Etanolický extrakt z pískavice řecké seno: jeho molekulární mechanismy proti stárnutí pleti a zlepšené funkce nanoenkapsulací 2
Oct 10, 2022
Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací
2.5. Vliv LNF a extraktu z pískavice na životaschopnost buněk a produkci kolagenu v buňkách lidských dermálních fibroblastů
Pro zkoumání cytotoxicity formulovaného LNF byly buňky ošetřeny slepým pokusem, LNF a extrakty z pískavice řecké seno v {{0}} ug/ml (dvojité ředění) po dobu 24 hodin. Životaschopnost buněk byla měřena pomocí MTT testu. Jak je ukázáno na obrázku 6a, životaschopnost buněk se snížila v buňkách ošetřených extraktem, zatímco žádný účinek nebyl pozorován u slepých buněk a buněk ošetřených LNF. Data ukázala, že LNF vykazoval nižší toxicitu než extrakt. Dále jsme zkoumali schopnost LNF na indukci produkce kolagenu v buňkách lidských dermálních fibroblastů. Buňky byly ošetřeny 7 ug/ml extraktu a 1{{20}}0 ug/ml LNF （7 ug/ml ekvivalentu extraktu), společně s prázdnými částicemi jako kontrolou, po dobu 7 a 14 dní. Jak je znázorněno na obrázku 6b, při léčbě LNF se množství obarveného kolagenu zvýšilo o 30 procent a 50 procent po 7 a 14 dnech, v tomto pořadí, ve srovnání s ošetřením extraktem. Kromě toho, na obrázku 2a, formulovaný LNF zvýšil anti-kolagenázovou aktivitu, protože IC5o byla významně snížena na 0,21 ± 0,03 mg/ml ve srovnání s extraktem z pískavice řeckého sena (0,57 ± 0,02 mg/ml). Tyto výsledky ukázaly, že formulace LNF by mohla potencovat indukci produkce kolagenu v lidských dermálních fibroblastových buňkách a zvýšit antikolagenázovou aktivitu extraktu pískavice řeckého sena. Je možné, že nano-formulace extraktu z pískavice řeckého sena výrazně zlepšuje jeho účinnost jako aktivní složky v produktech proti stárnutí.
2.6. Role formulovaného LNF na inhibici MMP1, MMP9, IL-6 a IL-8 po expozici UV záření
Dále jsme zkoumali některé možné mechanismy LNF na aktivitu proti stárnutí. Expozice UV záření je jedním z hlavních regulátorů stárnutí kůže, protože bylo hlášeno, že indukuje expresi určitých členů rodiny matricových metaloproteináz (MP), které způsobují kolagen kolagenu, včetně MMP1, MMP3 a MMP9 [34,35] . Zjistili jsme, že expozice UV záření byla vysoce toxická pro kokultivované kožní buňky (obrázek 7a) a zvýšila produkci cytokinů MMP1 a MMP9 (obrázek 7b). Kromě toho ošetření extraktem pískavice a formulovaným LNF dokázalo významně snížit sekreci MMP1 a MP9 ve srovnání s kontrolními buňkami po UV ozáření. Tyto výsledky byly v souladu s léčbou rutinem a resveratrolem jako kontrolou proti stárnutí. Je pozoruhodné, že snížení exprese MMP1 a MMP9 v buňkách ošetřených LNF bylo významně nižší než při ošetření extraktem. LNF by tedy mohl snížit sekreci MPI a MMP9 po expozici UV záření a následně zabránit stárnutí kůže vyvolanému působením světla.
Kromě toho může expozice UVR na lidské kůži také zprostředkovat indukci zánětu a aktivaci prozánětlivých cytokinů, jako jsou TNF- a interleukiny, včetně IL-1,IL-2, IL{{4} } a IL-8 [36]. Poté jsme zkoumali funkci LNF na inhibici produkce zánětlivých cytokinů stimulovaných UV zářením, včetně IL-6 a IL-8. Na obrázku 7c jsme pozorovali, že UV záření významně zvyšuje produkci IL{{ 11}} a IL-8 cytokiny v kokultivovaných kožních buňkách. Významné snížení exprese IL-6 a IL-8 bylo pozorováno při léčbě extraktem z pískavice řecké ve srovnání s kontrolou. Je zajímavé, že léčba extraktem z pískavice řeckého sena vykazovala podstatně vyšší inhibici IL-6 a IL-8 ve srovnání s rutinem, kde byly tyto inhibiční aktivity podobné skupinám léčeným resveratrolem. Je pozoruhodné, že exprese IL-6 a IL-8 v buňkách ošetřených LNF byly významně nižší ve srovnání se skupinou s extraktem pískavice řeckého se po expozici UV záření. Tyto výsledky společně ukázaly, že LNF by mohl potenciálně inhibovat produkci IL-6 a IL{24}} zprostředkovanou UV zářením a následně zabránit fotostimulovanému zánětu kůže a stárnutí kůže.V důsledku toho tyto výsledky naznačují, že ethanolový extrakt z pískavice a jeho nano-formulace by mohly být potenciálně použity jako aktivní složky pro prevenci stárnutí.
3. Diskuse
V několika studiích bylo prokázáno, že extrakt z pískavice má antioxidační, antiradikálové a protizánětlivé účinky [29,37], ačkoli jeho vlastnosti proti vráskám nebyly dosud využity. Tento výzkum byl prvním, který identifikoval aktivitu proti stárnutí extraktu pískavice řeckého pomocí in vitro testu inhibice kolagenázy. Předchozí studie navrhovaly použití rostlinných extraktů s antikolagenázovou aktivitou jako aktivní složky v kosmetických produktech, jako je extrakt z hroznových výlisků [38], extrakt ze zeleného čaje [39] a extrakt z hub [40]. Navíc účinek extraktu z pískavice na produkci kolagenu v buňkách lidských dermálních fibroblastů nebyl nikdy popsán. Tamara a kol. (2006) prokázal vliv flavonoidů na syntézu kolagenu v lidských fibroblastech pomocí rutinu jako aktivní sloučeniny extraktu pískavice řeckého sena, který napomáhá ke zvýšení kolagenu [41]. Tato studie pískavice prokázala její slibnou schopnost proti stárnutí a představovala rutin jako biologický marker.
V této studii byl použit rutin (3),4',5.7-tetrahydroxy-flavon-3-rutinosid), protože jde o flavonolový glykosid, který byl hlášen u několika rostlin, včetně Fagopyrum esculentum Moench, Ruta graveolens L, Sophora japonica L., Eucalyptus spp. [37l, a pískavice řecké seno[17]Rutin má antioxidační, cytoprotektivní, antikarcinogenní, neuroprotektivní a kardioprotektivní účinky, a proto nabízí jeho uplatnění v prevenci stárnutí a nemocí souvisejících se stárnutím. Naše výsledky ukázaly, že připravený extrakt vykazoval vysoký obsah rutinu, který byl v jiných studiích jako součást extraktu z pískavice jen stěží nalezen nebo detekován. Většina dalších studií uvádí trigonelin jako hlavní chemickou složku extraktu z pískavice řeckého sena [18,37,38,42-47].
Dokonce i extrakt z pískavice má potenciální aktivitu jako prostředek proti stárnutí. Jeho barva a stabilita jsou pro tuto aplikaci stále výzvou. Nanoenkapsulace byla popsána jako specifická technologie, která je schopna stabilizovat, maskovat zápach, zvýšit rozpustnost ve vodě, řídit uvolňování biologických sloučenin [48,49] a zlepšit fyzický vzhled přírodních produktů. Liponiosom byl v této studii použit díky svým jedinečným vlastnostem, které se skládají z hydrofilních a hydrofobních skupin, které mohou zapouzdřit širokou škálu látek s různou rozpustností [50]. Vytvořili jsme zapouzdřené liposomy s extraktem pískavice řeckého sena (LNF), což je hybridní nosič obsahující vlastnosti liposomů a niozomů. Hybridní složky vyvinutého LNF byly potvrzeny teplotou tání pomocí DSC, odrážející jak tepelné charakteristiky liposomů, tak niosomů.
cistanche může proti stárnutí
Stratum corneum je vnější vrstva kůže, která funguje jako účinná bariéra proti škodlivým látkám tím, že omezuje jejich transport přes kůži. Bylo však prokázáno, že použití nanonosičů zlepšuje transdermální podávání zvýšením penetrace léků nebo látek přes tuto bariéru[51]. Ke zkoumání účinnosti LNF na transdermální podání byla použita ex vivo penetrace prasečí kůží, protože její anatomické charakteristiky jsou většinou podobné vlastnostem lidské kůže, pokud jde o tloušťku kůže, folikulární strukturu a hustotu chlupů [52]. Naše výsledky ukazují, že propustnost LNF byla větší a hlubší než extrakt z pískavice a rutin a profil uvolňování LNF měl pomalejší uvolňování než extrakt z pískavice, což naznačuje, že formulovaný LNF byl při pronikání kůží znatelně lepší než extrakt z extraktu. Kromě toho formulovaný LNF zvýšil anti-kolagenázovou aktivitu, protože IC-A byla významně snížena na 0,205±0.03 mg/ml ve srovnání s pískavicí řecké seno extrakt (0,567 ± 0,02 mg/ml). Tyto výsledky ukázaly, že formulace LNF by mohla potencovat indukci produkce kolagenu v lidských dermálních fibroblastových buňkách a zvýšit antikolagenázovou aktivitu extraktu pískavice řeckého sena. Nano-formulace extraktu z pískavice může pomoci zlepšit její účinnost, protože ji používá jako aktivní složku pro prevenci stárnutí.
Vystavení UV záření je hlavním faktorem vnějšího stárnutí kůže, známého jako předzralé stárnutí nebo fotostárnutí [53,54]. Záření způsobuje aktivaci buněčných povrchových receptorů kožních keratinocytů a fibroblastů, což vede k indukci exprese dermální extracelulární matrix, zejména rodiny matrixových metaloproteináz (MPs). Bylo prokázáno, že chronická expozice nízkým dávkám UVA způsobuje upregulaci mRNA hladin kolagenázy-1 (MMP1), stromelysinu-1 (MMP3) a gelatinázy A (MMP2)[55]. V důsledku toho dochází k degradaci kožních kolagenových elastických vláken a také k zastavení syntézy nového kolagenu. Tento jev ovlivňuje integritu, elasticitu a struktury kůže po deregulaci ochranných funkcí kůže, což je zodpovědné za tvorbu vrásek a známky stárnutí kůže [54,56]. Kromě toho expozice UVR na lidské kůži zprostředkovává expresi TNF-alfa, který je důležitým regulátorem zánětlivé kaskády v kůži. UV záření také iniciuje aktivaci jak zánětu, tak sekrece prozánětlivých cytokinů, jako je interleukin-2 (IL-2) a interleukin-6 (1L-6) [36] . V důsledku toho má tato zánětlivá reakce indukovaná UVR důležitou roli při indukci spálené kůže se známkami zarudnutí, podráždění a erytému [35,59].
Pro zabránění příčině předčasného stárnutí by tedy bylo ideální najít nějaké nové aktivní látky s těmito preventivními funkcemi. Naše výsledky ukázaly, že formulace LNF by mohla potencovat indukci produkce kolagenu v lidských dermálních fibroblastových buňkách, mohla by snížit sekreci MP1, MP9, IL-6 a IL-8 po expozici UV záření a mohla by zvýšit antikolagenázovou aktivitu extraktu z pískavice řecké seno. Etanolový extrakt z pískavice a jeho nanoformulace by proto mohly být potenciálně použitelné jako nová aktivní složka v kosmetických produktech a že nanoenkapsulace je schopna zvýšit funkci a aktivitu extraktu z pískavice jako prostředku proti stárnutí. 4.Materiály a metody
4.1. Rostlinné materiály a chemická činidla
Fenugreek seed powder was received from Herbal Acharn'sHome Co.,Ltd. (Bangkok, Thailand). Rutin trihydrate (>98procentní čistota), tricinový pufr, kolagenáza z Clostridium histolyticum a FALGPA (N-[3(2-furyl)akryl)-Leu-Gly-Pro-Ala), přímá červeň 80, kyselina pikrová a dimethylsulfoxid byly zakoupeno od Sigma-Aldrich (St.Louis,MO, USA)Acetonitril, ethylacetát, absolutní ethanol, kyselina mravenčí, dehydrovaný fosforečnan sodný, hydrogenfosforečnan sodný, kyselina chlorovodíková a hydroxid sodný byly zakoupeny od Carlo Erba (Emmendingen, Německo). Ethanol komerční kvality byl zakoupen od Italmar Co., Ltd. (Bangkok, Thajsko). Cholesterol byl zakoupen od Cosmeplus Co., Ltd. (Bangkok, Thajsko). Směs propylenglykolu a solubilizátoru byla zakoupena od S.Tong Chemicals Co,Ltd. (Nonthaburi, Thajsko). Sorbitan oleát byl zakoupen od Croda Co., Ltd. (Bangkok, Thajsko). Fosfolipid (Phospholipon 90G) byl zakoupen od Cargill Siam Ltd. (Bangkok, Thajsko). Tokoferolacetát byl zakoupen od Namsiang Co, Ltd. (Bangkok, Thajsko). Konzervační prostředek byl zakoupen od Forecus Co., Ltd. (Bangkok, Thajsko). Paraformaldehyd byl zakoupen od Himadia Laboratories (Mumbai, Indie) a 3-(4,{14}}dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid byl zakoupen od Calbiochem (Burlington, MA, USA).
4.2.Extrakce
Prášek ze semen pískavice (500 g) byl macerován s 95% ethanolem (1:5) po dobu 3 dnů. Extrakce byla opakována třikrát (3 x 2500 ml). Celý roztok extraktu byl zfiltrován a ethanol odpařen pod 100 mbar při 40 stupních za použití rotační odparky (Heidolph, Schwabach, Německo). Získaným extraktem byla olejovitá žlutohnědá pasta s 5% výtěžkem (hmotn./hmotn.) a byla udržována při 4 stupních až do použití.
4.3. UHPLC validace a identifikace rutinu v extraktu z pískavice řecké seno
K analýze extraktu z pískavice byl použit trihydrát rutinu jako standardní marker. Metoda UHPLC byla vyvinuta a ověřena z hlediska linearity, přesnosti, přesnosti a citlivosti[31,32] systémem Shimadzu LC-30 AD UHPLC obsahujícím detektor diodového pole SPD-M20A a autosampler SIL-30AC. Metoda používala kolonu SUPLECO Titan C18 (5 cm × 2,1 mm, 1,9 um, SUPLECO, Burlington, VT, USA) při 30 stupních a detekovala vlnovou délku 26{{ 19}} nm. Mobilní fáze byla upravena podle Kennyho et al. [45]. Krátce, 0.0Bylo připraveno 5 % v/v roztoku kyseliny mravenčí v ultračisté vodě (A) a 0,05 % v/v kyseliny mravenčí v acetonitrilu (B). s průtokem 0,25 ml/min v gradientovém režimu: výchozí podmínka byla 10 procent B po dobu 1,0 minuty, zvýšeno na 75 procent B po dobu 3,5 minuty, sníženo na 10 procent B po dobu 0,75 minuty a udržováno po dobu 0,25 minuty.
4.4. Kolagenázový test
Ke stanovení anti-kolagenázové aktivity byl proveden kolagenázový test [60]. Směsný roztok obsahující 25 μl 50 mM tricinového pufrového roztoku (pH 7,5), 25 μl 2 jednotek/ml kolagenázy (clostridium histolyticum typ IA) a 25 μl vzorku, byl připraven a inkubován při teplotě místnosti po dobu 15 min. K zahájení reakce bylo do roztoku směsi přidáno 10 ul syntetického substrátu a 2 mM N-[3-(2-furyl)akryloyl-Leu-Gly-Pro-Ala(FALGPA) a inkubováno po dobu 20 min. Změna absorbance každého supernatantu byla měřena při 340 nm (čtečka mikrodestiček Synergy H1) a hodnoty IC50 byly vypočteny vynesením lineární regresní křivky ukazující koncentrace vzorku na ose x a procento inhibice na ose y. Procento inhibice bylo vypočteno pomocí následující rovnice:
4.5. Buněčná kultura
Lidské dermální fibroblastové buňky byly zakoupeny od American Type Culture Collection: ATCC (PCS{0}}) a imortalizované lidské keratinocyty (HaCaT) byly zakoupeny od Cell Lines Service, Německo (kat. č. 300493). Buňky byly kultivovány v Dulbeccově modifikovaném Eaglově médiu (DMEM) (Gibco, UK) doplněném 10 procenty FBS (Gibco, Spojené království), 1 procentem penicilinu (100 jednotek/ml) a streptomycinem (100 ug/ml) (Gibco, St. Louis , MO, USA). Buňky byly inkubovány při 37 stupních v prostředí 5 procent oxidu uhličitého.
4.6. Obsah kolagenu a barvení Picrosirius Red
Lidské dermální fibroblastové buňky byly nasazeny v množství 2,5 x 104 buněk/jamku do 48jamkových destiček a inkubovány po dobu 24 hodin. Buňky byly poté ošetřeny různými koncentracemi liponio-some bez extraktů (označeno jako prázdné), extraktem z pískavice řeckého se zapouzdřením (LNF) a extraktem z pískavice po dobu 7 a 14 dnů s 005 procenty DMSO použitý jako kontrola vehikula. Média se měnila každé 2 dny. Buňky byly poté promyty PBS a fixovány 100 ul 4% PFA po dobu 10 minut. Buňky byly promyty PBS (dvakrát) a barveny 100 ul 0,1% roztoků přímé červeně 80 po dobu 10 minut. Po obarvení bylo přidáno 0,01 NHCI v 70% ethanolu, aby se promyl přebytek barviva. Obarvený kolagen byl rozpuštěn v 10 ul 0,5 N NaOH a absorbance byla měřena při 540 nm pomocí čtečky mikrodestiček (Synergy H1 microplate reader). Procento obsahu kolagenu bylo vypočteno pomocí následující rovnice:
4.7. Test životaschopnosti buněk
Lidské dermální fibroblastové buňky byly nasazeny v množství 2 x 104 buněk/jamku do 96jamkových destiček a inkubovány po dobu 24 hodin. Po inkubaci byly přidány různé koncentrace (0-100 ug/ml) lipozomů bez extraktů (blank), LNF a extrakt z pískavice a kultivovány po dobu 24 hodin. Poté bylo do každé jamky přidáno 100 ul MTT (1 mg/ml) a inkubováno po dobu 4 hodin. K rozpuštění formazanového produktu byl přidán DMSO. Absorbance byla měřena při 570 nm pomocí čtečky mikrodestiček (Synergy Hl microplate reader). Procento životaschopnosti buněk bylo vypočteno pomocí následující rovnice:
4.8. Formulace liponiozomů
Pro formulaci liposomů byla použita předemulgace po homogenizaci. Směs fosfolipidu a emulgátoru byla použita k vytvoření sférické lipidové dvojvrstvy a cholesterol byl použit ke zvýšení tuhosti částic [15]. Stručně řečeno, sójový lecitin, cholesterol a emulgátor byly dispergovány v propylenglykolu a zahřívány na 70-80 stupeň (olejová fáze), jak je uvedeno v tabulce 2. Extrakt pískavice se rozpustil v propylenglykolu/vodě (vodná fáze) a zahříval v stejná vodní lázeň. Vodný roztok extraktu byl kontinuálně přidáván do lipidových složek a homogenizován při 8000-100 otáčkách za minutu po dobu 5-10 min za použití vysokorychlostního míchání (Heidolph Silent Crusher M, Kenilworth, N, USA). Směs byla ochlazena na 50 stupňů a přidal se tokoferolacetát a homogenizoval se další 10 min, aby se získal LNF. Morfologie LNF byla pozorována transmisní elektronovou mikroskopií (TEM, JEOL, Peabody, MA, USA), přičemž hydrodynamická velikost, index polydisperzity Pdl a zeta potenciál byly zkoumány pomocí dynamického rozptylu světla (DLS, Nanosizer ZS, Malvern Instruments, Worcestershire, SPOJENÉ KRÁLOVSTVÍ). Potvrzení chování při tání liposomů bylo zkoumáno pomocí diferenciální skenovací kalorimetrie (DSC, Mettler Toledo DSC1). Viskozita vzorku byla měřena digitálním viskozimetrem Brookfield (model HBDV-IIIU CP). Stručně řečeno, bylo použito 0,5 g vzorků a viskozita byla zkoumána pomocí vřetena CP-40 s řízenou rychlostí při 0,5 otáčkách za minutu po dobu 20 minut při teplotě okolí.
Pro hodnocení stability LNF byly částice udržovány při 4 stupních, 25 stupních a 40 stupních po dobu 3 měsíců a byly zkoumány změny velikosti částic a morfologie.
Lipozomový a noisomový enkapsulační extrakt z pískavice řecké seno (LF a NF) byly formulovány za použití podobné metody jako LNF. LF byl připraven bez přidání sorbitanoleátu do olejové fáze, zatímco niosom (NF) byl připraven bez přidání fosfolipidové složky. Jejich fyzikálně-chemické charakteristiky byly uvedeny v doplňkové tabulce S1.
4.9. Procenta účinnosti enkapsulace a bioaktivní zátěže
Účinnost zapouzdření (procento EE) a bioaktivní náplň (procento BL) LNF byly vypočteny stanovením množství zapouzdřeného léčiva za použití techniky ultrafiltrace. Množství rutinu bylo použito jako standardní marker. Poté, co bylo 20 mg/ml LNF rozpuštěno v DI vodě, bylo centrifugováno při 80, 000 otáčkách za minutu po dobu 4 hodin. Supernatant byl odebrán a poté byl neenkapsulovaný rutin vyhodnocen pomocí techniky ultra-vysokoúčinné kapalinové chromatografie (UHPLC)[61]. Procento EE a procento BL byly vypočteny pomocí následujících rovnic:
4.10.Franzova difúzní cela
In vitro propustná studie 7 mg/ml extraktu z pískavice řeckého sena a LNF byla zkoumána na systému Franzových difúzních buněk [62]. Syntetická membrána (Biomax 50}0 kDa ultrafiltrační disk, Merck, MA, USA) byla umístěna mezi donorový a receptorový kompartment. Fosfátový pufrový fyziologický roztok (PBS) s pH 5,5 byl míchán při 50 otáčkách za minutu (37 stupňů) a použit jako receptorové médium. Extrakt z pískavice a LNF byly aplikovány na membránu v uzávěru dárcovských buněk. Vzorky byly proniknuty přes membránu a odebírány z receptorového kompartmentu v 0, 2, 4, 6, 8, 12 a 24 h. Kumulativní permeovaný rutin byl vyhodnocen a vypočítán technikou UHPLC.
4.11. Permeabilizace prasečí kůže
Permeace LNF přes prasečí kůži byla vizualizována zobrazovacím hmotnostním mikroskopem (IMS, SHIMADZU, model: iMScopoe TRIO, Kyoto, Japonsko). Vepřová kůže byla nařezána na 1,5 x 1,5 cm2. Rutin, extrakt z pískavice řecké seno a LNF byly aplikovány na naříznutou prasečí kůži a skladovány při 4 stupních po dobu 24 hodin. Vzorky byly nařezány pomocí kryostatu, umístěny na podložní sklíčko potažené oxidem india a cínu a postříkány 9-aminoakridinovou matricí (9-AA). Vzorky byly skladovány při -20 stupních před analýzou. Překrytí optických obrazů rutinu bylo analyzováno při 609,15 m/z.
4.12. Charakterizace diferenciálních skenovacích kalorimetrů (DSC).
Analýza diferenciální skenovací kalorimetrie (DSC) byla provedena pro stanovení bodu tání LNF pomocí diferenciálního skenovacího kalorimetru (DSC, Mettler Toledo DSC1)[63]. Po přesném zvážení byly vzorky umístěny do hliníkových misek a uzavřeny víkem. V procesu skenování byla aplikována rychlost ohřevu 10 stupňů v teplotním rozsahu od 25 do 350 stupňů pod plynným dusíkem profukovaným rychlostí 40 ml/min. 4.13. Konstrukce lidských kokultivovaných kožních buněk
Lidské dermální fibroblastové buňky byly nasazeny v množství 8,5 x 104 buněk/jamku do 12jamkových kultivačních vložek (Corning, Corning, NY, USA) a kultivovány po dobu 24 hodin. Druhá a třetí vrstva dermálního fibroblastu byla opakovaně přidávána na první vrstvu v po sobě jdoucích dnech. Po 24 hodinách po přidání třetí vrstvy byl HaCaT naočkován při 8,5 × 10 stupních buněk/jamku na vytvořené fibroblastové vrstvy a kultivován dalších 24 hodin před experimentem.
4.14. Zkoumání životaschopnosti buněk a sekrece MMP po expozici UV v kokultivovaných kožních buňkách
Lidské kokultivované kožní buňky byly předem ošetřeny 7 ug/ml extraktu a 100 ug/ml LNF (7 ug/ml ekvivalence extraktu), spolu se 100 ug/ml slepého pokusu a 10 ug/ml resveratrolu jako pozitivní kontroly , po dobu 24 hodin. Společně kultivované kožní buňky byly poté dvakrát promyty PBS a vystaveny 5 J/cm2 UVA a 30 mJ/cm2 UVB záření (Solar Simulators, NY, USA). Po UV ozáření byly kokultivované kožní buňky dále inkubovány s testovanými vzorky po dobu 24 hodin. Supernatant byl poté odebrán pro kvantifikaci MMP1 a MP9. Hladiny UV-indukovaných sekrecí MMP1 a MMP9 v lidských kokultivovaných kožních buňkách byly měřeny pomocí souprav pro imunosorbentní testy (MMP1: ab215083 a MMP9: ab100610, abcam, Cambridge, UK) podle výrobních protokolů.
Životaschopnost lidských kokultivovaných kožních buněk po expozici UV záření byla hodnocena pomocí luminiscenční testovací soupravy CellTiter-Glo pro stanovení životaschopnosti buněk (Promega, Madison, WI, USA). Po 24 hodinách expozice UV záření byly kokultivované kožní buňky dvakrát promyty PBS a do každé jamky bylo přidáno 100 ul Glo Lysis Buffer (Promega, Madison, WI, USA). Po inkubaci po dobu 10 minut bylo přidáno 50 ul činidla CellTiter-Glo a inkubováno při teplotě místnosti po dobu 10 minut. Luminiscenční signál byl poté měřen pomocí mikrodestičkového luminometru (SpectraMax L, Molecular Devices).
4.15 Statistická analýza
Výsledky byly uvedeny jako průměr ± standardní odchylka (SD). Významné rozdíly byly analyzovány Studentovým testem nebo jednosměrnou či dvoucestnou analýzou rozptylu (ANOVA), po které následoval Tukeyho post hoc test (GraphPad Prism 9), s hodnotami p<0.05 considered="" statistically="">
5. Závěry
Tento výzkum společně přinesl dva alternativní návrhy. Za prvé, rutin nebyl pozorován pouze z hlediska ochrany před ultrafialovým zářením a antioxidační látky, ale byl také používán jako standardní marker otisků prstů chromatogramu a klíčový odkaz na aktivitu proti stárnutí extraktu ze semen pískavice řeckého sena. Za druhé byly demonstrovány molekulární mechanismy, které jsou základem etanolového extraktu proti stárnutí. Extrakt vykazoval nové biologické vlastnosti, jako je anti-kolagenázová aktivita, indukce produkce kolagenu a inhibice degradace kolagenu, což je potenciální alternativní přírodní prostředek proti stárnutí pro produkty proti stárnutí. Techniky zapouzdření lze použít k ochraně bioaktivních sloučenin a procesů chemické a fyzikální degradace a k prodloužení jejich biologické aktivity až do použití. Tato technika také snižuje toxicitu bylinných extraktů. V této studii jsou formulované lipozomy vysoce stabilní a mají prodloužené uvolňování. Nanoformulace může také zvýšit účinnost extraktu z pískavice řeckého sena na vlastnosti proti stárnutí. Na základě této studie navrhujeme, že by LNF mohl být potenciálně aplikován jako slibná aktivní složka v prevenci stárnutí kůže.
Tento článek je převzat z Pharmaceuticals 2022, 15, 254. https://doi.org/10.3390/ph15020254 https://www.mdpi.com/journal/pharmaceuticals
