Neuroprotektivní výhody cvičení a mitoQ na paměťovou funkci, mitochondriální dynamiku, oxidační stres a neurozánět u stárnoucích potkanů ​​vyvolaných D-galaktózou, část 2

2.6. Příprava tkání

Po dokončení 8 týdnů TE a testů paměťového chování byly všechny krysy usmrceny inhalací CO2 a mozkové tkáně byly odebrány od 7 zvířat v každé léčené skupině.

Test chování paměti je účinným nástrojem pro hodnocení paměti. S rostoucím společenským a pracovním tlakem je paměť lidí stále důležitější. Test chování paměti nám proto může pomoci porozumět úrovni naší paměti a přijmout účinná opatření ke zlepšení a udržení paměti podle výsledků testu.

Konkrétně testy chování paměti mohou vyhodnotit schopnost lidí přijímat, zpracovávat, ukládat a získávat informace. Prostřednictvím testování různých typů informací, jako je jazyk, čísla, obrázky atd., lze plně otestovat paměť lidí. Výsledky testu poskytnou různá skóre, která nám pomohou pochopit naše slabé a silné stránky a jak posílit naši paměť.

V praxi mnoho testů paměťového chování také poskytuje odborné tipy a návrhy. Například dobrý spánek, vyvážená strava, správné cvičení a pravidelná mozková cvičení jsou prospěšné pro zlepšení paměti lidí. Prostřednictvím těchto metod můžeme zlepšit dobu uchování paměti, schopnost reprodukce paměti a další aspekty, abychom se lépe přizpůsobili každodenním životním nebo pracovním potřebám.

Stručně řečeno, test paměťového chování je velmi užitečný pro pochopení, vyhodnocení a zlepšení vlastní paměti. Měli bychom také přijmout vhodné metody k posílení naší paměti podle naší aktuální situace, abychom položili pevný základ pro plnohodnotnější a bohatší život. Je vidět, že potřebujeme zlepšit paměť a Cistanche může výrazně zlepšit paměť, protože Cistanche je tradiční čínský léčivý materiál s mnoha unikátními účinky, z nichž jedním je zlepšení paměti. Účinek Cistanche pochází z různých aktivních složek, které obsahuje, včetně kyseliny tříslové, polysacharidů, flavonoidních glykosidů atd. Tyto složky mohou podporovat zdraví mozku různými způsoby.

Klikněte na možnost Znát krátkodobou paměť, jak se zlepšit

Po oddělení mozkové kůry a hippocampu byla mozková tkáň bleskově zmražena v kapalném dusíku a skladována při -80 ◦C až do analýzy. Zbývajících 5 zvířat bylo použito pro imunohistochemickou (IHC) analýzu.

Po otevření hrudní dutiny procházel levou komorou 50 mM fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS) po dobu 10 minut a poté bylo zvíře perfundováno 4% paraformaldehydem (PFA) ve 100 mM PBS.

Po perfuzní fixaci byl mozek odebrán, umístěn do 4% PFA a fixován po dobu 4 hodin při 4 °C. Fixovaná mozková tkáň byla ponořena do 30% roztoku sacharózy po dobu 2 dnů a poté nařezána na 40 um silné plátky pomocí kryostatu ( Leica Microsystems, Nussloch, Německo).

2.7. Izolace mitochondrií

K izolaci mitochondrií jsme použili Mitochondria Extraction Kit (IMGENEX Corporation, San Diego, CA, USA) podle pokynů výrobce. Na každých 100 mg hipokampální tkáně byl přidán 1 ml homogenizačního pufru.

Po homogenizaci byla tkáň odstřeďována při 900 x g po dobu 10 minut při teplotě 4 °C a supernatant byl odebrán a znovu odstřeďován při 15,000 x g po dobu 30 minut při teplotě 4 °C.

Odebráním centrifugované cytosolové frakce byl cytosol oddělen a zbývající peleta byla důkladně promíchána v 1 ml suspenzního pufru, před centrifugací při 15,000xg po dobu 10 minut při 4 °C.

Supernatant byl odstraněn a byl přidán další 1 ml suspenzního pufru před důkladným promícháním a opětovným odstředěním při 15,000× g po dobu 10 minut při 4 °C.

Supernatant byl odstraněn a zbývající peleta byla rozpuštěna v 1 ml pufru pro kompletní mitochondriální lýzu po dobu 30 minut při 4 °C. Mitochondriální extrakt byl poté centrifugován při 15,000×g po dobu 5 minut při 4°C a byl odebrán supernatant (mitochondriální frakce).

2.8. Western blotting
Celkový protein získaný mitochondriální izolací byl kvantifikován pomocí Bradfordovy metody. Stejné množství mitochondriálních proteinů (30 ug na dráhu) bylo naneseno na elektroforézu na dodecylsulfát-polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) (8 % nebo 12 %).

Po elektroforéze byly proteiny přeneseny na polyvinylidenfluoridovou (PVDF)membránu (Millipore, Boston, MA, USA).

Blokování bylo prováděno po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti s použitím 1×Tris-pufrovaného fyziologického roztoku obsahujícího Tween-20 (TBS-T) roztok s 5% BSA a poté byla membrána ponechána reagovat s primárními protilátkami přes noc při 4 °C.

Byly použity následující primární protilátky: Mfn1, Mfn2, Opa1, Drpl, Fis1, p22 phox, p47 phox, gp91phox, SOD-2, kataláza a -aktin (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, ředění:1 :1000); a TNF- (Abcam, Cambridge, UK, ředění: 1:1000).

Membrány byly poté promyty promývacím pufrem (PBS s 0,1% Tween 20), načež byly inkubovány s kozími anti-králičími sekundárními protilátkami pro p22 phox, gp91 phox a TNF konjugovanými s křenovou peroxidázou (HRP). - (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA, ředění: 1:5000).

Kozí anti-myší sekundární protilátky konjugované s HRP byly použity pro Mfn1, Mfn2, Opa1, Drpl, Fis1, p47 phox, SOD-2, katalázu a -aktin (Santa Cruz Biotechnology, ředění: 1:5000).

Hladiny exprese proteinu byly detekovány pomocí detekčního systému ECL Western blotting (Santa Cruz Biotechnology). Hustoty vyvinutých proteinových pásů byly analyzovány pomocí gelového zobrazovacího systému ChemiDoc XRS (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

2.9. Imunohistochemie (IHC)
Pro IHC analýzu byla použita metoda volného pohybu pro vybranou tkáň v každé léčebné skupině. Po promytí tkáně 3× po dobu 1{3}} min v 0,01 M PBS byla tkáň inkubována při 80 ◦C po dobu 60 min v kádince obsahující 0,01 M citrát sodný, následně blokována v 10 % normální oslí sérum (Millipore Sigma, Burlington, MA, USA).

Vzorek tkáně poté reagoval s primárními protilátkami anti-p22 phox (Santa Cruz Biotechnology, ředění: 1:50}0) a anti-gliálním fibrilárním kyselým proteinem (GFAP) (Abcam, ředění:1:500) po dobu 12 h při 4 ◦C. Následující den byla tkáň promyta 3x po dobu 5 minut v 0,01 M PBS a poté reagovala s HRP-konjugovanou kozí anti-myší sekundární protilátkou (Santa Cruz Biotechnology, ředění: 1:5000) při teplotě místnosti po dobu 2 hodin.

Nakonec byla tkáň inkubována při teplotě místnosti pomocí roztoku Vectastain-Elite ABC kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) a výsledky byly vizualizovány pomocí DABperoxidase Substrate Kit (Vector Laboratories).

Každý tkáňový řez byl upevněn na sklíčko pomocí montážního média (Vector Laboratories) a kontrolován pomocí světelného mikroskopu (Leica Microsystems).

2.10. Statistické analýzy

Data byla analyzována pomocí SPSS pro Windows verze 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Všechny hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM. Statistická významnost byla stanovena pomocí jednocestné ANOVA. Bonferroniho post hoc testy byly použity pro vícenásobná srovnání. Rozdíly byly považovány za statisticky významné při p < 0,05.

3. Výsledky

3.1. Účinky cvičení na běžeckém pásu a MitoQ na expresi proteinů souvisejících s mitochondriální dynamikou v hippocampu stárnoucích potkanů ​​indukovaných D-Gal

Ověřili jsme, že TE a MitoQ ovlivnily faktory související s mitochondriální fúzí (Mfn1, Mfn2, Opa1) a faktory související se štěpením (Drp1, Fis1) v hippocampu stárnoucích potkanů ​​(obrázek 1).

Hladiny exprese faktorů souvisejících s mitochondriální fúzí se mezi léčebnými skupinami významně lišily (Mfn1, F4,34=134,750, p < 0,001; Mfn2, F4,34=80). 816, p < 0,001; Opa1, F4, 34=51,456, p=0,001).

Úrovně exprese faktorů souvisejících s mitochondriálním štěpením se také významně lišily mezi léčebnými skupinami (Drp1, F4,34=53.448, p < 0.001; Fis1,F4,34=116 0,313, p < 0,001). Výsledky post hoc testu jsou zobrazeny na obrázku 1.

Ve srovnání se skupinou Y-CON se exprese faktorů souvisejících s mitochondriální fúzí snížila ve skupině D-CON a vykazovala rostoucí trendy ve skupinách D-TE, D-MI a D-COMBI.

Na druhou stranu exprese mitochondriálního štěpného faktoru Drp1 vzrostla ve skupině D-CON ve srovnání se skupinou Y-CON. Zatímco signály mitochondriálního štěpení byly sníženy kombinovanou léčbou s TE, samotná léčba MitoQ neindukovala významnou změnu.

Další faktor související s mitochondriálním štěpením, Fis1, vykazoval stejné klesající trendy jako Drp1, ale byl také snížen samotnou léčbou MitoQ.

Obrázek 1. Účinek cvičení na běžícím pásu a mitochinonu (MitoQ) na expresi proteinů souvisejících s mitochondriální dynamikou v hipokampu stárnoucích potkanů ​​indukovaných D-galaktózou (D-gal). (A) Reprezentativní Western bloty mitochondriální fúze a proteinů souvisejících se štěpením. (B–F) Denzitometrická analýza pásů Western blot normalizovaných na -Aktin. Data uvedená na Western blotu jsou průměry ze sedmi mozků krys.

-Aktin byl testován jako vnitřní kontrola. Bonferroniho post hoc test byl použit po ANOVA. Hodnoty jsou průměry ± SEM.

a Označuje statistický rozdíl od mladé kontrolní skupiny (Y-CON). b Označuje statistický rozdíl od skupiny D-galaktózové skupiny (D-CON). c Označuje statistický rozdíl od skupiny D-galaktóza plus cvičení na běžícím pásu (D-TE).

d Označuje statistický rozdíl od skupiny D-galaktóza plus MitoQ (D-MI) (p < 0,05). D-COMBI; D-galaktóza plus skupina TE a MitoQ.

3.2. Účinky cvičení na běžeckém pásu a MitoQ na expresi NADPH oxidázových podjednotek v mozkové kůře a hippocampu stárnoucích potkanů ​​indukovaných D-Gal

Pozorovali jsme významné rozdíly mezi léčebnými skupinami v imunoreaktivitě p22 phox v mozkové kůře a hipokampu stárnoucích potkanů ​​(obrázek 2) (CA3,F4,24=18.786, p < 0).{11 }}01, kortex, F4, 24=12 0,662, p < 0,001).

V kortexu skupiny D-CON vykazovaly zvýšenou imunoreaktivitu p22 phox ve srovnání se skupinou Y-CON, která se významně snížila ve skupinách D-TE, D-MI a D-COMBI.

U CA3 byla zvýšená imunoreaktivita p22 phox snížena ve skupinách D-TE a D-COMBI ve srovnání s D-CON. Hladiny proteinové exprese NOX podjednotek p22 phox, gp91 phox a p47phox se mezi skupinami významně lišily (p22 phox, F4, {{10}}.513, p < 0.{{24} }01 phox, F4, 34=57 0,282, p < 0,001;

Výsledky post hoctestu ukázaly významný nárůst hladin NOX podjednotek v D-CON ve srovnání s Y-CON. Hladiny podjednotek NOX však byly nižší ve všech intervenčních skupinách ve srovnání se skupinou D-CON.

Zejména exprese p22 phox a gq91 phox byla významně snížena u D-TE ve srovnání se skupinou D-MI. Tato zjištění naznačují, že cvičení a MitoQ jednotlivě zabraňují stárnutí vyvolanému oxidativnímu stresu v mozku, ale jejich kombinace nevede k žádným dalším účinkům.

Obrázek 2. Účinky cvičení na běžícím pásu a MitoQ na expresi podjednotek NADPH oxidázy v mozkové kůře a hippocampu stárnoucích potkanů ​​vyvolaných D-gal. (A1) Mikrofotografie ukazující imunoreaktivitu NAPDH p22 phox v mozkové kůře a hipokampu D-gal-indukovaných stárnoucích potkanů ​​v každé skupině. Černé obdélníky v A1 označují část snímků, jak je znázorněno na f–i ap–t. (A2, A3) Kvantifikace optické hustoty barvení NADPH p22 phox v mozkové kůře a hipokampu.

Bonferroni post hoc test po ANOVA. Hodnoty jsou uvedeny jako průměry ± SEM. (n=5 zvířat). (a–e a k–o) Měřítko=100 µm, (f–j a p–t) Měřítko=50 µm. (B) Reprezentativní snímky Western blot pro podjednotky NADPH oxidázy v hipokampu.

(C–E) Kvantifikace podjednotek NADPH oxidázy v hippocampu. Údaje uvedené ve Western blotu byly průměry ze sedmi krysích mozků. -Aktin byl testován jako vnitřní kontrola. Bonferroniho post hoc test byl použit po ANOVA. Hodnoty jsou průměry ± SEM.

a Označuje statistický rozdíl od skupiny Y-CON. b Označuje statistický rozdíl od skupiny D-CON. c Označuje statistický rozdíl od skupiny D-TE.(p < 0.05).

3.3. Vliv cvičení na běžeckém pásu a MitoQ na expresi GFAP v mozkové kůře a hippocampal Dentate Gyrus u stárnoucích potkanů ​​indukovaných D-Gal

Pozorovali jsme významné rozdíly mezi léčebnými skupinami v imunoreaktivitě GFAP v mozkové kůře a hippocampal dentate gyrus (DG) stárnoucích potkanů ​​(obrázek 3) (Cortex, F4, 24=13,524, p < 0,001 ; DG, F4,24=30.364).

Výsledky post hoc testu ukázaly, že léčba D-gal významně zvýšila imunoreaktivitu GFAP v kůře i DG.

Ve srovnání se skupinou D-CON byly hladiny GFAP v kortexu sníženy ve všech intervenčních skupinách a hladiny GFAP v DG byly sníženy ve skupinách D-TE a D-COMBI, zatímco skupina D-MI vykazovala rozdíly pouze v imunoreaktivitě GFAP v oblasti kůry.

Ačkoli tedy léčba TE nebo MitoQ snížila neurozánět vyvolaný D-gal v kortexu, pouze intervence TE vyvolala pozitivní účinky v DG.

For more information:1950477648nn@gmail.com