Rostlinná strava je spojována s nižším rizikem rozvoje chronických onemocnění, jako je obezita
Oct 11, 2022
Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací
Abstraktní:Bylo navrženo, že špenátový methanolový extrakt (SME) inhibuje tvorbu konečných produktů pokročilé glykace (AGE), které se zvyšují během progrese diabetu, takže je důležité vědět, zda mají SMEs příznivé účinky na diabetickou sítnici. V této studii testy in vitro ukázaly, že SME inhibuje glykaci, tvorbu karbonylových skupin a depleci redukovaných thiolových skupin v hovězím sérovém albuminu inkubovaném buď redukujícími cukry nebo methylglyoxalem. Účinek SME na sítnici diabetických potkanů indukovaných streptozotocinem (STZ2) byl také studován (n=10) v normoglykemické skupině, STZ, STZ potkanů léčených SME a STZ potkanů léčených aminoguanidinem (anti-AGEs reference skupina) po dobu 12 týdnů. Sítnice byla nařezána a imunobarvena na Ne-karboxymethyl lysin (CML), receptor RAGE, NADPH-Nox4, indukovatelnou syntázu oxidu dusnatého (iNOS), 3-nitrotyrosin (NT), jaderný NF-kB, vaskulární endoteliální růstový faktor ( VEGF), gliální fibrilární kyselý protein (GFAP), protein S100B a test TUNEL. Peroxidace lipidů byla stanovena v celé sítnici hladinami malondialdehydu (MDA). Výsledky ukázaly, že v diabetické sítnici SME snížilo společnou lokalizaci CML-RAGE, oxidační stres (NOX4, iNOS, NT, MDA), zánět (NF-B, VEGF, S10B, GFAP) a apoptózu (p<0.05).therefore, smes="" could="" attenuate="" retinal="" degeneration="" by="" inhibiting="" cml-rage="">
Klíčová slova:špenát; diabetická retinopatie; konečné produkty pokročilé glykace; oxidační stres; zánět; VZTEK; karboxymethyl L-lysin
1. Úvod
Rostlinná strava je spojována s nižším rizikem rozvoje chronických onemocnění, jako je obezita, cukrovka 2. typu a ischemická choroba srdeční. Špenát (Spinacia oleracea L.) je jedlá listová zelenina konzumovaná po celém světě, protože poskytuje značné množství vlákniny, vitamínů a minerálů [1,2]. Bylo identifikováno několik jeho fytochemikálií, včetně chlorofylů, karotenoidů (lutein a zeaxanthin) [3] a fenolických sloučenin (flavony, flavonoidy, kumariny) [4-8] (viz příloha 1). Bylo popsáno, že špenát, pokud je požíván jako potravina, ve vodě rozpustný extrakt nebo v lyofilizované formě, a jeho tylakoidy mají protirakovinné, antiobezitní a hypoglykemické vlastnosti [9]. Protizánětlivý účinek špenátu byl prokázán na zvířecích modelech endotoxémie, obézních zvířatech a zdravých lidech [9]. Jeho antioxidační účinek byl studován na buňkách lidského karcinomu prostaty, zvířecích modelech s obezitou, UV ozařovaných myších a adenokarcinomu prostaty transgenních myší [9,10]. Antiglykační a protizánětlivé účinky špenátového methanolického extraktu (SME) byly studovány na modelu glukózou indukovaného diabetu u zebřiček a isoproterenolem indukované nekrózy myokardu u potkanů [11,12]. SME snížilo hladiny glykosylovaného hemoglobinu a fruktosaminu, včetně hladin glykovaného proteinu, snížením aktivity aldózareduktázy v oční čočce [11]. Výše uvedená zjištění naznačují, že malé a střední podniky mohou mít preventivní účinek na progresi komplikací diabetes mellitus, jako je diabetická retinopatie (DR).
DR progresivně vede ke ztrátě zrakové ostrosti nebo slepotě, což souvisí se zánětem, oxidačním stresem a akumulací konečných produktů pokročilé glykace (AGE)[13,14]. AGE indukují zesíťování proteinů, mění strukturu/funkci a jeho obrat/clearance. AGE mohou být produkovány neenzymovou reakcí mezi glukózou a volnou aminoskupinou proteinů, za vzniku reverzibilních meziproduktů, jako jsou Schiffovy báze a Amadoriho produkty (fruktosamin)[15]. Mezi další mechanismy tvorby AGE patří dráha „karbonylového stresu“, kdy oxidací cukrů a lipidů vznikají dikarbonylové intermediární sloučeniny, jako je glyoxal a methylglyoxal (MGO), které vedou k tvorbě AGE jako N:-karboxymethyl lysin (CML)[ 16]. Zvýšené hladiny CML v séru a sklivci mohou být biochemickým markerem jak pro vznik, tak pro progresi DR [17,18]. V sítnici vyvolává aktivace receptoru RAGE pomocí AGEs (AGEs-RAGE) nadměrnou expresi gliálního fibrilárního kyselého proteinu (GFAP) a prozánětlivých faktorů, regulovaných nukleárním faktorem kappa-light-chain-enhancer aktivovaného B buňky (NF-kB)[19]. NF-kB pozitivně reguluje expresi RAGE tím, že působí jako mechanismus pozitivní zpětné vazby [20].co je cistancheNa druhé straně vysoké koncentrace S100B, proteinu vázajícího vápník, mohou také aktivovat NF-kB, indukovat neurozánět a aktivaci gliových buněk [21]. Nadměrná exprese S100B v astrocytech vyvolává neurotoxické účinky projevující se retinální astrogliózou [22].
Cistanche může proti stárnutí
Byly experimentálně vyvinuty strategie k prevenci poškození sítnice. Některé fytochemikálie špenátu izolované z jiných rostlin byly spojovány s inhibicí AGEs a oxidačního stresu [8,23-26]. Lutein, astaxanthin a kaempferol chrání lidské retinální pigmentové epiteliální buňky (ARPE-19) před poškozením díky svým anti-AGEs, antioxidačním a antiapoptózovým vlastnostem [26-28]. Tyto výsledky naznačují, že fytochemikálie špenátu mají relevantní roli v prevenci degenerace sítnice, jako je DR. Další strategií bylo použití aminoguanidinu (AG) jako účinného inhibitoru glykace a aktivity iNOS, zmírňující akumulaci CML a tvorbu reaktivních di-karbonylových prekurzorů u potkanů [29]. V multicentrické a randomizované klinické studii s 690 diabetickými pacienty však nebyl příznivý účinek jednoznačně prokázán [30].
Změny v degeneraci sítnice za hyperglykemických podmínek byly sotva studovány. Proto je zajímavé vědět, zda SME chrání retinální vrstvy před poškozením souvisejícím s jeho anti-AGEs, antioxidačními a protizánětlivými vlastnostmi v sítnici diabetických potkanů vyvolaných streptozotocinem.
2. Materiály a metody
2.1.Příprava metanolového extraktu ze špenátu (SME)
Čerstvé listy špenátu (S.oleracea L.) byly sklizeny v období podzim-zima na zemědělském poli v provincii Puebla v Mexiku a byly identifikovány botanikem v herbáři Národního polytechnického institutu (IPN, Mexico City, Mexiko). Poukazový exemplář číslo 4532 byl uložen v herbáři Národní školy biologických věd IPN.
Listy byly dehydrované a jemně mleté. Sušené listy byly macerovány methanolem při pokojové teplotě, filtrovány přes celulózové filtry (Whatman, Maidstone, UK) a sušeny pomocí rotační vakuové odparky (BUCHI Rotavapor R{{0}}, Švýcarsko) při 45 stupních až výtěžek zelené gumy (95,0 g/kg suchých listů).Čistota proti stárnutíSME byl skladován ve tmě při 4 stupních až do použití. Pro všechny testy byl extrakt rekonstituován v destilované vodě[11].
2.2. In vitro testy antiglykační aktivity malých a středních podniků
2.2.1. Tvorba konečných produktů pokročilé glykace odvozených z bovinního sérového albuminu (BSA-AGEs)
Test BSA-AGEs byl proveden, jak bylo popsáno dříve [31]. Stručně řečeno, 10 mg/ml BSA (frakce V; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) byl přidán buď v D-glukóze 0,5 M, D-fruktóze {{12 }} 0,5 M nebo methylglyoxal 2,5 mM a připravené v roztoku 0,1 M PBS (pH 7,4) a 0,02 procenta azidu sodného. Koncentrace SME (5, 10, 25, 50, 100 a 200 mg/ml) byly přidány do každé směsi a poté inkubovány při 37 stupních po dobu 4 týdnů. Poté byly nezreagované cukry odstraněny dialýzou proti destilované vodě po dobu dvou dnů při 4 stupních. Hladiny BSA-AGE byly stanoveny fluorescenční spektrofotometrií (Ex370/Em 440 nm; model LS 30, PerkinElmer LAS Ltd., Buckinghamshire, UK)[32]. Glykace BSA proteinu redukujícími cukry a MGO byly pozitivní kontrolou (BSA glykovaný), zatímco inkubace BSA glykovaného s aminoguanidinem (1 mg/ml) byla použita jako negativní kontrola (BSA glycated-AG). Testy byly provedeny v triplikátech.
2.2.2. Fruktosaminový test
Hladina fruktosaminu byla stanovena testem nitrotetrazoliové modři (NBT) [33], který je založen na schopnosti fruktosaminu redukovat NBT za vzniku formazanu, barevného konečného produktu za alkalických podmínek. Deset mikrolitrů buď kontrol nebo glykovaného BSA-inkubovaného SME koncentrací (BSA-SME) bylo přidáno k 90 μl NBT při 2,5 mM, připraveném v uhličitanovém pufru (0,1 M; pH 10,3); všechny byly inkubovány při 37 °C po dobu 30 minut. Byla měřena absorbance při 530 nm. Koncentrace fruktosaminu (nmol/mg) byly vypočteny podle standardní křivky formazanu.
2.2.3. Stanovení tvorby karbonylových skupin a deplece thiolových skupin v BSA-AGEs
Koncentrace karbonylové skupiny byla měřena v BSA-SME a kontrolních vzorcích, podle Levine et al. [34]. Roztok 2,4-dinitrofenylhydrazinu (DNPH;10 mM) ve 400 ul 2,5 M HCl byl přidán ke 100 ul každého vzorku a inkubován ve tmě po dobu 60 minut při teplotě místnosti.cistanche benefíciosPoté bylo přidáno 500 μl kyseliny trichloroctové (20 procent w/v) a ponecháno na ledu po dobu 5 minut. Vzorky byly centrifugovány při 4000 otáčkách za minutu po dobu 15 minut a proteinová peleta byla třikrát promyta směsí ethylacetát/ethanol (1:1 v/v). Poté byly vzorky suspendovány ve 250 ul guanidin hydrochloridu na 6 M. Koncentrace karbonylových skupin (nmol/mg proteinu) byla vypočtena spektrofotometrií při absorbanci 370 nm (EON, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA) za použití absorpční koeficient DNPH (22 000 M-1 cm-1).
Podle Ellmanovy metody bylo provedeno stanovení deplece thiolových skupin v BSA-SME a kontrolních vzorcích. Stručně, 10 μl 5,5'-disulfandiylbis（2-nitrobenzoové kyseliny））(DNTB;10 mM, připravené v PBS）s 50 μl glykovaných vzorků byl inkubován po dobu 15 minut při pokojové teplotě, poté byla měřena absorbance při 410 nm. Hladina volných thiolových skupin byla vypočtena pomocí standardní křivky L-cysteinu（0.4-11 μM） a vyjádřena v nmol/mg proteinu [34].
2.3. Vliv SME na sítnici diabetických potkanů 2.3.1. Indukce diabetu u potkanů
Byli použiti samci krys Wistar o hmotnosti 250 ± 10 gr(N=40) nalačno po dobu 8 hodin. Byla podána intraperitoneální dávka streptozotocinu (60 mg/kg) v citrátovém pufru (10 mM, pH 4,5) (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA) [35]. O tři dny později byla změřena hladina glukózy (glukometr; aktivní ACCU-CHEK; Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Německo) odebráním kapky vzorku krve z ocasu. Do studie byla vybrána zvířata s glykemickými hladinami vyššími než 350 mg/dl. Glukóza v krvi byla měřena týdně po dobu 12 týdnů.
2.3.2. Experimentální design
Diabetické krysy indukované streptozotocinem (STZ) byly náhodně rozděleny do následujících skupin (n =10): STZ léčené intragastricky 2 ml pitné vody (STZ); STZ léčená SME v dávce 400 mg/kg (STZ-SME); normoglykemické krysy (NG); a STZ ošetřené 50 mg/kg aminoguanidinu (AG; Sigma-Aldrich, Inc.) (STZ-AG). STZ-AG byl použit jako anti-AGE referenční skupina. Přiřazené dávky byly podávány každých 24 hodin (9:00) po dobu 12 týdnů. Hladina glykémie ve všech skupinách byla sledována týdně. Dávkovací režim SME při 400 mg/kg byl založen na následujícím: 7 g SME se získá ze 100 g čerstvého špenátu (data nejsou uvedena). Toto množství odpovídá denní spotřebě průměrného člověka 70 kg při americké dietě [36], což odpovídá 100 mg extraktu/kg tělesné hmotnosti.Cistanche Extract Anti RadiationNa druhou stranu vzhledem k rozdílu ve zrychleném metabolismu potkanů se pro srovnávací studie s lidmi doporučuje zvýšit spotřebu jakéhokoli přírodního extraktu až 6,4krát [37]. Dávka 400 mg/kg, kterou jsme použili, vycházela především z výsledků získaných v modelu nekrózy myokardu indukované u potkanů Wistar, které ukázaly, že protizánětlivý účinek SME je významnější při dávce 300 mg/kg [12].
2.3.3. Histologická a imunohistochemická hodnocení
Enukleované oči byly fixovány v neutrálním formalínu a poté byly dehydratovány v odstupňovaných alkoholech a zality v parafínu. Histologické řezy 2 μm byly upevněny na podložní sklíčka s elektrickým nábojem, zbaveny vosku a rehydratovány až do roztoku pro získání antigenu (K035; 10× citrátový pufr, pH 6; Diagnostic BioSystems, Pleasanton, CA, USA). Byl použit imunodetekční systém na bázi polymeru (Detekční systém PolyVuemouse/rabbit DAB, Diagnostic BioSystems). Byly použity následující primární protilátky: gliální fibrilární kyselý protein (anti-GFAP;MAB360; Chemicon International, Inc., Temecula, CA, USA); vaskulární endoteliální růstový faktor (anti-VEGF;sc-7269; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA), S100 protein B vázající vápník (anti-S100B; ab52642; Abcam PLC, Cambridge, UK) a nukleární faktor kappa-lehký řetězec-enhancer aktivovaných B buněk (anti-NF-kB p65;sc{20}}). Všechna ředění byla 1:200 a inkubována přes noc při 4 stupních. Sekundární protilátka (Mouse/Rabbit PolyVueTM) byla přidána podle pokynů dodavatele.cistanche herbaŘezy byly obarveny substrátem DAB plus/chromogen a hematoxylinem. Histologická pozorování a zachycení snímků byly prováděny v mikroskopu Carl Zeiss (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Německo).
Pro imunofluorescenční barvení byla sklíčka inkubována přes noc při 4 °C s následujícími primárními protilátkami: karboxymethyl lysin (anti-CML; ab124145; Abcam PLC, Cambridge, UK), AGE receptor (anti-RAGE; sc-365154), NADPH oxidáza 4 (anti-Nox4;ab133303), 3-nitrotyrosin (anti-NT; ab110282) a syntáza oxidu dusnatého (indukovatelná) (anti-iNOS; A00368-1;Boster Bio, Pleasanton, CA , USA). Poté byly použity následující sekundární protilátky: pro anti-RAGE, kozí anti-myší IgG(FITC)-konjugovaný (1:200; Santa Cruz, Biotechnology, Inc.); pro anti-CML a anti-NT, myší anti-králičí IgG-PE (SC-3753); a pro anti-iNOS a anti-Nox4, m-IgGkBP-PE (Sc-516141). Všechny byly inkubovány při teplotě místnosti po dobu 60 minut. Poté byly řezy upevněny v médiu obsahujícím 4',6-diamidin-2}'-fenylindol dihydrochlorid (DAPI). Anti-CML a anti-RAGE protilátky byly společně hybridizovány na stejném sklíčku. Pro fluorescenční snímky byla použita FLoidTM Cell Imaging Station (Life technologies Carlsbad, San Diego, CA, USA).
2.3.4. Hodnocení apoptózy
Apoptóza buněk sítnice byla detekována podle manuálu popsaného terminální deoxynukleotidyltransferázou (TdT) zprostředkovanou deoxyuridintrifosfátem (dUTP) testem značení na konci (TUNEL) pomocí In situ Cell Death Detection Kit, TMR(tetramethyl-rhodamin{{{ 3}}dUTP) červená, verze 12 (12156792910; Roche Diagnostics). Stručně, odvoskovaná sklíčka byla rehydratována a dvakrát opláchnuta PBS. Poté byly inkubovány s reakční směsí TUNEL ve zvlhčené atmosféře po dobu 60 minut při 37 °C. Poté byly řezy upevněny pomocí DAPI a pozorovány fluorescenční mikroskopií (FLoidTM Cell Imaging Station). IOD pro TUNEL byl vypočten pro vrstvy sítnice.
2.3.5. Test peroxidace lipidů
Pro vyhodnocení hladin malondialdehydu (MDA) v retinální tkáni byly přibližně 3 mg čerstvé tkáně (n=3) homogenizovány a zpracovány, jak bylo uvedeno dříve [38]. Hladiny MDA byly kvantifikovány podle pokynů dodavatele soupravy (testovací souprava OXItek-TBARS, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA).
2.4.Statistická analýza
Pro statistickou analýzu byly všechny mikrofotografie sítnice zachyceny s velikostí 200× ve vzdálenosti 100 μm za oblastí zrakového nervu. Bylo analyzováno přibližně 40 snímků na skupinu zvířat (n=7). Analýza obrazu byla provedena pomocí softwaru Image-Pro Premier verze 9.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA). Použili jsme software GraphPad Prism (La Jolla, CA, USA; verze 8.0). Obrázky ukazují hodnoty vynesené do grafu v rámečkových grafech (medián, první-třetí kvartil, minimální-maximální hodnota) pro vrstvu gangliových buněk (GCL), vnitřní jadernou vrstvu (INL) a vnější jadernou vrstvu (ONL). Průměr a standardní odchylka (průměr ± SD) jsou uvedeny v příloze A (tabulky A1-A3). Ve všech případech byl proveden jednocestný test ANOVA následovaný Tukeyho testem. p<0.05 was="" considered="" statistically="">
