Multifaktoriální seroproiling rozebírá příspěvek již existujících reakcí lidských koronavirů na imunitu SARS-CoV-2 (část 2)

Pro více informací prosím kontaktujtedavid.wan@wecistanche.com

Rozlišení z temporální protilátka dynamika podle ABCORA ser-oprofiling.  Přejít-sekčníanalýza z reaktivita protilátek po SARS-CoV-2diagnostika pomocí RT-PČR (N = 369) apo nástupu zpříznaky (N = 333) podtrženo a kapacita z ABCORA ser- oprofirozebrat začátek, vrchol a ústup SARS-CoV-2 protilátka odpovědi (Obr. 5a, b, doplňkový obr. 11). U jednotlivců s a známý datum z fiprvní Diagnóza SARS-CoV-2 RT-PCR nebo nástup příznaků, ABCORA 2.3 detekujevyd brzy sérokonvertovat-sion v 98 procent (48z 49) a100 procent (9z 9) z Jednotlivci v rámci7 dní post-RT-PCR a nástup příznaků, v daném pořadí. kromě IgM a IgA reaktivita, IgG reakce byly snadno detekovatelné v ABCORA 2.0 po několika dnech infekce (doplňnárníObr. 11a).

Podélné hodnocení kohortyz rekonvalescent pacientů nahoruna  11  měsíců po infekci (251 měření na 120 pacientů)  zvýrazněnoatemporálnídynamikaz SARS-CoV-2 vazebné protilátky. Odhadovali jsme rozpad of vazba reaktivita zaměstnávající amocenský zákon smíšený model a označili jej za významný reduakce v RBD, S1, a N v Všechno Ig podtypy (Obr. 5b) spoločasy rozpadů v rozsahu z 67 na 404 dní, přičemž titry IgG N klesají nejrychlejší,včáraspředchozí   zprávy10.   Polovina-žijeza neutrálníization relevantní IgG odpovědi na RBD a S1 byli 125 respektive 404 dní. Zajímavá je kinetika neutralizace protilátky dělal ne zrcadlo a rozklad sazby pozorováno pro vazbu protilátky. Neutralizační aktivita se celkově snížilall v a pomalejšíhodnotit, s a polovina-životnost 991 dní (obr.5C). To bylo částečně způsobeno asmíšenýreaktivitavzorsnějakýJednotlivciukazovatanzvýšit v neutralizace aktivita pošta pozitivní SARS-CoV-2 RT- PCR5, zatímco neutralizační aktivita u jiných rychle upadala (Doplňkový Obr. 11c).

Efekty z HCV imunita na SARS-CoV-2 získávání. Na

umožnit zkoumání vzájemných závislostí mezi pre-existing immjednota na HCoV a SARS-CoV-2 infekce, my rozšířený aABCORA korálek antigen pole na zahrnout S1 proteiny z Všechno čtyři obíhající  HCoVs  (HCV-NL63,  HCV-229E, HCV-HKU1,HCV-OC43) (Sudoplňkové Obr. 12a). Podle na svékapacita na monitor protilátky na five koronaviry, my nazvaný test ABCORA 5.0 a vyškolený a ověřeno to na a stejnýkohorty tak jako ABCORA 2.0 (Obr. 1). Aby bylo možné přímé srovnání s ABCORA 2.0 aapoužití z předpovědních modelů neutralizace, mypoužitý a práh-/Nastavení analýzy založené na SOC pro ABCORA 2.0 taky pro ABCORA 5.0. Na základě na ABCORA 5.0 měření výcvik kohorty I–III, my vymyslel dva náhodný les-založené analýzy modely. ANCORA 5.4 zahrnuta výhradně a 12 SARS-CoV-2 parametry a ABCORA 5.5 zahrnujíd vpřidání a  S1  HCoV Měření přidávání celkem až 24 parametrů. Analogicky kABCORA 2.3, začlenění z HCV reaktivita do a Modelkabyl výhodný. ANCORA 5.5 poskytuje nejvyšší citlivost aspecifiměsto mezi a analýza algoritmy sondoval ABCORA 5.0 (Doplňkový obr. 12b, doplňková tabulka 10).

Vzájemné závislosti meziprotilátka  reaktivita  na  a  čtyři HCoV a SARS-CoV-2 zrcadlené co my dříve pozorováno

pro HKU1 s a zejména vysoký korelace z IgM reaktivita z

SARS-CoV-2 a HCoVs v před-pandemický jednotlivci, zvláště vtěchsnedávné  HCV  infekce  (DoplňkovýObr. 13). Infekce HCV jsou časté, ale podléhají sezónnostiaaprevalence z individuální HCV infekce luctuje41,42. V souladu s tím, prevalence HCV odpovědí měřená pomocí ABCORA 5.0 v místní krev dárců v leden 2019 (N = 285), Smět  2019   (N=288) a leden 2020 (N=252) se lišilyznačně  (Obr. 6). Na umožnit a čas-kontrolované srovnání HCV reaktivita mezi SARS-CoV-2-infikovaný a zdravých dárců, my promítán krev dárců z Smět 2020  (N = 672), když SARS-CoV-2 prevalence byl odhaduje se pod 2 procenta v Curychu, Švýcarsko43, podle ABCORA 2.{{0}}/5.0 a vyloučil všechny vzorky s SARS-CoV-2 reaktivita. The reziduální Smět 2020kohorta (N=653)vytvořený a pandemický, zdravý dárce řízení skupina. Zajímavě,Vzorce reaktivity HCV v letech 2019 a 2020 rozdílered podstatně tak jako posuzovat podle jeden-způsob ANOVA, s lednem 2020 ukazujepoměrně Nejnižší a Smět 2020 a nejvyšší IgA a IgGreaktivníity, který smět naznačit a později počátek z an HCV epidemický v roce 2020 ve srovnání s rokem 2019 (t-testy z května 2020 oproti ostatním skupiny sjak v Obr. 6).

Nejzajímavější je časově přizpůsobená analýza comkrájení Smět2020 zdravých dárců s odběrem-2-pozitivních pacientů na SARS-CoVlvydvpříl, Smět, a červen 2020 (N = 65) odhaleno signifipřekotně dolníHCV reaktivita v SARS-CoV-2 pozitivní pacientů (Obr. 7a). Tento vzor byl taky evidentní když my rozšířil analýzu o aúplnýkohortaz SARS-CoV-2  měřeno infikovaných jedincůs  ABCORA  5.0 (N=389, vzorek od března 2020 doÚnor  2021,  Doplňkový  Obr. 14). Celkově tyto výsledky vdicated že před-existující imunní odpovědi na HCoVs smět na a určitý stupeň ochrany před infekcí SARS-CoV-2ina.

Kliknutím sem se dozvíte více o Cistanche

Obr. 5 Sledování temporální vývoj z protilátka odpovědi. an ABCORA 2.3 definice z séropozitivita v dárců s pozitivní RT-PCR potvrzeno SARS- CoV-2 infekce a známé datum RT-PCR (N = 369). Séropozitivita hodnocenío plazma vzorkování čas směřovatpo diagnóze je vyobrazený. Šedá zastíněná oblast zdůrazňuje a První sedm dní od té doby pozitivní RT-PCR detekce. bMoc-právo Modelka, s čas od té doby RT-PCR tak jako pevný účinek a individuální jako náhodný efekt, odhadování a rozklad z vazebná aktivita protilátek na základě ABCORA 2.0 měření v 1–4 podélných časových bodech u 120 jedinců celkem251 mírynts. Nachový linky korespondovat na a modelky odhad afialově stínované oblastí na a95 procentdůvěra intervalech. Protilátka polovina-žije (t1/2 ve dnech) z významný modely jsou vyobrazený. Význam byl posuzovat použitím Satterthwaite přiblížení pro a dva-oboustranný t-test na a sklon parametry. c Mocenský zákon Modelka, s čas od té doby RT-PCR tak jako pevný účinek a individuální tak jako a náhodný účinek, odhadování a rozklad z neutralizující kapacita na 251Měření z 120 Jednotlivci. Pouze Jednotlivci s NT50 > 100v jejich První měření byli použitý na odhad a polovina-život. The nachový řádek odpovídá na a Modelka odhad a a nachový stínované plocha na a95 procentdůvěra intervalech. Význam byl posuzovat použitím Satterthwaitská aproximace pro a dva-oboustranný t-test na a sklon parametry.

Obr. 6 Sezónní a roční fluktuace v HCV reaktivita. Reaktivita na člověk koronaviry (HCV-NL63, HCV-229E, HCV-HKU1, HCV-OC43)byl v porovnání podle ABCORA 5.0. Reaktivita v zdravý krev dárců z 2019 a 2020 byl v porovnání. Před-pandemický Vzorky zahrnuta: leden 2019 (N = 285), Smět 2019 (N = 288), leden 2020 (N = 252). Vzorky z Smět 2020 (N = 672) byli shromážděné během a pandemický v Švýcarsko. Pouze vzorky bez SARS-CoV-2 charakteristický reaktivita tak jako definovaný podle ABCORA byli zahrnuta (N = 653). hvězdy korespondovat na úrovně z význam z dva-oboustranný t-testy srovnávání a uvedeno skupiny. úrovně z význam jsou opraveno podle a Bonferroni metoda pro násobek testování a uvedeno tak jako následuje:        *p< 0.05/36, **p < 0.01/36,="">p< 0.001/36.Boxplots zastupovat a Následující: medián s a střední čára, horní a dolní kvartily s a box limity, 1.5x mezikvartilní rozsahy s a vousky, a odlehlé hodnoty s body.

Efekty z  HCV  imunita v  SARS-CoV-2  infekce.  Na

dále zkoumat vzájemné závislosti s imunitou proti HCV, nextvyšetřován zda HCV odpovědi jsou propojeno k evoluciz SARS-CoV-2 protilátky. Na tento Na konci jsme analyzovali protilátkyodezvy v plazmě 204 jedinců, kterým byly odebrány vzorkyv 60 dní po SARS-CoV-2diagnostiku pomocí lineárního regresního modelu upraveno podle věku, pohlaví a doby od pozitivní RT-PCR a HCVreaktivita. Na stratifikovat HCoV reaktivita do vysoký a nízký HCoV aktivita, mediánlog MFI-NEPŘÍTEL byli defined pro každý HCV aprotilátkatřída. LogMFI-FOE vyšší než odpovídajícímedián pro mint tři HCoVs (HKU1, OC43, NL63, nebo 229E) ve specifikacic Ig třída byli zařadil tak jako mít vysoký HCV aktivitav rámci této třídy. Za prvé, pouze reaktivity mezi stejnými antibodytřída were prozkoumány v a Modelka (i.e., HCV IgG vysoký na SARS- CoV-2 IgG). Pozorovali jsme výjimkyllysilnývzájemné závislosti pro IgA a IgM odpovědi na SARS-CoV-2, kterýVšechnobylisignifipřekotněvyššívJednotlivcisvysoký HCVreaktivita (Obr. 7b). Tento silně naznačuje, že již existující HCV imunitu může poskytnoute an výhoda v montáž SARS-CoV-2 odpovědi.Vzájemné závislosti mezi HCV IgG a SARS- CoV-2  specifické IgG byly pozorovány pouze pro odpověď S2. Je zajímavé, že toto zjištění podporuje HCV S2 helper odpovědibyli nedávno nalezeno na posílení SARS-CoV-2 imunita, vkonkrétní Aktivita protilátky S231. Chcete-li zjistit, zda může SARS-CoV-2 IgGstavět na nedávné HCV IgA a IgM odpovědi my další sondovalzda HCV IgM a IgA jsou spojeny s elevit SARS-CoV-2 specific  IgGúrovně.Zatímco u IgM nebyl zřejmý žádný účinek, my pozoroval znameníifipřevýšení sdružení z vysoký HCV IgA aktivita naVšechnočtyřiměřeno  SARS-CoV-2  odpovědi  (Obr.  7c,  d). Tento silně naznačuježenedávné  HCV  infekce máa beneficial vliv na zvýšení reakce protilátek SARS-CoV-2ses.

v a další analýza, my sondoval -li před-existující HCV imunitamá an vliv na závažnost onemocnění COVID- 19. Za tímto účelem jsmesondoval HCoV imunita v 80 hospitalizovaných a nehospitalizovanýchJednotlivci infikovaný pro méně než 30 dnů (obr.8A). Ovládání pro věku a pohlaví jsme zjistili, že jedinci s high před-existující HCV reaktivita byla signifikantnímravenčídolní  DDSnavyžadovathospitalizace  (logistickéregrese  NEBO = 0.16, 95 procent CI (0,04, 0.67), Obr.8b, doplňkový obr. 15). Další stratifikation zpaientů podle zda ony Požadované léčba v an JIP ukázal a snížila pravděpodobnost, že pacientts s vysoký HCoV Odezva požadované sazby hospitalizace s intenzivní péče (řadové regreseNEBO {{0}},36, 95 procent CI (0. 13, 0,96), Obr.8b, DoplňkovéFig. 15). Tím pádem, Jednotlivci s vysoký HCoV úrovně měl a 6O 4 procenta nižší kurz nutnosti hospitalizace podle nebodinal hodnost regresní analýza srovnávání hospitalizován v pravidelný oddělení, v JIP, anehospitalizovatd Jednotlivci   (Obr.  8a,  b).   Kolektivně,  tyto pozorování silně naznačují křížový ochranný účinekof HCVimunita při utváření imunitní obrany proti SARS-CoV-2.

Obr. 7 Efekty z před-existující HCV imunita během SARS-CoV-2 získávání. a Čas-sladěno srovnání z ABCORA 5.0 reaktivita pro SARS-CoV-2a HCoVs v zdravý a SARS-CoV-2 infikovaný Jednotlivci. Zdravý dárců byli vzorkovaný v Smět 2020 (N = 653; modrý). Plazma z SARS-CoV-2     infikovaného jedinces byl shromážděné mezi duben–červen 2020 (N = 65; Červené). Vidět Doplňkový Obr. 14 proananalýza z a úplný SARS-CoV-2 pozitivní kohorta(N = 389). Šedá krabice naznačit hodnoty výše a individuální MFI-NEPŘÍTEL střih-offs pro SARS-CoV-2 charakteristický odpovědi pro každý antigen. hvězdy korespondovat na úrovně z význam z dva-oboustranný t-testy srovnávání negativní proti pozitivní pacientů. úrovně z význam jsou opraveno podle a Bonferroni metoda pro vícenásobné testování a uvedeno tak jako následuje: *p< 0.05/12, **p< 0.01/12, ***p< 0.001/12 (IgG HKU1: p = 0.66, IgG OC43: p = 00,45, IgG NL63: p=3.3 × 10−04IgG 229E: p = 1.6 × 10−05, IgA HKU1: p=1,8 × 10−03, IgA OC43: p=1,3 × 10−05, IgA NL63: p=1,4 × 10−07, IgA 229E: p=3.0 × 10−05, IgM HKU1: Str = 3.3 × 10−08, IgM OC43: p = 4.3 × 10−03, IgM NL63: p = 1.1 × 10−07, IgM 229E: p = 2.7 × 10−02). Boxplots zastupovat a Následující: medián s střed čára, horní a dolní kvartily s a box limity, 1.5x mezikvartilní rozsahy s a vousky, a odlehlé hodnoty s body. b Lineární regrese ukazující modely a sdružení mezi SARS-CoV-2 a HCV signály v 204 SARS-CoV-2 pozitivní pacientů s známý Termíny z první pozitivní RT-PCR detekce. Vlivy v rámci a stejný protilátka třída jsou vyšetřován. The modely byli upraveno na stáří (spline s 3 stupně z svoboda), Rod, čas od té doby pozitivní RT-PCR (spline s 3 stupně z svoboda), a úroveň z HCoV reaktivita. Vzorky jsou navržený na přístav vysoký HCV reaktivita -li ony show ABCORA 5.0 HCVlog MFI-NEPŘÍTEL hodnoty vyšší než a odpovídající medián v v nejméně 3 HCoV Měření (HKU1, OC43, NL63, nebo 229E). Křivky odpovídají na a modelky odhad a stínované oblastí na a95 procentdůvěra intervalech. p-hodnoty byli získané podle běh a dva-oboustranný Student t-test na parametr spojené s HCV reaktivita v a lineární regrese. c Lineární regrese Modelka ukazovat a sdružení mezi SARS-CoV-2 IgG a HCV IgA signály. Křivky korespondovat na a modelky odhad a stínované oblastí na a95 procentdůvěra intervalech. p-hodnoty byli získané podle běh dvojka-oboustranný Student t-test na a parametr spojené s HCV reaktivita v a lineární regrese. d Lineární regrese Modelka ukazovat a sdruženímezi signály SARS-CoV-2 IgG a HCV IgM. Křivky odpovídají odhadu modelu a stínované oblasti 95procentnímu intervalu spolehlivosti. p-hodnotas byli získané podle běh a dva-oboustranný Student t-test na a parametr spojené s HCV reaktivita v a lineární regrese.

Diskutujteion

Definition z  SARS-CoV-2  imunita po očkování ainfekce má bezprostřední význam44–46. Rozluštění antitělokorelujez SARS-CoV-2  ochranaasledování vakcína schopnost reagovat jsou náročné úkoly, které nás čekají. Velikost aa dlouhověkosti z ochranný protilátka odpovědi na přírodní infekce a odlišný vakcíny potřeba na být zkoumal na rozumětparametry že tvar ochranný reakce a vodítka pro rozhodování o revakcinaci u nonresponderů a imunizaci znovunSvatýromán vznikající SARS-CoV-2 varianty47. Stejně tak tvořit znamená sérologicky rozlišit mezi de novo infekcí, reinfekce,a vakcína odpovědi, jejich trvanlivost a selhání vůle zůstatkritical pro klinický diagnóza.

Tady my prokázat a vysoký utility z vícenásobné-parametr ser- oprofilování při řešení klíčových problémů v defining  SARS-CoV-2 imunita.  Simultánnídetekcez protilátkové odpovědi na a rozsahz SARS-CoV-2  antigenyaodlišný  Igtřídys ABCORA  seroprofilingposkytla ucelený obraz SARS-CoV-2 sérologický stav v jediném vyšetření, které can být užitečné pro klinickou diagnostiku k určení přítomnosti eof reinfekce,  definereinfekce,  areagovatnaočkování. Výpočetnímodelovánítakypovolenopředpovídání plazma neu-realizace kapacita z ABCORA Výsledek, povolení aobsáhlý Posouzení z SARS-CoV-2 protilátka dynamika a jejich souhra sHCV odpovědi. My studoval dva ABCORA testverze tlv oba měřeno HCV reaktivita vedle a  12 SARS-CoV-2 parametry.ANCORA 2 zahrnovala antigen S1HKU1. ANCORA 5 zahrnuta S1 z Všechno čtyři obíhající HCV.Zejména, výpočetní modely že zahrnuta a HCVMěření povoleno a vyšší přesnost v určující SARS-CoV- 2 séropozitivita, vysokáosvětlení vzájemné závislosti mezi HCoVa SARS-CoV-2 odpovědi, které je třeba vyřešit.

Záznam reaktivita proti Všechno čtyři HCoVs v SARS-CoV-2neinfikovaný ainfikovanýJednotlivcimypozorovánofascinujícísdružení. UnakaženýJednotlivcizobrazenovyšší  HCVreaktivita ve srovnání s infikovanými jedinci naznačujeapříspěvek z HCV imunita na brzy obrana proti SARS-CoV- 2. Imunita proti HCV může mít také pozitivní účinky na SARS-CoV-2infekce. v dohoda s jiný zprávy, my poznamenal akřížové krmení z SARS-CoV-2 a reakce HCV u infekce SARS-CoV-231,48 s Jednotlivci s vysoký HCV reaktivita rozvíjet-oping vyšší SARS-CoV-2 protilátka úrovně. Většina zejména, již existující HCV imunita měl an dopad na choroba vážnost v našem kohorta. SARS-CoV-2 infikovaný Jednotlivci s nízký HCV reaktivita měl a vyšší pravděpodobnost z vyžadující hospitalizace.

Zatímconášstudiepouze měřené protilátkové odpovědi, apotenciálochrannýúčinekz HCoVimunita proti SARS-CoV-2 získávání by měl ne být zhlédnutotak jakoomezený na protilátková aktivita. Protilátky a buněčná imunita mohou být obě relevantnía koncertně aktivní31,49–51. Alternativně protilátková odpověďsesmzměřeno v a současnost, dárek studie smět výhradně dokument nedávné HCV infekcen a dodat a náhrada měření z jiný ochrannýHCV odpovědi. The odkaz mezi vyšší HCV  a SARS-CoV-2 reaktivita u infikovaných jedinců je zvláště zajímavý. Nejsilnější efekty byli viděl pro IgM a IgA HCoV odpovědi, suggestující že nedávné HCV imunita poskytuje an brzy posílení na Vývoj protilátek SARS-CoV-2ent.  Zdatentojezpůsobenna zkříženě reaktivní reakce B buněk, na kterýcha  SARS-CoV-2imunita staví na a dozrává nebo zda přejít-reaktivní T pomocníkčinnostihrát sidominantní roli, jak bylo navrženo31  bude Důležité na odhodlání v dále-příchod studie. The přesnou roli a timing z HCoVodpovědiovlivňování  SARS-CoV-2  protilátkaodpovědi taky zůstat na být defined. Brzy nízký-affinity HCoV odpovědi smět mít a pozitivní dopad na a rozvoj SARS-CoV-2 imunitu vytvořením imunitní paměti, na které na stavět, zatímco amplifikation z ne-ochrannýkřížově reaktivníHCV antibody podle na a antigenní hřích zásada smět mít negativní účinky30.

Ačkolisdruženístudia, jako je naše, formálně nemohou define kauzalita, a Dopady z náš nálezy jsou zřejmé: Předimunita na HCV smět chránit na nějaký rozsah proti SARS-CoV-2 získávání, asmět poskytnout a posílení na a rozvoj SARS-CoV-2 specific imunita a s tento dolní a riziko protěžkéhospitalizace.  A  skromnýochranný účinek HCoVimunita bych být a přijatelný vysvětlení pro a vysokýpoměrasymptomatický a mírný SARS-CoV-2 infekce52,53. Dokonce více zajímavé jsou výhledy do budoucna. Jako ostatní i mymít zobrazeno, SARS-CoV-2 a HCV imunita na infekce jsoučasto ne dlouho-trvalý (Obr. 5, Doplňkový Obr. 11)5,54, omezeníže  SARS-CoV-2  vakcínynadějenapřekonat. By měl SARS-CoV-2  odpovědivotočit seposkytnoutstupeň obrany proti HCV infekce, široký ochrana proti koronaviry může být v rkaždý.

Obr. 8 Dopad z HCoV imunita na COVID-19 vážnost. a Sdružení z hospitalizace postavení (ne hospitalizován (N = 16); hospitalizován ne v JIP(N = 42); hospitalizován v JIP (N = 22)) a vysoký nebo nízký IgG HCoV reaktivita. Obdélník velikosti korespondovat na a poměr z zahrnuta pacientů. b Vliv na HCoV reaktivita (nízký/vysoký) na a hospitalizace postavení v a podmnožina z N = 80 pacientů, tak jako odhadnutý s šance poměry, v an řadové regrese (s úrovněmi = ne hospitalizován (N = 16); hospitalizován ne v JIP (N = 42); hospitalizován v JIP (N = 22)) a a logistické regrese (odkaz = ne hospitalizován(N = 16); proti Všechno hospitalizován (N = 64)). Data je prezentovány tak jako parametr odhad a své95 procentsebevědomí časový úsek. Úroveň z význam z parametr je získané s a dva-oboustranný t-test (p-hodnota je zobrazeno -li <>v opačném případě uvedeno tak jako n.s.).

Mětis

Člověk vzorek. Sérum a vzorky plazmy byly odebrány před a po vzejití

SARS-CoV-2 vŠvýcarsko (před apo únoru 2020, respektive) bylizahrnuta. Ne trpěliví zápis byl provedl pro a současnost, dárek studie. Všechnoexperimenty zahrnující Vzorky z člověk dárců byli provedl se schválením odpovědischopný místní etika výbor (Kantonale Ethikkomise) Curych,

Švýcarsko (ZÁKLADNÍ č 2020-01327, 2020-00363; 2021-00437; 2020-00787), od a ustanovení z a Prohlášení z Helsinki a a Dobré klinické Praxe pokyny z mezinárodní konference o harmonizaci. Vzorky byli získané z tyto zdroje: (i) Darování krve v Curychuservises (ZHBDS): Anonymizováno zdravý dospělý plazma z před-pandemický časbody (leden 2019, Smět 2019,a leden 2020) a z první vlny pandemie ve švýcarském Curychu (Smět 2020) byli pokud podle a ZHBDS vnitřní sérové ​​úložiště a nevýhodyent pro tento studie byl upuštěno podle a etika výbor(ZÁKLADNÍ 2021-00437). (ii) Anonymizováno zbytky vzorků z rutinní diagnostiky v a Ústav z Lékařský Virologie, Univerzita z Curych, a Univerzitní děti NEMOCNICE Curych, a a Kantonální NEMOCNICE Winterthur (ZÁKLADNÍ č2020-01327, 2021-00437). Od všech účastníků byl získán písemný informovaný souhlasjehož vzorek was přijato během a pandemický v a Univerzita NEMOCNICECurych (BASEC 2020-01327). Pro pandemické vzorky z jiných nemocnic and předpandemický Vzorky souhlas byl upuštěno podle a etika výbor. (iii) Zdravotní péčepracovníci s RT-PCR potvrzenou infekcí SARS-CoV-2ion účastnící se v a studie na Univerzita NEMOCNICE Curych (ZÁKLADNÍ 2020-00363). Psaný informovaný souhlas byl získané z Všechno účastníků. (iv) mužský plazma dárců účastnící se v SARS-CoV-2 plazma terapie studie provedený ve Fakultní nemocnici v Curychu(CPT-ZHP, Swissmedic 2020TpP1004; ZÁKLADNÍ 2020-00787). Písemně informovánsouhlas s výzkumem byl získán od všech účastníků. Ton hlášení z Všechno člověk a paštikant datavyhovuje saSTROBE tvrzení. Před-pandemický (SARS- CoV-2 negativníve, N = 825) a ošiditfirmed SARS-CoV-2 pozitivní Vzorky (N = 389)byli rozdělený do výcvik a validace kohorty (Doplňkový Stůl 3).          Dostupné demografické údaje data na Rod, stáří, čas od té doby pozitivní RT-PCR aspříznak počátek, a hospitalizace postavení jsou hlášeno v Doplňkový Stůl 11.The SARS-CoV-2 výcvik kohorta (N = 175) včetně plazmy odebrané běheminfekce (N=114) a rekonvalescence (N=61). Za donor pouze jeden vzorkování časbod byl zahrnut, longitudinální Vzorky z dárců zahrnuta v a výcvik kohorta byla ne zahrnuta v a validace kohorta zjistit nezávislost kdyposuzování a citlivost a specifičnost různých diagnostických metod. The   SARS-CoV-2 validace kohorta (N = 214), zahrnuto plazma shromážděné během infekce (N = 90, jeden časový bod odběru na dárce) a rekonvalescenci

(N = 124, 79 pacientů v rekonvalescenci s 1–4 longitudinálními odběry). Několikrátbody z rekonvalescent pacientů byli zahrnuta v a ověřovací datový soubor pro zachycení a široké spektrum waning protilátka titry. Průřez analýza byl na základě naVzorky s známý čas od té doby pozitivní RT-PCR (N = 369) nebo známý čas od příznaku počátek (N = 333), obojí včetně pozorování longitudinální analýzy.Jak čas od pozitivní RT-PCR, tak časod té doby počátek byl známý pro330 vzorků, s mediánem času tři daano mezi symptom počátek a RT-PCR(1Svatý–3rdkvartil: 1–7 dní). Byla založena longitudinální analýza reaktivity protilátek na 251 pozorováních ze 120 konvalůcent pacientů s známý čas od té doby pozitivní RT-PCR a čas od nástupu příznaků. Neutralizace was měřeno na 467 SARS-CoV-2 RT-PCRpozitivní Vzorky (N = 369 s známý čas od té doby pozitivní RT-PCR, N = 333 s známý čas od té doby symptom počátek).

Dále jsme vyhodnotili zkříženou reaktivitu ABCORA 2.0 a 5.0 vlevot-přes plazmaz rutinní diagnostiky v prepandemické kontrolní skupině wi zdokumentováno, nedávné HCV infekce (Výcvik II, N = 75; OC43 (N = 27), HKU1 (N = 17), NL63      (N = 22), 229E (N = 9)). Cirkulující HCV je běžně pouze promítán pro vhospitalizováni, s těžkými respiračními infekcemi a s oslabenou imunitou Jednotlivcikteří běžně podstupují brinzerát promítání pro respirační infekce. Proto, v tohoto pacienta skupina, oba snížena protilátka reaktivita způsoben na imunní kompromitující nebozvýšená HCV antibody reaktivita způsoben na nedávné nebo opakující se HCV infekce smětnastat. Protože tato skupina je diagnopevně relevantní my považováno to prozíravý na zahrnout toto kohorta tak jako Výcvik II data soubor na ověřit -li přejít-reaktivita s SARS-CoV-2 vABCORA se vyskytuje v tomto nastavení. Data tréninku II nebyla zahrnuta do prahové hodnoty definition na ne přes-zastupovat Jednotlivci s těžkým onemocněním. Tento HCV infikovanýskupina zobrazeno celkově dolní reaktivita s SARS-CoV-2 než plazma zzdravý Dospělí ale důležité ukázal Ne indikace z zkřížená reaktivita (obr.1a, b). Pandemický vzorekles z anonymní krev dárců s neznámý SARS-CoV-2postavení shromážděné v Smět 2020 (N = 672) byli ne zahrnuta v výcvik a validace kohorty.

Reagencie a buněčné linie. His-tzestárlý SARS-CoV-2-odvozený antigeny (receptor

vazebná doména (RBD), podjednotka S1 (S1), podjednotka S2 (S2), nukleokapsida protein (N)) a S1 z ton čtyři obíhající HCoVs (HKU1, OC43, NL63, 229E) byli zakoupeno od Sino Biological Europe GmbH, Eschborn, Německo (DoplňkovýStůl 12). Zdroje, specifika a koncentrace detekční a kontrolní protilátky a séra používaná pro ABCORA a neutralizační testyts jsou uvedeny v Doplňková tabulka 13. 293-T buňky byly získány z American Type Culture Collection(ATCC CRL- 11268)55. HT1080/ESO2tř. 14 buňky33 byli laskavě poskytl P.Bieniasz, Rockefeller Univerzita, NY. Oba buňka linky byli kultivovaný v DMEMobsahujíng10 procentFCS.

Design z multiplex korálek test ABCORA 2.0. My založeno dva korálek-na základěmultiplexní SARS-CoV-2 imunotesty (ABCORA 2.0 a ABCORA 5.0) žezahrnoval řadu SARS-CoV-2 a HCoV antigeny (Sino Biologický EvropaGmbH, Eschborn, Německo, doplňková tabulka 12). Čtyři antigeny SARS-CoV-2ns- RBD, S1, S2, a N - byli zahrnuta v oba ABCORA 2.0 a ABCORA 5.0.ANCORA 2.0 zahrnuta v přidání S1 z HCV-HKU1, aABCORA 5.0 zahrnuta S1z Všechno obíhající HCoVs (HCV-NL63, HCV-229E, HCV-HKU1, HCV-OC43). v stručný, individuální MagPlex korálky (Luminex Korporace, Austin, TX)    s unique fluorescenční korálek regionech byli vybráno pro každý antigen, korálky bylinavázané a směsi perliček spojených s antigenemsbyliinkubované s trpěliví plazma v a 96-studna talíř soubor-nahoru. TheMedián Fluorescenční Intenzita (MFI) z plazma vázaná na kuličkyantibodies byl měřeno využívající a FlexMap 3D čtenář (Luminex Korporace,Austin, TX). My navržený a test na plnýfill a Následující kritéria: (i) vysoký Rychlost-cifiměsto, citlivost, a reprodukovatelnost, (ii) flexibilní multiplex design že umožňuje přímočaré přidání a/nebo změna z antigeny; (iii) široký dynamický rozsah;  (iv) volitelný kvantifikation z protilátka odpovědi; (v) volitelný záznam zprotilátkareakce na HCoV a (vi) použití v routine diagnostika a výzkum.

Vybrali jsme sterický orientace zachytit přes proti-Jeho protilátky na zajistit a homogenní zobrazení antigenu. Proto karboxylovaný MagPlex korálky (Luminex

Korporace, Austin, TX) byli spojený s proti-Jeho protilátka (Sino Biologický

Evropa GmbH, Eschborn,Německo, doplňková tabulka 13) a poté spřažené s jeho štítkemantigeny použitím Bio-Plex Amine spojka (Bio-Rad LaboratořeAG, Cressier, Švýcarsko) podle výrobce in instrukcemi a tak jakopopsaný56.

Titrace séra/plazmy je obecně považována za nejpřesnější strategy naretripředvečer kvantitativní informace na protilátka reaktivita. nicméně, v diagnostický použitítesty ideálně by měl dodat (semi)-kvantitativní informace z a jediné sérumředění na povolení dostatečnou propustnost. Podmínky konečného testu zahrnovaly a 2-log rozsah MFI napříč všemi sondovanými kombinacemi antigen-Ig (doplňkový obrázek 1).Ratifikace a doba platnosti z použitím a singl plazma ředění, my ošiditfirmed že plazmaz SARS-CoV-2 pozitivní pacientů a před-pandemický SARS-CoV-2negativnívzorky plazmy vykazují optimální reakci na dávku křivky přes a široký plazma ředěnírozsah (Doplňkový Obr. 1f). Důležité, a 1/100 ředění z plazma byl v Všechnopřípady zavřít na maximální signál, což podtrhuje rostoucí plazmukoncentrace by nezvýšila intenzitu signálu, ale spíše endangehm klesajícísiskřítci způsoben na prozóna efekty (Doplňkový Obr. 1f).

Maximální proti-Jeho protilátka načítání byl dosaženo v 5 µg protilátka za miliónkorálky (doplněkvstupní Obr. 1c) a použitý tak jako a Standard spojka stav. v a finalprotokol,bylo inkubováno pět milionů magnetických kuliček spojených s anti-His protilátkou Jeho-označené antigeny zředěný v PBS na koncentraci 320 nM.Sekundární protilátky značené fykoerythrinem (PE) specifické pro IgG, IgA, nebo IgM bylipoužívané jako detektorové protilátky (doplňkovéStůl 13). Kvalitní řízení z aantigen lopřidání byl provedeno podle inkubace a korálky s monoklonálníprotilátky zacílené na odpovídající CoV-dered antigen tak jako detailní vDoplňková tabulka 12. Analýza byla provedena sh a FlexMap 3D čtenář(Luminex Corporation, Austin, TX) s a získávání z v nejméně 50 korálky zaoblast korálků. Výsledky are zaznamenané tak jako MFI za korálek kraj.

Bylo zavedeno několik kontrolních opatřeníalled na zjistitmezi-a intra-testvýkon. Chcete-li zjistit nízký test natest variabilita, velký šarží zindividuální antigen nabitý beads byli připravený a zamrzlý v alikvoty dokud použitý v-20 stupeňC na obejítarozklad z a antigen-spojený korálky (doplňkový obr. 1). Jednotlivé spojené kuličky byly v testovací den smíchány do yield a Požadované antigenkorálkový koktejl. Koktejly obsahovaly 60 perliček strehm korálek kraj za µl. v přidání naoblasti perliček SARS-CoV-2 a HCV, každý koktejl obsahoval empty oblast korálků (Ne antigen spojený) na řízení pro nespecifikovánofic vazba. Kvalitní kontrola a validace postupy pro a FlexMap 3D nástroj byli Hotovo na každý den zexperiment příslobjednávání naavýrobce's instrukce. The variabilita z a testbyl analyzovány tak jako následuje56: plazma Vzorky z 20 RT-PCR ošiditfirmed SARS-CoV- 2 infikovaní pacienti byli shromážděni a testováni over a rozsah z sedm ředění v 31  různé titrace provedeno na 10 odlišný dní (Doplňkový Obr. 2). PřesVšechno antigeny a Ig třídy, signály byli zachováno přes a test doba z 25dny post korálková spojka. Variační koeficienty (CV) vazebného signálu přes titracez kombinace 12 antigen-Ig třídanárodů se ukázala nízký (rozsah: 0.010–0. 128, medián  0.059, doplňkový obr. 3c, d, doplňkové tabulky 1, 2). Ze stejného dne a ze dne na denproměnlivost ptoulal se nízký a srovnatelný (Doplňkový Obr. 3e, f). Níže a 1/ 100 plazma koncentrace, životopis zvýšené výrazně (Doplňkový Obr. 3d),         definování 1/100 jako nejvyšší koncentracena (Nejnižší plazma ředění) na být testováno v a test. Jako základní bylo tedy definováno ředění plazmy 1/100ředění pro promítání plazma v ABCORA 2.0 když a kvalitativní (tj. přítomnost nebo nepřítomnost SARS-CoV- 2specifické protilátky) nebo semikvantitativní (tj. intenzita signálu MFI).rvyžadováno.

Všechna měření ABCORA byla derozjetý z singl Měření ledažeuvedeno jinak. Pro měření SARS-CoV-2 specific protilátky v trpěliví plazma,tepelně inaktivovaný plazma (1 h v56 stupňůC) byl zředěný 1/100 v PBS-BSA1 procentoledažejinak uvedeno. 50 ul ředvyd plazma byli inkubované s 50 µl z a ABCORAantigen korálek koktejl pro 30 minut v pokoj, místnost teplota v 96-jamkové destičky, umyté třikrát s PBS-BSA 1 procentem a inkubovány v oddělených reakcích wifykoerythrin (PE)-označené detektor protilátky pro IgG, IgA nebo IgM v a fikonečná koncentrace z 1/500 v PBS-BSA 1 procento. Toto ředění bylo dříve definovánotitrace protilátek detektoru pro získání optimálních MFI signálů. Po 45 minutes zinkubace při teplotě místnosti, kuličky byly třikrát promyty PBS-BSA1 procentoa analyzovány v 96-studna talíře na čtečce FlexMap 3D (Luminex Corporation, Austin, TX). A minimální z 50 korálek čte za antigen byl získal.

Pro kontrolu skutečné zkříženě reaktivní protilátkyie, každý plazma vzorek bylhodnoceno s beads bez antigen (prázdný korálek řízení) v kombinace kterýkaždý detektor antibody. Pro analýza, drsný MFI hodnoty byli přeměněna na MFI-NEPŘÍTEL na opravit pro Pozadí vazba.Stanovili jsme střední prázdnou perličku MFI-FOE pro IgG, IgA a IgM zdravých dárců před pandemií (N=1016) a set průměr MFI-NEPŘÍTELPlus4x standardní odchylka jako prahová hodnota pro kontrolu prázdné perličky.v absolutní úrovně, tyto prahové hodnoty ve výši na MFI-FOE 41,58 (IgG), 55,91 (IgA), a 269,47 (IgM).Mvěcná břemena pro který a prázdný korálek řízení zaznamenané hodnoty above tento práh byli považováno neplatný a opakoval.

Každá destička pro analýzu Luminex 96-byla nastavena na kontav a stejný soubor zřízení Vzorky, a to 7 seriál 4-složit ředění SARS-CoV-2 pozitivní kontrolydárce bazén (N = 20 dárců, začíná ředění 1/100, Doplňkový Obr. 1f) a předem-pandemický zdravý dárce bazén (ředění 1/100, N =20 dárců, doplňkovéObr. lf). Tyto pozitivní a negativní kontroly umožňují kontrolu provedení testuncenapříč nezávislými měřeními a navíc umožňujíretrospektivnív případě potřeby standardizace vůči externím kontrolámded.

Definice z SARS-CoV-2 séropozitivita v ABCORA 2.0 a ABCORA 5.0. Naodlišit SARS-CoV-2-specifické od zkříženě reaktivních protilátek, defined MFI- Prahové hodnoty FOE pro každý z 12 antigenů SARS-CoV-2 a kombinace tříd Igs na bázi plazmatické protilátky reaktivita v výcvik kohorty (Doplňkový Tabulky 3 a 4). Mezi ně patřil předpandemický zdravý dárce plasma (Výcvik I, N = 573),dárců s nedávné HCV infekce (Výcvik II, N = 75; OC43 (N = 27), HKU1 (N = 17), NL63 (N = 22), 229E (N=9)) a dárci s potvrzenou infekcí SARS-CoV-2 (Výcvik III, N = 175). Prahové hodnoty byli soubor na minimalizovatfalešně pozitivnízatímco zajištění citlivost pro SARS-CoV-2detekci protilátek a dosáhnout ancelková specifika nade99 procenta zahrnuta úrovně pro okraj-čára reaktivita pro IgGRBD,IgG S1, a IgG N na dovolit taky skromný protilátka reaktivita na tyto antigeny to být zkoumal. MFI-NEPŘÍTEL čte z individuální Vzorky byli přeměněna domezní hodnoty při překročení signálu (SOC) (MFI-FOE/threshold). SOC values jsou použitý prozadkyzpívat pozitivní reaktivita pro každý individuální antigen-protilátka třída kombinace, s SOC > 1 znamená pozitivní reaktivitu a SOC < 1 znamená negativní reaktivitu.Když nastavení individuální prahové hodnoty, to musí být považováno že pro každý z a 12 sondoval činnosti může dojít ke zkřížené reaktivitě. S 12 individuálními parametry SOC zaznamenané, celkové specifiměsto vůle pokles -li žádný pozitivní SOC nezávisle suffices na hodnotit a vzorek celkově tak jako SARS-CoV-2 protilátka pozitivní. Na ukázat příkladem:Za předpokladu nezávislých odpovědí, dokonce i vysoká 99procentní specifičnost pro každý antigen bude sčítat to celkově nízká 88procentní specifičnost v celém testu. Požadovali jsme tedy for SARS-CoV-2 pozitivní povolání v ABCORA 2.0 a minimální z dva specifiměsta na dosáhnoutaktivita výšeapráh. Kombinované hodnoty SOC použité k definování součtusérový stav daného vzorku je podrobně uveden v doplňkové tabulce 5. Pro IgG RBD, S1, a N,u kterých jsme zaznamenali i hraniční aktivitu SOC, povolili jsme akombinace 1 antigenu reaktivita SOC > 1, druhá reaktivita SOC > hraniční. The final práh a pozitivní volání kritéria povoleno pro diferenciace částečného (brzy sérokonverze s pouze IgM a IgA odpovědi) na úplný ser-          konverze (včluding IgG odpovědi) (Doplňkový Stůl 5). v přidání, kritéria označují vzorky se slabou reaktivitou a/nebo neurčitou reaktivitou(Doplňková tabulka 5).

Pro usnadnění srovnání mezieen ABCORA 2.0 a ABCORA 5.0 a stejnýpráh pro ABCORA 5 byly použity limity.0. Rozhodli jsme se nevytvářet konkrétní cut-offprahové hodnoty pro reaktivitu protilátek HCV jako an přesný definition z a negativníreakce je složitá kvůli rozsáhlé expozici HCoV a konsinechutnýprotilátka zkřížená reakceaktivity mezi jim. HCV odpovědi byli nicméně zahrnuta ve statisticeCAL analýzy tak jako MFI-NEPŘÍTEL hodnoty.

Definice z SARS-CoV-2 séropozitivita použitím logistické regrese klasifikace.

Classifikation z séropozitivní proti séronegativní Vzorky v ABCORA 2. 1 byla realizovánapoužitímlogistické regrese. The identické výcvik a validace data použitý pro a zřízení z ABCORA 2.0 byli použitý. Tak jako a ABCORA 2.0 vazebné reaktivity byly vysoce korelované, do modelu jsme zahrnuli následující proměnné (doplňkové Obr. 6a): a znamenat hodnota všech IgG MFI-FOE odpovědí (RBD, S1, S2, N), znamenat hodnota z odezvy IgA MFI-FOE proti RBD, S1 a S2 a průměr hodnota IgM MFI FOE odpovědí proti RBD, S1 a S2. Odpověď IgA a IgMs až N byly vyloučeny, protože se neshlukovaly s ostatními odpověďmi stejného Ig třída (Doplňkový Obr. 6a). K odhadu a predikci byla použita logistická regrese pravděpodobnost daného vzorkue na být pozitivní (p) tak jako popsaný v rovnice (1).

Odstmetrů  0, G, A, a  M byli odhadnutý na a výcvik datový soubor. A vzorek byl pak definován jako pozitivní, pokud jeho předpokládaná pravděpodobnost, že bude pozitivní, byla vyššía práh c/. Tento práh byl definován pro získání specifičnosti alespoň 0,99 a maximální citlivost na trénovací datové sadě (podobně to c pro a náhodný les). vsouhrn, v ABCORA 2. 1každý nový vzorek je definován jako séropozitivní, pokud je jeho pravděpodobnost séropozitivní, jak se odhaduje logistickou regresí, je nad c/. Analyzuje násre provedena v R verzin 3.6.3. Definice z SARS-CoV-2 séropozitivita použitím náhodný les klasifikace.  Klasifikace séropozitivních versus séronegativní Vzorky vakontext z ANCORA 2.0 a ABCORA 5.0 byla realized použitím a náhodný les přístup Následující azákladní nastavení random lesy tak jako popsaný v57. The náhodný les sám byl postavený souboru 1000 klasifikačních stromů využívajících odpovědi MFI-FOE (IgA, IgG,aIgM proti RBD, S1, S2,N). The pravděpodobnost z a vzorek bytost pozitivní tak jako před-  diktovaný náhodným lesem je průměrem ppravděpodobnosti přes Všechno 1000 stromy. Nakonec je definován vzorekned tak jako pozitivní -li své pravděpodobnost z bytost pozitivní je výše a threshold c, který je defined tak jako na získat a specifiměsto z v nejméně 0.99 a a maximální citlivost ve vlakuIng datový soubor. v souhrn, žádný Nový vzorek je defined tak jakoséropozitivní, pokud its pravděpodobnost z bytost séropozitivní tak jako odhadnutý podle a náhodnýles je nad threshold c. My provedl a série z náhodný les analýzy které zohledňovaly buď pouze reakce na SARS-CoV-2, nebo SARS-CoV-2 a HCV   odpovědi v ABCORA 2.0 a ABCORA 5.0: ABCORA 2.2 a ABCORA 2.3 bylyvyškolený a použitý pro předpověď na ABCORA 2.0 data a zahrnuta pouze SARS-  CoV-2 odpovědi nebo SARS-Odpovědi na CoV-2 a HKU1. ANCORA 5.4 (pouze odpovědi SARS-CoV-2) a ABCORA 5.5 (SARS-CoV-2 a HCVodpovědi) byli vyškolený na ABCORA 5.0 data. Podrobnosti o zahrnutí údajů pro příslušný modely jsou uvedeny v Doplňkový Stůl 3 a Doplňkový Stůl 10. Analýzy byly provedeny ve verzi R 3.6.3 pomocí packages náhodnýLes a     Hraničář58–61.

Abychom zajistili robustnost našich zjištění, provedli jsme senecitlivost analýza randomizací trénovací a ověřovací datové sady pomocí 5-násobné křížové validacemetoda. Obě sadyz pozitivní a negativy Vzorky byli rozdělený do five rovnat sedíly a my defined že způsob five validace sady (skládající se z a i-čt soubor zpozitiva aa i-čt soubor z negativy, i = 1.5). The odpočinek z a data byl použitý provýcvik a ABCORA 2.3 náhodný les. U každé ověřovací sady, specifikace acitlivost z a náhodný les byli vypočítané na a výcvik, validace, a školeníPlusvalidace sady (Doplňkový Tabulka 6).

Validace a ověření použitím externí řízení. My použitý a Proti-SARS-  CoV{0}} Ověřovací panel pro sérologické testy (NIBSC kód: 20/B770, NIBSC) naověřte výkon testu ABCORA 2.0 a ABCORA 2.3. Sérumsdostatekz a verifikation panel měřeno podle ABCORA 2.0/2.3 podle popisu a výsledkůve srovnání s výsledky komerčně dostupných testů uváděných NIBSC (32 a Doplňková tabulka 7). My furtjejí verifivyd a citlivost z a ABCORA 2 test v zjišťování SARS-CoV-2 infekce v přímé srovnání s komerčnímitesty. Antibody postavení z plazma z SARS-CoV-2 pozitivní Jednotlivci (N = 171) byla analyzovánad s a Následující test systémy: Zahrnuta test systémy cílené a N protein (Elecsys® Proti-SARS-CoV-2 (Roche Diagnostics GmbH)), oblast RBD z a S protein (Elecsys® Proti-SARS-CoV-2 S test (Roche Diagnostics GmbH)),a a S1 podjednotka (EUROIMMUN Proti-SARS-CoV-2 ELISA (IgG)) (doplňkovéTabulka 8). Všechny testy byly provedeny podlea výrobce's pokyny v a diagnostika jednotka z a Ústav z Lékařský Virologie, univerzita Curych, Švýcarsko.