétně navrhujeme, že narušené expresní vzorce -tubulinu, inverze a DVL-1 proteinů mohou být základním procesem cystogeneze a abnormální funkcí primární řasinky vedoucí k chronickéonemocnění ledvin. 

Výsledek

Analýza vývojové a postnatálníledvinatkání byla provedena na výrazně diferencovaných strukturáchledvina:proximální stočené tubuly (pct), distální stočené tubuly (dct) a glomeruly (g). Během analyzovaných vývojových fází a v postnatálnímledvinatkáně, -tubulin, inverze a DVL-1 vykazovaly pozitivní vzorce exprese, ale s rozdíly v intenzitě, distribuci a množství. Analýza patologickéholedvinová tkáňMCDK, FSGS a CNF byla provedena na plném počtu zobrazení pozitivních buněk ve srovnání s kontrolou zdravé ledvinové tkáně.

2.1. Světelná mikroskopie, elektronová mikroskopie a imunohistochemie ( -tubulin) zdravé a patologicky změněné postnatální lidské ledvinové tkáně

2.1.1. Zdravé světlo postnatálních ledvin

mikroskopie po poroduledvinatkáň vykazuje dobře definovanéledvinastruktur, se zřetelným rozdílem mezi dření a kůrou a tvorbou pct, dct a g v kortikální oblasti. Imunohistochemické barvení -tubulinu odhaluje přítomnost jednoho primárního cilia ve středu apikálního buněčného povrchu každé tubulární buňky a v 0.018 procent ± 0,00014 procent SD na povrchu glomerulárních buněk. Elektronová mikroskopie ukazuje přítomnost pouze jednoho primárního řasinku vycházejícího z bazálního těla na apikálním buněčném povrchu tubulu (obrázek 1a).

2.1.2. CNF

Většina analyzovaných g je menší a laločnatá (80 procent), zatímco menšina má normální velikost nebo hypertrofická (20 procent, n=100). Je zjištěna segmentová nebo globální skleróza g, zatímco pct a dct jsou částečně dilatované a potažené atrofickým epitelem. Ultrastrukturálně je pozorována ztráta mikroklků a snížení výšky buněk s multifragmentací jader. V podocytech jsou procesy nohy difúzně ztraceny. Tubulární primární řasinky jsou dezorganizované, zejména v cystách proximálních tubulů a vykazují změny v délce a cytoplazmatické poloze (obrázek 1b).

2.1.3. MCDK

V ledvinové tkáni lze sporadicky nalézt nezralé a zralé g.ledvinytkáň je vyplněna četnými oválnými cystami. Sloupcové epiteliální buňky pokrývají cysty a jsou obklopeny volnou pojivovou tkání. Imunohistochemické barvení na -tubulin ukazuje mnohočetné dlouhé a dezorganizované primární řasinky na povrchu epiteliálních buněk (obrázek 1c).

2.1.4. FSGS

V 90 procentech g se nachází rozsáhlá segmentální skleróza (n=100), spojená s intersticiální fibrózou a známkami tubulárního poškození. Snížení výšky epiteliálních buněk se ztrátou mikroklků se nachází v elektronovém mikroskopu, zatímco endoteliální buňky a mezangiální oblasti mají pravidelnou ultrastrukturu. V elektronovém mikroskopu je na povrchu distální tubulární buňky pozorováno extrémně dlouhé a dislokované (decentralizované) cilium (obrázek 1e). Podocyty vykazují difúzní ztrátu výběžků nohou s rozsáhlou tkání mikroklků. Imunohistochemické barvení na a-tubulin ukazuje mnohočetné dlouhé a dezorganizované primární řasinky na povrchu epiteliálních buněk (obrázek 1c).

2.2. Imunohistochemické barvení na 心tubulin, inverze a DVL-1- a statistická analýza vyvíjejících se a zdravých postnatálních lidských ledvin

Ve 14., 15. a 16. gestačním týdnu seledvinatkáň má různá vývojová stádia tvorby nefronů: z metanefrických jamek,ledvinovéfáze vezikulů, které řídí nefrony ve tvaru písmene S, čímž tvoří nefrogenní zónu ve zevní kůře (obrázek 2). Rozlišení pct, dct a g lze pozorovat v kortikálních oblastech blíže kledvinamedulla. Během 22. GW se části dřeně a kůry staly jasně rozlišovacími, zatímco ve 38. GWledvinastruktury se jeví jako vysoce diferencované, obsahující zralé formy pct, dct a g

2.2.1. a-tubulín

Během vývoje je a-tubulin silně exprimován ve všech vývojových fázíchledvinastruktur, primárně vizualizujících formu primárních řasinek na površích parietálních epiteliálních buněk Bowmanova pouzdra, g, pct a dct. V rámciledvinatkáni, 82–97 procent buněk pct exprimuje a-tubulin, zatímco exprese dct klesá z 99 procent na 72 procent ve 38. GW (viz obrázek 3, tabulka 1). Mezi různými vývojovými stádii se nejsilnější exprese a-tubulinu nachází v g 16. GWledviny, obsahující 93 procent pozitivních buněk. pružné 14., 15. a 22. GW (viz obrázek 3a,b, tabulka 1), přibližně 70 procent g buněk exprimuje a-tubulin, zatímco nejmenší exprese je pozorována u 38. GW (p < 0,01)="" s="" 34="" procenty="" pozitivních="" buněk="" (obrázek="" 3c).="" v="">ledvinatkáně (1.5-rok a 7-letledviny), nejsilnější imunoreaktivita vůči a-tubulinu je pozorována na apikálním buněčném povrchu pct a dct (obrázek 3d-f). Exprese a-tubulinu je také přítomna v perinukleární cytoplazmě dct a parietálních epiteliálních buňkách Bowmanova pouzdra. a-tubulin barví všeledvinovéstruktur s průměrem 50 procent pozitivních buněk v pct, 94 procent v dct a 85 procent v g (obrázek 3f). Dct skvrny významně odlišné od pct (p < 0,0001).="" všechny="" zkoumané="" struktury="" se="" barví="" pozitivně="" na="" a-tubulin,="" přičemž="" 77="" procent="" pozitivních="" buněk="" v="" pct,="" 72="" procent="" v="" dct="" a="" 58="" procent="" v="" g="">

Obrázek 3. Imunofluorescenční barvení -tubulinu a DAPI ve vyvíjejících se a postnatálních lidských ledvinových tkáních (a–e). Ledviny 14., 15./16., 38. GW (a–c);ledvinyz 1.5- a 7-letých dětí (d,e). Pozitivní barvení -tubulinu (šipky) je znázorněno v každé struktuře v kortexu prostřednictvím vývojové a postnatální fáze (a–e), proximálních stočených tubulů (pct), distálních stočených tubulů (dct) a glomerulů (g). Podrobnosti primárních řasinek v pct (d) a dct (a–c,e) jsou zobrazeny jako vložky s větším zvětšením (bílý rámeček). Zvětšení × 40, stupnice 100 µm. Distribuce -Tubulin pozitivních buněk na strukturu v různých fázích vývoje a v postnatálním období je znázorněna v grafu (f). Graf (g) (celkový počet protein-pozitivních buněk v pozorovaných strukturách) ukazuje expresi proteinu související s dobou vývoje (lineární regrese) a vzájemný vztah -tubulinu k DVL-1 během vývoje a zrání (dvoucestná ANOVA následovaná SIDAKův posthoc test). Data jsou uvedena jako průměr ± SD.

Distribuce -tubulin-pozitivních buněk na strukturu v různých fázích vývoje a v postnatálním období je znázorněna v grafu (f). Graf (g) (celkový počet protein-pozitivních buněk v pozorovaných strukturách) ukazuje expresi proteinu související s dobou vývoje (lineární regrese) a vzájemný vztah -tubulinu k DVL-1 během vývoje a zrání (dvoucestná ANOVA následovaná Sidakův post hoc test). Data jsou uvedena jako průměr ± SD.

2.2.2. Dvojité imunofluorescenční barvení na inverzi a DVL-1 a DAPI jaderné barvení ve vývoji a zdravých postnatálních ledvinách Inverzní exprese ve vyvíjející se a postnatální ledvinové tkáni

Ve 14., 15. a 16. GW vykazuje inverze silnou granulární expresi v g a mírnou granulární expresi v cytoplazmě pct a dct (obrázek 4a,b), zatímco ve 22. a 38. GW (viz obrázek 4c) silně pozitivní exprese je pozorována v g (tabulka 1). Mezi 14. a 22. GW asi 50 procent buněk exprimuje verzi. V 16. GW buňky pct exprimují inverzi u 73 procent buněk, zatímco se snižují na 29 procent buněk (p < 0,05)="" v="" 38.="" gw="" (viz="" obrázek="" 4f).="" pozitivní="" exprese="" inverze="" se="" nachází="" přibližně="" v="" 80–90="" procentech="" dct="" a="" g="" buněk="" ve="">ledvinatkáních 14. a 16. GW, s nejnižší expresí v dct 38. GW (p < 0.05,="" p="">< 0,0001,="" v="" tomto="" pořadí),="" kde="" 66="" procent="" buněk="" bylo="" pozitivních.="" v="">ledvinypct se barví silně na apikální buněčné membráně, zatímco dct se barví většinou na bazální buněčné membráně a v perinukleární cytoplazmě (obrázek 4d,e). V této fázi jsme našli výraz inverze u všech zkoumanýchledvinovéstruktur, včetně pct, dct a g, s průměrnou expresí pozitivních buněk 92 procent pro pct, 88 procent pro dct a 9 0 procent pro g (obrázek 4f). Nepozorovali jsme významný rozdíl v síle signálu inverzní exprese mezi strukturami. Nejvyšší exprese inverze se nachází v g, s průměrem 94 procent pozitivních buněk (obrázek 4f). Významný rozdíl byl nalezen ve srovnání barvení g (kde se 94 procent buněk barví pozitivně) s pct, kde se 58 procent buněk barví pozitivně (p < 0.01)="" a="" s="" dct,="" kde="" je="" 49="" procent="" buněk="" pozitivní="" (p="">< 0,0001,="" obrázek="">

DVL-1 exprese ve vyvíjející se a postnatální ledvinové tkáni

Mírná až silná exprese DVL{{0}} je pozorována v cytoplazmě pct, dct ag ve fetálním období (viz obrázek 4a–c, tabulka 1). V pct 76–86 procent buněk exprimuje DVL-1 ve 14.–22. GW, zatímco ve 38. GW je 57 procent pozitivních buněk (obrázek 4g). V dct 14. a 15. GW exprimuje DVL 68–70 procent buněk-1, v 16. a 22. GW počet pozitivních buněk klesne na 42–5{{41} } procent, zatímco v expresi 38. GW (p < 0,001),="" je="" pozorováno="" u="" 19="" procent="" dct="" buněk.="" exprese="" dvl-1="" se="" zvyšuje="" v="" g="" během="" fetálních="" stádií:="" ve="" 14.="" gw="" je="" to="" 6="" procent,="" zatímco="" v="" 15.,="" 16.="" a="" 22.="" gw="" se="" zvyšuje="" na="" 10="" procent="" (p="">< 0,01).="" u="" 38="" gw="" exprimuje="" dvl-1="" 14="" procent="" g="" buněk="" (obrázek="" 4="" g).="" v="" postnatálním="" období="" je="" imunoreaktivita="" dvl-1="" rozptýlena="" v="" cytoplazmě="" (tabulka="" 1)="" jak="" pct,="" tak="" dct="" (obrázek="" 4d,e).="" signál="" se="" nachází="" ve="" všech="" zkoumaných="" strukturách,="" ale="" většinou="" v="" perinukleární="" cytoplazmě.="" intenzita="" exprese="" dvl-1="" je="" významně="" vyšší="" u="" pct="" ve="" srovnání="" s="" dct="" ag="" (p="">< 0,01).="" 39–45="" procent="" buněk="" v="" pct="" a="" dct="" exprimuje="" dvl-1,="" zatímco="" v="" g="" je="" pozitivních="" 21="" procent="" buněk="" (obrázek="" 4="" g).="" nezjistili="" jsme="" významný="" rozdíl="" mezi="" procentem="" imunoreaktivních="" buněk="" v="">ledvinovéstruktur. Procento DVL-1 imunoreaktivních buněk je 34 procent v pct, 36 procent v dct a 27 procent v g, v daném pořadí (obrázek 4g).

Obrázek 4. Dvojité imunofluorescenční barvení inverze (zelená), DVL-1 (červená) a DAPI (modrá) ve vyvíjejících se a postnatálních tkáních ledvin (14.–38. GW, 1.5- a {{6 }}rok staré ledvinové tkáně). Pozitivní barvení (šipky) je znázorněno v každé struktuře ve všech fázích vývoje (a–c) a v postnatálním období (d,e). Sloučené mikrofony spolu se zájmovými strukturami v kortexu: proximální stočené tubuly (pct), distální stočené tubuly (dct) a glomeruly (g). Kolokalizace inverze/DVL-1 (šipka) je zobrazena na sloučených mikrofotografiích. Negativní kontrolní barvení jsou zobrazena jako vložky na inverzi a DVL-1 (a). Erytrocyty lze vidět jako silně zbarvené buňky blízko dct. Podrobnosti jsou zobrazeny jako vložky s větším zvětšením. Zvětšení × 40, stupnice 100 µm. Dynamická pozitivní buněčná distribuce inverze a DVL-1 ve strukturách ledvin (pct, dct, g) ve vývojových a postnatálních fázích je znázorněna v grafech (f,g). Graf (h) ukazuje expresi proteinu (celkový počet pozitivních buněk ve strukturách) související s dobou vývoje (lineární regrese) a vzájemný vztah inverze k DVL-1 prostřednictvím vývoje a zrání (dvoucestná ANOVA následovaná Sidakovým post hoc testem ). Data jsou uvedena jako průměr ± SD.

Současná exprese inverze a DVL-1 je pozorována v cytoplazmě ledvin g, dct a pct během vývoje (viz obrázek 4a–c, sloučení). V postnatálním období koexprese inverze a DVL-1 charakterizuje různé buněčné kompartmenty tubulárních buněk v pct a dct, zatímco koexprese v g je charakterizována silnou prevalencí inverzní exprese (viz obrázek 4d, sloučení ). V 7-roku postnatálních ledvin je koexprese inverze a DVL-1 pozorována v tubulárních buňkách dct a pct a v g, kde exprese inverze mírně převažuje ve srovnání s DVL-1 (Obrázek 4e, sloučení).

2.2.3. Rozdíly v expresi -tubulinu, inverzi a DVL-1 mezi různými vývojovými stádii ledvin a postnatálními ledvinami

Počet -tubulin-pozitivních buněk v pct tkáně ledvin plodu byl statisticky významně vyšší ve srovnání s tkání ledvin 7-letých dětí (13. (p < 0).0{="" {11}}1),="" 15.="" (p="">< 0.0001)="" a="" 16.="" (p="">< 0.00001)="" gw).="" dct="" časných="" fetálních="" stadií="" (13.,="" 15.,="" 16.="" a="" 22.="" gw)="" měla="" více="" pozitivních="" buněk="" ve="" srovnání="" s="" 38.="" gw="" a="" 1,{19}}letou="" tkání="" ledvin="" dětí="" (p="">< 0,0001,="" v="" tomto="" pořadí,="" obrázek="" 3f).="" při="" srovnání="" různých="" vývojových="" stádií="" jsme="" zjistili="" nižší="" úrovně="" exprese="" inverze="" u="" 13.="" (p="">< 0,0001),="" 15.="" (p="">< 0,00001),="" 22.="" (p="">< 0,001)="" a="" 38.="" (p="">< 0,0001)="" gw="" ve="" srovnání="" s="">ledvinovétkáně od 15-letého dítěte. V dct byla zjištěna statisticky významně nižší exprese inverze ve srovnání s tkání ledvin 16. GW a 38. GW (p < 0.0001).="" dále="" byla="" pozorována="" nižší="" exprese="" inverze="" v="" dct="" v="" tkáni="" ledvin="" 7-letého="" dítěte;="" porovnání="" 13.,="" 15.="" (p="">< 0,001,="" oba),="" 16.="" a="" 1.{15}}rok="" staré="" ledvinové="" tkáně="" s="" dct="" 7-rok="" staré="" ledvinové="" tkáně="" (p="">< 0,00001,="" v="" tomto="" pořadí,="" obrázek="" 4f).="" pozorovaný="" signál="" exprese="" dvl-1="" v="" různých="" fázích="" odhalil,="" že="" pct="" 13.="" (p="">< 0,01),="" 15.,="" 16.="">< 0.001,="" respectively)="" and="" 22nd="" (p="" <="" 0.0001)="" gw="" had="" higher="" expression="" of="" immunoreactive="" cells="" compared="" to="" the="" pct="" of="" 7-year-old="" children="" kidney="" tissue.="" dvl-1="" immune-expression="" in="" dct="" of="" the="" kidney="" from="" 13th="" and="" 15th="" gw="" was="" significantly="" higher="" than="" in="" the="" 38th="" gw="" tissue="" (p="" <="" 0.0001,="" respectively,="" figure="">

2.2.4. Vztah mezi expresí -tubulinu a inverzí k DVL-1 ve vyvíjející se a postnatální ledvinové tkáni

-Exprese tubulinu a inverze byly porovnány s expresí DVL-1 ve vývojových stádiích a v postnatální tkáni ledvin. -tubulin měl statisticky vyšší expresi ve všech pozorovaných stádiích ve srovnání s expresí DVL-1 (p < 0.001,="" obrázek="" 3g).="" ve="" všech="" sledovaných="" fázích="" měla="" inverze="" vyšší="" expresi="" ve="" srovnání="" s="" dvl-1="" (p="">< 0,0001,="" obrázek="" 4="">

2.2.5. Srovnání imunohistochemického barvení s -tubulinem, verze a DVL-1- a statistická analýza patologicky změněné ledvinové tkáně (MCDK, CNF, FSGS) -tubulin Rozdíl v barvení -tubulinem u MCDK, FSGS a CNF byl statisticky významný ve srovnání do zdravé postnatální ledvinové tkáně jako kontrolní skupina (p < 0,0001,="" v="" tomto="" pořadí).="" dysplastické="" ledvinové="" tkáně="" měly="" významně="" vyšší="" expresi="" ve="" srovnání="" s="" kontrolní="" skupinou,="" zatímco="" fsgs="" a="" cnf="" vykazovaly="" významně="" nižší="" expresi="" -tubulinu="" ve="" srovnání="" se="" zdravou="" kontrolou="" (obrázek="">

Inverze

Inverze je exprimována v cytoplazmě dezorganizovaných epiteliálních buněk a tubulů MCDK (obrázek 5a). U CNF inverzní exprese charakterizuje g a dct, zatímco u cyst pct se projevuje méně intenzivně (obrázek 5b). U FSGS je inverze silně vyjádřena v g a dct, ale méně intenzivně v cystách pct (obrázek 5c). Prostorová exprese inverze vykazovala statisticky významně vyšší míru barvení ve zdravých ledvinových tkáních (obrázek 5g) ve srovnání s MCDK, FSGS a CNF (p < 0,0001,="" v="" tomto="">

Obrázek 5. Dvojité imunofluorescenční barvení inverze (zelená), DVL-1 (červená) a DAPI (modrá) v patologických tkáních ledvin v MCDK (a), CNF (b) a FSGS (c): tubuly (t) , glomeruly (g), cysta pct (c), výška epiteliálních buněk pct (*). Struktura a buněčná společná lokalizace inverze a DVL-1 (šipky) jsou zobrazeny ve sloučených sekcích s detaily ve větším zvětšení. Negativní kontrolní barvení jsou zobrazena jako vložky na inverzi a DVL-1 (a). Zvětšení ×40, měřítko 10{{20}} µm. Vztah -tubulinu (d) a inverze (e) k DVL-1 expresi v MCDK, FSGS a CNF (dvoucestná ANOVA následovaná SIDAKovým post hoc testem). Rozdíl ve výšce epiteliálních buněk (f) FSGS, CNF a MCDK pct ve srovnání se zdravou kontrolou (jednocestná ANOVA následovaná Tukeyho post hoc testem, n=50). Rozdíl v celkovém procentu pozitivních buněk -tubulinu, inverze a DVL-1 v MCDK, CNF a FSGS ve srovnání se zdravou kontrolou (g–i), jednocestná ANOVA následovaná Tukeyho post hoc testem. Data jsou uvedena jako průměr ± SD. Významné rozdíly označuje p-hodnota (* p < 0,05,="" **="" p="">< 0,01,="" ****="" p="">< 0,0001).="" dvl-1="" dvl-1="" je="" velmi="" mírně="" exprimován="" pouze="" v="" dezorganizovaných="" tubulech="" mcdk,="" zatímco="" v="" cnf="" jeho="" exprese="" charakterizuje="" dct="" a="" g="" (obrázek="" 5a,b).="" u="" fsgs="" je="" dvl-1="" pozorována="" jako="" mírná="" reaktivita="" v="" g,="" dct="" a="" pct="" (obrázek="" 5c).="" tkáně="" zdravých="" ledvin="" barvené="" na="" dvl-1="" vykazovaly="" významně="" vyšší="" míru="" barvení="" (obrázek="" 5="" h)="" na="" rozdíl="" od="" mcdk="" a="" fsgs="" (p="">< 0,0001,="" oba),="" zatímco="" u="" cnf="" nebyl="" nalezen="" žádný="" významný="">

2.2.6. Vztah mezi expresí -tubulinu a inverzí k DVL-1 v patologicky změněné ledvinové tkáni (MCDK, CNF, FSGS)V MCDK, FSGS a CNF je -tubulin obarven výrazně více než DVL-1 (p < 0.0001,="" v="" tomto="" pořadí,="" obrázek="" 5d).="" inverze="" se="" obarvila="" významně="" výše="" ve="" srovnání="" s="" dvl-1="" v="" mdck="" (p="">< 0,0001)="" a="" ve="" fsgs="" (p="">< 0,01,="" obrázek="">

2.2.7. Rozdíly ve výšce epiteliálních buněk proximálních stočených tubulů mezi zdravou kontrolou a patologicky změněnou tkání ledvin (MCDK, CNF, FSGS)Výška epiteliálních buněk pct (n {{0}} na skupinu) byla porovnána mezi buňkami tubulů ve zdravých ledvinových tkáních a patologicky změněných ledvinových tkáních (obrázek 5b,c,f). Průměrná výška epiteliálních buněk v HC byla 12,91 um ± 1,847 um a byla významně vyšší ve srovnání s CNF a FSGS (p < 0,0001,="" v="" tomto="" pořadí).="" průměrná="" výška="" buněk="" v="" cnf="" pct="" byla="" 9,011="" um="" ±="" 1,453="" um,="" zatímco="" ve="" fsgs="" byla="" 8,114="" um="" ±="" 0,9248="" um.="" pct="" epiteliální="" buňky="" mcdk="" nevykazovaly="" významné="" změny="" ve="" výšce="" (12,17="" um="" ±="" 1,476="" um)="" ve="" srovnání="" s="">

2.2.8. Rozdíly v délce primární řasinky mezi zdravou kontrolou a patologicky změněnou tkání ledvin (MCDK, CNF, FSGS)

Primární délka řasinek (n= 50 na skupinu) byla porovnána mezi HC a patologicky změněnými ledvinovými tkáněmi (obrázek 6c). Tkáně zdravých ledvin a MCDK byly obarveny -tubulinem, aby se zajistila specificita barvení -tubulin cilium (obrázek 6a,b). Ve zdravých ledvinových tkáních bylo primární cilium dlouhé 5,065 µm ± 1,229 µm, zatímco v MCDK, CNF a FSGS byly významně delší (p<0.0005, respectively).="" primary="" cilium="" length="" in="" mcdk="" was="" 9.908="" µm="" ±="" 2.434="" µm,="" in="" cnf="" 13.65="" µm="" ±="" 3.218="" µm,="" while="" in="" fsgs="" was="" significantly="" longer,="" 18.29="" µm="" ±="" 4.717="" µm,="" when="" compared="" to="" hc=""><0.0001) and="" other="" pathological="" kidney="" tissues="" of="" mcdk=""><0.0001) and="" cnf=""><>

Diskuse

Cílem naší studie bylo prozkoumat imunohistochemickou expresi a-tubulinu, inverzi a DVL-1 u ploduledvinovétkáně a postnatální ledvinové tkáně. Dále jsme chtěli prozkoumat, zda je exprese a vzor barvení a-tubulinu, inverze a DVL-1 narušena u různých onemocnění ledvin ve srovnání se zdravou kontrolou. Konkrétně, navzdory rozsáhlému zájmu ostatních výzkumníků o roli a-tubulinu, inverze a DVL-1 během vývoje ledvin, většina předchozích studií používala zvířata nebo experimentální modely in vitro. Pokud je nám známo, jedná se o první studii, která prokázala expresi a lokalizaci a-tubulinu spolu s inverzí a DVL-1 ve fetálních a postnatálních lidských ledvinách a která zkoumala expresi zmíněných proteinů v ledvinách onemocnění, jako je MCDK, FSGS a CNF. Analyzovali jsme také změny délky a vzhledu řasinek pomocí světelné a elektronové mikroskopie, protože naše předchozí studie již naznačila, že poruchy řasinek mohou souviset s cystogenezí u FSGF a CNF [19].

V kanonické Wnt-signalizační dráze vazba ligandů Wnt na receptory rekrutuje Dvl [37]. Procesy MET a dráhy planární buněčné polarity během raných fází morfogeneze ledvin jsou řízeny Wnt signalizací. Zprostředkováním dráhy Wnt primární řasinky řídí buněčnou proliferaci, diferenciaci a tkáňovou morfogenezi [12] prostřednictvím organizace buněčného cytoskeletu a orientace buňky a také prodlužování tubulární struktury [2,38]. V naší studii byly -tubulin, inverze a DVL-1 všechny přítomny ve strukturách ledvin a všechny byly kolokalizovány nejen během vývoje fetálních ledvin, ale také v ledvinové tkáni od 1.5- a {{9} }}letých dětí. Tyto nálezy jsou v souladu s aktivací Wnt-signalizační dráhy, která se prokázala již během tubulogeneze [39]. Naše výsledky navíc odhalily, že exprese -tubulinu a inverze jsou recipročně spojeny s DVL-1 a že vykazují statisticky významný rozdíl mezi jejich expresními vzory. To je v korelaci s experimentálními modely, protože mutace celé rodiny proteinů Dvl u myší má za následek nedostatek procesu gastrulace, zatímco mutace, které nezahrnují celou rodinu proteinů, vykazují defekty v umístění nodálních řasinek spolu s orgánovými defekty [40]. . Předchozí zjištění naznačovala, že inverze hraje roli v migraci buněk u Xenopus pronepros. Protože tento segment koreluje se savčí kličkou Henle a distálních tubulů, mohlo by to naznačovat důležitost inverze během vývoje ledvin i u lidí [41]. V souladu s tímto předpokladem předchozí studie odhalily, že mutace inverzního genu by mohla vést k nefronoftóze typu 2, která je zprostředkována abnormální expresí DVL-1 [42]. Navzdory tomu, že role primárního cilia je kontroverzní v regulaci Wnt-signální dráhy, zjistili jsme, že -tubulin se v analyzovaných vzorcích ledvin kolokalizoval s inverzí a DVL-1. Kromě toho předchozí studie poukázaly na to, že primární cilium spolu s inverzí reguluje degradaci Dvl ovlivněním Wnt-signalizační dráhy [43]. U onemocnění lidských ledvin spojených s rozvojem cyst byla pozorována abnormální lokalizace a funkce primárních řasinek [19]. Podobně tato studie také potvrdila morfologické změny tvorby primárních řasinek u patologických stavů, jako je CNF, FSGS a MCDK. Předchozí nálezy potvrdily, že nadměrná aktivace kanonické dráhy Wnt po poškození ledvin vede k nevratným strukturálním změnám ledvinové tkáně [44]. Naopak primární cilium dostalo roli přechodu z kanonické na nekanonickou dráhu Wnt při pomociledvinovéopravit. Navíc bylo zjištěno, že nadměrná aktivace kanonické dráhy Wnt v transplantované tkáni ledvin má pozitivní prediktivní hodnotu pro fibrózu ledvin [45]. Pokud kanonická dráha Wnt převládá na úkor nekanonické, podporuje to jako výsledek teorii fibrózy ledvin. Naše zjištění snížené exprese -tubulinu a inverze v CNF a FSGS naznačují nečinnost nekanonické Wnt dráhy, zvláště když oba stavy mají tendenci vést ke konečnému stádiunemoc ledvin.Jmenovitě se má za to, že normální lokalizace a funkce primárních řasinek by mohly být faktorem pro udržení pravidelné dráhy Wnt, a tudíž předpokladem pro normální vývoj. Pokud je naopak Wnt dráha zesílena, může to vést k dysregulované buněčné proliferaci a diferenciaci vedoucí ke karcinogenezi [46]. Jak bylo popsáno dříve, kanonická dráha Wnt je povinná pro iniciaci MET a tvorbu nefronu, zatímco její narušení může vést kledvinovéhypoplazie [47]. Naše výsledky podporují tuto myšlenku tím, že odhalují nejnižší expresi DVL-1 s nejvyšší expresí -tubulinu v MCDK ve srovnání se zdravou kontrolou. Tyto výsledky mohou naznačovat nejnižší aktivaci kanonické dráhy Wnt, což by mohlo být základní příčinou absence tvorby nefronů. Naproti tomu nejvyšší exprese -tubulinu s nejnižší expresí DVL-1 by mohla vysvětlit nálezy mnohočetných cyst, protože neexistuje žádná organizovaná elongace a polarizace buněk řízená nekanonickou dráhou Wnt. Předchozí studie také ukázaly, že inverze inhibuje kanonickou signální dráhu Wnt cílením Dvl pro degradaci [26]. Bylo zjištěno, že tento krok jejich interakce je nezbytný pro inhibici kanonické Wnt-signalizace při udržování normálního tubulárního prodloužení a polohy. Inverzní mutace vede k upregulaci kanonické Wnt signalizace, která následně vyvolala abnormální proliferaci v tubulárních buňkách. Tento krok se ukázal jako klíčový v cystogenezi [42], zatímco knockout inverze u myší vede k polycystickému onemocnění ledvin [48]. Podle teorieledvinovécystogeneze je inverze považována za „mykoprotein“, protože se nachází v primární řasenceledvinovétubulární buňky. V naší studii byly primární řasinky přítomny na apikálním buněčném povrchu tubulárních buněk ve všech analyzovaných stádiích, zatímco během fetálních stádií byla exprese -tubulinu silnější než v postnatálním období.

CISTANCHE ZLEPŠÍ BOLESTI LEDVIN/RENÁL

Předchozí studie ukázaly, že primární funkce řasinek může být ovlivněna dysregulací -tubulinu během vývoje, což může vést k cystogenezi, abnormálnímu vývoji ledvin a možnému chronickému onemocnění ledvin v dětství [31,49]. To je v souladu s našimi zjištěními zkrácených a dysmorfních primárních řasinek pozorovaných v MCDK nebo s mnohočetnými a extrémně prodlouženými nebo dislokovanými řasami nalezenými v dilatovaných tubulech CNF a FSGS ve srovnání se zdravou kontrolou. Abychom podpořili skutečnost, že kanonické a nekanonické Wnt-signální dráhy, regulované primárními řasinkami, jsou považovány za povinné pro normální vývoj ledvin, zjistili jsme významně nižší barvení inverze a DVL-1 v MCDK ve srovnání se zdravou kontrolou [31,49]. Rozdílná dynamika expresního vzoru -tubulinu, inverze a DVL-1 v různých fázích vývoje ledvin může naznačovat přepínání mezi kanonickou a nekanonickou Wnt-signalizační dráhou během normální morfogeneze ledvin. Navrhujeme, aby jejich záměna určovala transkripci v kanonické dráze nebo pořadí buněčné migrace a polarizace během vývoje ledvin v nekanonické signální dráze. Jejich rovnováha a exprese ve všech zkoumaných ledvinových strukturách naznačuje jejich důležitou roli v normálním vývoji ledvin. Během normálního vývoje ledvin (od 13. GW do 38. GW) celková exprese -tubulinu, inverze a DVL-1 klesá, protože tkáň ledvin získává zralou morfologii. V 1.5- a 7-rokech starých ledvinových tkání, -tubulin a inverze vykázaly mírné zvýšení exprese, což podporuje skutečnost, že nekanonická dráha Wnt zůstává aktivní i po narození. Naopak, DVL-1 přetrvává se sníženým vzorem exprese, což by mohlo přispět k závěru, že kanonická dráha Wnt je ve zdravé tkáni ledvin umlčena. V důsledku patologických stavů ledvin mohou epiteliální buňky ledvin reagovat s opětovným objevením se EMT a fibrózy [50] spojené s reaktivací kanonické dráhy Wnt [44]. Poruchy -tubulinu, inverze a DVL-1 nalezené u nemocných ledvin proto mohou být základním patologickým mechanismem a důsledkem přechodu z nekanonické na kanonickou Wnt dráhu ve vyvíjející se ledvině s odkazem na přechod mezi reverzibilní ledvinou na ireverzibilní poškození. Dále změny jejich prenatální a postnatálníledvinovéexpresní vzor může být spojen s poškozením funkce ledvin v dospělosti, což vede k vrozeným onemocněním a chronickému selhání ledvin.

4. Materiály a metody

4.1. Lidské vzorky

Vzorky tkáně ledvin plodu byly odebrány po ztrátě těhotenství ve 14., 15., 16., 22. a 38. GW na Gynekologicko-porodnické klinice Fakultní nemocnice Center Split. Veškerý získaný fetální materiál byl vyšetřen patologem a pro studii byly použity pouze tkáně bez známek abnormalit, macerací nebo intrauterinního odumření a s normálním karyogramem. Lékařské záznamy matek byly zkoumány před odběrem vzorků a v případě zdravotních problémů, které by mohly ovlivnit výsledek těhotenství, byly ledvinové tkáně ze studie vyloučeny. Zralost byla určena obvodem hlavy, obvodem břicha a délkou stehenní kosti [51] v korelaci s menstruačními kalendáři pacientek. Po náhodných úmrtích byly odebrány vzorky 1.5- a 7-leté ledvinové tkáně. Vzorky byly získány na Ústavu patologie Fakultní nemocnice Center Split. Vzorky multicystických dysplastických ledvinových tkání (MCDK) byly získány po ztrátě těhotenství, fokální segmentální glomeruloskleróze (FSGS) a nefrotickém syndromu finského typu (CNF) po nefrektomii. Veškerý získaný materiál byl vyšetřen a vyhodnocen patologem, který klasifikoval diagnózy. Protokol studie byl schválen Etickou komisí Lékařské fakulty Univerzity ve Splitu (20. května 2016) v souladu s Helsinskou deklarací a jejími aktualizacemi (klasifikační číslo: 003-08/16-03/0001, registrační číslo: 2181-198-03-04-16-0024, 20. května 2016) [52].

4.2. Imunohistochemie

Fixace odebraného vzorku tkáně byla zpracována 4% paraformaldehydem ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS) po dobu 24 hodin při 22 °C. Po dehydrataci ve 100% etanolu byly vzorky zality v parafínu, jak bylo popsáno dříve [53]. Vzorky byly nakrájeny na řezy o tloušťce 5 um pomocí mikrotomu a následně připevněny na mikroskopická sklíčka. Pro ověření zachování tkáně byl každý 10. řez obarven hematoxylinem a eosinem [54]. Oddělení feminizace a imunohistochemie byly provedeny, jak bylo popsáno dříve [2,55,56]. Po opláchnutí v PBS byla mikroskopická sklíčka inkubována přes noc s primárními protilátkami ve vlhké komoře při 22 °C (systém barvení sklíček StainTray; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Primárními použitými protilátkami byly králičí monoklonální anti-alfa tubulinová protilátka (ředění 1:1000; ab179484, Abcam, Cambridge, UK), králičí polyklonální anti-inverzní protilátka (ředění 1:100; ab65187, Abcam, Cambridge, UK), myší monoklonální DVL -1 protilátka (ředění 1:150; sc-8025, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) a králičí polyklonální protilátka proti gama tubulinu (za účelem ověření primárního barvení specifického pro řasinky pomocí alfa- tubulin, ředění 1:500; ab11321, Abcam, Cambridge, UK). Po opláchnutí v PBS byly po dobu jedné hodiny podávány sekundární protilátky, jak je uvedeno: oslí anti-králičí IgG H&L, Alexa Fluor 488 (ředění 1:400; ab150073, Abcam, Cambridge, UK) a kozí anti-myší IgG H&L, TRITC (ředění 1:400; ab6786, Abcam, Cambridge, UK) 4',6-diamidino-2-fenylindol dihydrochlorid (DAPI) byl použit k barvení jader a po 2-minutové inkubaci sklíčka byly promyty v PBS a překryty montážním médiem a krycími sklíčky. Nespecifickému barvení bylo zabráněno použitím proteinového bloku (ab64226; Abcam, Cambridge, UK) před aplikací primární protilátky. Jako negativní kontrola byl proveden pre-adsorpční test, zatímco specifita sekundárních protilátek byla kontrolována vynecháním primárních protilátek z postupů barvení.

4.3. Elektronová mikroskopie

Fixaceledvinatkání byla provedena ve 4% paraformaldehydu po dobu 24 hodin, po které následovala postfixace v 1% oxidu osmičelého po dobu 1 hodiny. Dehydratační proces byl proveden s ethanolovou řadou a ukončen zalitím do pryskyřice LX 112 [22]. Tenké řezy o velikosti jeden mikrometr byly obarveny pomocí toluidinové modři a studovány pro výběr ultratenkých řezů. Ultratenké řezy o tloušťce 0,05 mikrometrů byly zkoumány po obarvení acetátem uranylu a citrátem olovnatým. K získání mikrofotografií byl použit mikroskop JEOL 1200 EX.

4.4. Genetická analýza

Jak bylo popsáno dříve [19], pomocí leukocytů z periferní krve byla extrahována genomová DNA. Byla nalezena homozygotní missense mutace v genu NPHS1 (c.1096A > C; p.Ser366Arg), která potvrdila diagnózu kongenitálního nefrotického syndromu finského typu (CNF) [57].

CISTANCHE ZLEPŠÍ INFEKCI LEDVIN/RENÁL

4.5. Analýza dat

Analýza řezů byla provedena na fluorescenčním mikroskopu FL s použitím 3 fluorescenčních kanálů FL (Olympus BX51, Tokio, Japonsko). Snímky byly pořízeny digitálním fotoaparátem DP71 (Olympus, Tokio, Japonsko) při vysokém (×40) zvětšení. PouzeledvinovéZajímavé byly kortex obsahující proximální stočené tubuly (pct), distální stočené tubuly (dct) a glomeruly (g). Snímky byly poté zpracovány softwarem ImageJ (Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA, https://imagej.nih.gov/ij/ (přístup 15. října 2018), 1997–2021. ) a Adobe Photoshop (Adobe Inc., San Jose, Kalifornie, USA) k dalšímu vyhodnocení. Před počítáním buněk byl použit nástroj ImageJ s rozdělenými kanály. Poté byla původní imunofluorescenční mikroskopická fotografie odečtena od červeného nebo zeleného kanálu (v závislosti na tom, jaký byl původní kanál) pomocí nástroje ImageJ pro výpočet obrazu, aby se zabránilo úniku signálu. Hodnoty pod prahovou úrovní 50 byly považovány za negativní. Počítali jsme imunoreaktivní signály v buňkách s minimálně 20 strukturami (pct, dct nebo g) na stadium nebo celkový kladný počet buněk na mikrofoto multicystické dysplastikyledvinatkáně, FSGS a CNF. Buňky jsme klasifikovali jako pozitivní, pokud se imunofluorescenční signál nahromadil na jakékoli úrovni membrány, cytoplazmy nebo jádra nad hodnotou 50 měřenou na softwaru ImageJ pomocí prahového příkazu. Negativní buňky byly kategorizovány jako buňky s nepřítomností jakékoli imunoreaktivity. Data analyzovali dva nezávislí vyšetřovatelé.

4.6. Semikvantitativní analýza

Intenzita signálu -tubulinu, inverze a DVL-1 barvení byla hodnocena dvěma nezávislými výzkumníky pomocí softwaru ImageJ. Celková intenzita signálu byla měřena poté, co byl obrázek nastaven v 8-bitovém typu; poté byla vyhodnocena intenzita barvení markerů ve 20 pct, dct ag měřením vyznačené oblasti struktury. Pokud byly výsledky mezi hodnotiteli odlišné, třetí nezávislý výzkumník tuto pochybnost objasnil. Maximální intenzita signálu pro -tubulin byla 84,125 ± 3,214 SD, pro inverzi byla 71,50 ± 2,715 SD a pro DVL -1 80,916 ± 1,875 SD. Nejvyšší sytost barvy signálu na fotografiích mikroskopu byla označena jako 3 (66,66–99,99 procent celkové intenzity obrazu signálu), následuje 2 (33,33–66,66 procent) pro střední intenzitu signálu a 1 (0,33 procenta – 33,33 procenta). pro nízkou intenzitu signálu (tab. 1.).

4.7. Statistická analýza

Pro určení rozdílů mezi stupni a strukturami byl proveden Kruskal–Wallisův test, po kterém následoval Dunnův post hoc pomocí softwaru GraphPad Prism (Graphpad Software Inc., San Diego California, USA, www.graphpad.com (přístup 15. října 2018.)). Počet pozitivních buněk byl vyjádřen v procentech jako střední hodnota ± standardní odchylka (SD), zatímco statistická významnost byla potvrzena při p < 0,05.="" počet="" analyzovaných="" struktur="" byl="" 4200="" ve="" 35="" vzorcích,="" s="" celkovým="" počtem="" 135="" 256="" spočítaných="" buněk.="" použili="" jsme="" 2-way="" anova="" se="" sidakovým="" post="" hoc="" testem="" k="" testování="" rozdílů="" v="" expresi="" -tubulinu,="" inverzi="" a="" dvl-1="" v="" různých="" vývojových="" fázích.="" ke="" studiu="" proteinové="" exprese="" s="" ohledem="" na="" dobu="" vývoje="" jsme="" použili="" lineární="" regresi.="" jednosměrná="" anova="" následovaná="" tukeyho="" post="" hoc="" testem="" byla="" použita="" ke="" zkoumání="" rozdílů="" v="" expresi="" -tubulinu,="" inverzi="" a="" dvl-1="" u="">ledvinatkáně ve srovnání s tkáněmi MCDK, FSGS a CNF. Rozdíly v expresi proteinů mezi MCDK, FSGS a CNF byly zkoumány pomocí 2-way ANOVA následované Sidakovým post hoc testem. Jednocestná ANOVA následovaná Tukeyho post hoc testem byla použita k vyhodnocení rozdílů v délce řasinek a výšce epiteliálních buněk pct mezi zdravou kontrolou a patologickouledvinapapírové kapesníky. Data byla ukázána jako průměrná hodnota ± standardní odchylka (SD) se statistickým rozdílem potvrzeným p <>