Vícebarevné zobrazení proteinů vázajících vápník v lidských ledvinových kamenech pro objasnění účinků proteinů na růst krystalů
Mar 21, 2022
ledvinykamenové onemocnění je časté onemocnění, které postihuje alespoň jednou za život 1,7–14,8 procenta populace1,2. Až v 50 procentech případů se toto onemocnění opakuje do 5 let od první epizody. Navzdory důležitosti tohoto zdravotního problému je preventivní léčba tvorby kamenů nedostupná. Pochopení patogenezeledvinatvorba kamenů je nezbytná pro snížení výskytu a opakováníledvinakamenná nemoc 3. Přibližně 80 procentledvinakameny jsou kalcium oxalátové (CaOx) kameny4,5. CaOx kameny se skládaly z~90 procent minerální fáze, tj. CaOx, který se dále dělí na monohydrát šťavelanu vápenatého [Ca(C2O4)·H2O](COM) a dihydrát šťavelanu vápenatého [Ca(C2O4)·2H2O](COD) a relativně malý zlomek organické hmoty, který byl považován za Katedru nefro-urologie, Graduate School of Medical Sciences, Nagoya City University, 1-Kawasumi, Mizuho-cho, Mizuho-Ku, Nagoya 467-8601, Japonsko . 2Institut pro pokročilá spoluvytvářecí studia, Osaka University, 2‑1, Yamadaoka, Suita 565‑0871, Japonsko. 3Graduate School of Engineering, Osaka University, 2‑1, Yamadaoka, Suita 565‑0871, Japonsko. 4 Graduate School of Life and Environmental Sciences, Kjótská prefekturní univerzita, 1-5, Hangi-cho, Shimogamo, Sakyo-ku, Kyoto, Kyoto 606-8522, Japonsko. 5Katedra věd o Zemi, Univerzita Tohoku, 6‑3 Aza‑Aoba, Aramaki, Aoba‑ku, Sendai 980‑8578, Japonsko. 6Národní muzeum přírody a vědy, 4-1-1 Amakubo, Tsukuba 305-0005, Japonsko. 7Health and Medical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 2217-14, Hayashi-cho, Takamatsu, Kagawa 761-0395, Japonsko. 8Tajiri Thin Section Laboratory, 3-1-11 Sannose, Higashiosaka, Osaka 577-0849, Japonsko. 9Institut laserového inženýrství, Osaka University, 2-6, Yamadaoka, Suita City, Osaka 565-0871, Japonsko. *E-mail: maruyama@cryst.eei.eng.osaka-u.ac.jp; a-okada@med.nagoya-cu.ac.jp
klíčová slova:ledviny; ledvinový kámen; nemoc ledvin; ledvinové; fyziologie ledvin
CISTANCHE ZLEPŠÍ SELHÁNÍ LEDVIN/RENÁL
jako proteinová matrice6. Patogenezeledvinatvorba kamenů zahrnuje vícestupňové procesy zahrnující složité interakce mezi minerálními složkami a proteinovou matricí7,8. Bylo identifikováno více než 100 druhů proteinůledvinakameny9–11. Mezi nimi je známo, že několik proteinů, zejména proteiny vázající vápník, hraje zásadní roli v procesech tvorby CaOx kamenů12–16. Specifické účinky těchto proteinů byly intenzivně zkoumány v mnoha krocích tvorby kamenů, včetně nukleace krystalů, růstu krystalů, agregace krystalů a adheze krystalů, s četnými krystalizačními studiemi in vitro17–19. In vitro studie jsou užitečné pro hodnocení účinků specifických proteinů na specifické kroky při tvorbě kamenů. V prostředí skutečné tvorby kamenů však počet proteinů působí současně a složení moči v koncentracích proteinů, iontů vápníku a oxalátu kolísá. Tato obava nás motivovala k prozkoumání skutečného člověkaledvinakameny k nalezení skutečných účinků proteinů na růst krystalů. Ve většině předchozích studií byla identifikace proteinů vledvinakameny byly provedeny pomocí hmotnostní spektroskopie po rozdrcení a extrakci9–11. Dochází tak ke ztrátě informace o prostorovém rozložení bílkovin v kameni. Ve velmi omezených výzkumech byla identifikace proteinů vledvinakameny byly provedeny s nakrájenými částmi ledvinových kamenů, ze kterých byly krystaly CaOx zcela odstraněny odvápněním20,21. Tento přístup je užitečný pro nalezení distribuce proteinu vledvinakamenů, což potenciálně pomáhá porozumět specifickým proteinovým účinkům na tvorbu kamenů. Obrovské množství informací o kamenné formaci, zaznamenané vledvinakamenné krystaly, se při této metodě ztrácí. Význam minerálních informací o ledvinových kamenech, které lze získat identifikací krystalových fází a klasifikací krystalové textury prováděnou pomocí řezů a leštěných tenkých řezůledvinakameny s optickou mikroskopií bylo prokázáno více než 70 lety předchozích studií22,23.
Absence analýzy pro hodnocení distribuce proteinů s nedotčenými krystaly CaOx uvnitřledvinaKameny byly značnou překážkou pro pochopení vzniku kamenů. Koordinované hodnocení distribuce proteinů a krystalových fází/morfologií může poskytnout významné informace o historii tvorby kamenů. Vícenásobné imunofluorescenční barvení (multi-IF barvení) bylo použito k zobrazení distribuce dvou nebo více proteinů v mnoha typech měkkých tkání biologických vzorků24. Aplikace této techniky na kostní tkáně, které se skládají z porézních krystalů fosforečnanu vápenatého, také poskytla významný pohled na dynamickou regulaci homeostázy kostních minerálů25. To však nebylo použito k vyšetřováníledvinakameny složené z hustých a tvrdých krystalů, i když bylo použito jednoduché imunofluorescenční barvení k prokázání distribuce specifického proteinu v dekalcifikovanémledvinakameny, které neuchovávají minerální informace20,21. Tato studie zkoumala podmínky, které umožňují multi-IF barveníledvinavzorky kamene pro zachování původní minerální informace. Zkoumali jsme distribuci tří různých proteinů, osteopontinu (OPN),ledvinovéprotrombinový fragment 1 (RPTF-1) a kalgranulin A (Cal-A) v tenkých řezech CaOx kamenů. Tyto proteiny jsou běžné u většiny CaOx kamenů a jsou známé jako proteiny vázající vápník, které potenciálně ovlivňují tvorbu CaOx kamenů26–28. Podle našich nejlepších znalostí se jedná o první studii, ve které je více matricových proteinů společně vizualizováno v aledvinakámen. Dále interpretujeme různé in vivo účinky každého proteinu na růst krystalů CaOx na základě jejich distribuce, fyzikálně chemických vlastností a komplexních změn fyzikálního prostředí každého proteinu během tvorby CaOx kamenů.
CISTANCHE ZLEPŠÍ DIALÝZU LEDVIN/RENÁL
Výsledek
Na základě mikroskopického pozorování spojeného s FT-IR analýzou, doményledvinavzorky kamene byly kategorizovány do tří typů textur, které jsou v souladu s texturou popsanou v Schubert a Brien23: nepravidelná textura složená z euhedrálních krystalů CHSK (Typ 1, označovaná jako euhedrální CHSK agregát; obr. 1c), mozaiková textura složená z nepravidelně orientovaných COM krystaly (Typ 2, označované jako mozaikové COM; Obr. 1f) a koncentricky laminované krystaly COM (Typ 3, označované jako koncentrické COM; Obr. 1i). Většina pozorovaných vzorků kamene CaOx sestávala z těchto tří textur (tabulka 1). Na analýzu tenkých řezů byl použit protokol Multi-IF barvení použitý pro biologické vzorkyledvinavzorky kamene připravené typickou geologickou metodou. Pro aplikaci byly upraveny podmínky leptání tenkého řezu před barvením a bylo zjištěno, že vizualizace byla úspěšná pouze tehdy, když byl vyleštěný tenký řez mírně naleptán (s pH 6.0 roztokem citrátu po dobu 1 min. ) před typickým procesem barvení. Barvení multi-IF umožnilo společnou vizualizaci tří proteinů v různých barvách (OPN: zelená, RPTF-1: modrá a, Cal-A: červená) ve třech různých texturách kamene.
Zjistili jsme, že každý protein vykazoval charakteristický distribuční vzorec v závislosti na jeho umístění v COM a COD. Te euhedrální agregáty CHSK byly nalezeny v 7 vzorcích z 15 vzorků (tab. 1). Euhedrální agregáty CHSK byly přítomny převážně na periferii CaOxledvinakameny (obr. 1a–c). Je známo, že krystaly Tese COD mají tetragonální bipyramidový tvar složený z ploch29. Mnoho bipyramid COD má také {110} obličej na špičce obou pyramid (obr. 2b a doplňkový obr. S1). Obrázek barvení krystalů CHSK pro více IF je znázorněn na obr. 2a a OPN se periodicky vyskytuje na ploše {110} CHSK, jak je znázorněno bílými šipkami na obr. 2c. Tato plocha je stejná plocha hrotu bipyramidy, která se neobjevuje v typickém růstu krystalů CHSK in vitro29. RPTF{11}} se objevily jako rovnoběžné vrstvy podél plochy {101} s intervaly v µm, jak ukazuje žlutá šipka na obr. 2d. Tato krystalická plocha je charakteristická pro typický růst CHSK29. Cal-A byl přítomen mimo krystaly CHSK a nevykazoval žádnou preferenční adsorpci na specifických plochách (obr. 2e). Stejné distribuční vzorce byly pozorovány u jiných vzorků kamene (doplňkový obrázek S2). Mozaiková COM textura je nejběžnější texturou CaOx kamenů (obr. 1d–f). Tato textura byla pozorována u 12 vzorků z 15 (tabulka 1). Multi-IF barvení mozaiky COM je znázorněno na obr. 3a,b. OPN a RPTF-1 byly přítomny v krystalech COM (obr. 3c,d). Naopak Cal-A byl přítomen výhradně podél hranic zrn (tj. na povrchu zrn COM) (obr. 3e). Dále jsme analyzovali profil intenzity čar proteinů, jak je znázorněno na obr. 3a, abychom podrobně vyhodnotili každý vzorec distribuce proteinů (žlutá čára na obr. 4a). OPN a RPTF-1 vykazovaly vyšší intenzity v oblasti krystalů, zatímco Cal-A vykazovaly nižší intenzitu v oblasti
krystalová plocha (obr. 4b). Vysoká intenzita Cal-A byla pozorována výhradně podél hranic krystalů. Tyto distribuce proteinů byly pozorovány v mnoha vzorcích, i když se velikosti a tvary zrn COM lišily (doplňkový obrázek S3). Koncentrický COM je také typickou texturou CaOx kamenů (obr. 1g–i). Tuto texturu jsme našli u 10 vzorků z 15 (tabulka 1). OPN, RPTF-1 a Cal-A byly distribuovány v soustředných vrstvách (obr. 5a). OPN a RPTF-1 byly přítomny jako konstantní a pravidelné vrstvy v krystalech COM, čímž se vytvořil interval µm (obr. 5b,c). Naproti tomu distribuce Cal-A byla složena z nepravidelných a poměrně širokointervalových vrstev umístěných ve vnějším povrchu kamene (obr. 5d). SEM pozorování ukázalo mezerovou vrstvu blízko každé Cal-A vrstvě (obr. 6a,b). Oba povrchy vytvářející mezerový prostor byly obsazeny drobnými usazeninami, které byly jasně odlišné od hlavních krystalů COM tvořících soustředný COM (obr. 6c,d). Profily intenzity Te linie těchto proteinů v koncentrickém COM vykazovaly špičky v každém proteinovém profilu (obr. 4c,d). Te profily OPN a RPTF-1 byly podobné (tj. 5,58±2,70 µm/vrstva OPN a 5,99±2,56 µm/vrstva RPTF-1) (doplňková tabulka S1). Vrstvy Cal-A však měly výrazně velké intervaly (tj. 23,17±18,57 µm/vrstvu) než OPN a RPTF-1. Podobné distribuční vzory a intervaly byly pozorovány u většiny z dalších 9 vzorků, ačkoli vrstva Cal-A nebyla u několika vzorků vidět (doplňkový obr. S4 a tabulka S1).
V této studii proporce tří textur v CaOx kamenech a distribuce tří proteinů ve třech texturách neměly žádný jasný vztah k věku a pohlaví kamene tvořícího kámen, ačkoli množství zkoumaných kamenů nebylo dostatečné pro korelační analýzu. . OPN, RPTF-1 a Cal-A bylo známo, že jsou přítomny v CaOx konkrementech na základě detekce z extraktů kamenných prášků elektrolýzou9–11. Distribuce OPN v mikroměřítku u dekalcifikujících CaOx konkrementů pomocí imunocytochemické techniky ukázaly distribuce OPN v koncentrických lamelách CaOx konkrementů21,30. Tento způsob živě vizualizoval umístění tří různých proteinů v dříve považovaných za "organické vrstvy" (obr. 7a,b). Distribuční vzorec OPN, který ukazujeme v této studii v koncentrickém COM, je v souladu s předchozími pozorováními. Dále jsme zjistili, že distribuční vzor RPTF-1 v soustředném COM je téměř stejný jako u OPN, zatímco distribuce RPTF-1 v krystalech CHSK je odlišná od distribuce OPN. Naopak, distribuční vzorec Cal-A je zcela odlišný od ostatních dvou proteinů. Testování různých distribucí OPN, RPTF-1 a Cal-A na mikroúrovni zaznamenává historii tvorby CaOx kamenů.
Diskuse
Primární řídící faktor inkorporace proteinu do krystalů.OPN i RPTF{{0}} byly přítomny v euhedrálních krystalech CHSK, mozaikových COM zrnech a soustředných COM (obr. 2a, 3a a 5a). Toto zjištění potvrzuje, že tyto proteiny jsou inkorporovány v krystalech COD i COM. Cal-A byl přítomen na vnější straně euhedrálních krystalů CHSK a kolem mozaikových zrn COM (obr. 2e a 3e). V soustředném případě COM mezera typicky nacházející se kolem vrstev Cal-A naznačuje, že vrstvy Cal-A nejsou obsaženy v krystalech, ale jsou rozmístěny na povrchu krystalů (obr. 5d a 6a–d). Tyto distribuce naznačují, že OPN a RPTF-1 mají tendenci být zabudovány do krystalů CaOx, zatímco Cal-A je zabudován jen stěží. Adsorpce a inkorporace proteinů do krystalů CaOx jsou teoreticky ovlivněny vazebnou silou jejich postranních aminokyselinových řetězců a dalšími specifickými vlastnostmi příslušných proteinů, jako je elektrostatický záporný náboj31,32. Čistý náboj ukazuje, že OPN a RPTF-1 jsou záporněji nabité než Cal-A, s izoelektrickými body OPN, RPTF-1 a Cal-A 3,5, 2,5–3.{{28} } a 6,5–7,0, respektive 33–35. Je známo, že Te OPN, RPTF-1 a Cal-A mají domény vázající vápník36–38. Tyto domény mohou dále fungovat jako lokální vazebná místa k rostoucím krystalovým povrchům. Domény vázající vápník OPN, RPTF-1 a Cal-A mohou vázat 10, 7 a 2 ionty vápníku, v tomto pořadí36–38. Tus, objem a lokální afinity těchto proteinů ke kladně nabitému Ca na povrchu CaOx způsobují různou účinnost inkorporace těchto proteinů do CaOx, růst krystalů probíhá začleněním růstových jednotek do kroků a míst zalomení, která se objevují na površích krystalů39,40 . Určila by stromová kompatibilita mezi proteiny a rostoucími krystalovými povrchy
CISTANCHE ZLEPŠÍ BOLESTI LEDVIN/RENÁL
rozsah inkorporace proteinu do povrchu krystalu. Proteiny se silnou vazebnou schopností k místům a krokům růstu mají tendenci být zabudovávány do rostoucího krystalu účinněji41–43. V současnosti uváděné distribuce a afinity k vápníku těchto tří proteinů naznačují, že silná afinita OPN a RPTF-1 usnadňuje vazbu a inkorporaci do krystalů CHSK a COM. Naopak Cal-A, který má nižší afinitu, přilne pouze k povrchu krystalu, ale není zabudován do krystalu. Předchozí studie, která prokázala vyšší míru inkorporace peptidu do COM více fosforylovanými peptidy, toto vysvětlení podporuje43. Tyto diskuse by nám umožnily předpovědět distribuci mnoha dalších proteinů na základě jejich vlastností vázat vápník.
In vivo selektivní absorpce a inhibiční účinky OPN a RPTF‑1 na růst krystalů CaOx.U euhedrálních krystalů CHSK, které jsou přítomny převážně na periferii kamene CaOx, se má za to, že rostou s charakteristickou laminovanou texturou, ve které se během růstu krystalů střídají takzvaná „vrstva organické hmoty“ a „vrstva minerálů“44,45. Ačkoli přesné důvody posunu vrstvy zůstávají nejasné, potenciální vysvětlení zahrnují změny prostředí v lidském hostiteli,ledvinafyziologie a biochemické změny moči a mechanismy kinetické zpětné vazby, které tvoří oscilační zónové struktury nalezené v minerálech8. Současné výsledky ukazují, že OPN a RPTF{1}} konstruují laminovanou texturu odpovídající {110} a {101} ploch CHSK jako intrakrystalické proteiny, zatímco Cal-A není součástí laminované textury (obr. 2c -E). Tento in vivo důkaz povrchové selektivní adsorpce/inkorporace proteinů na/vledvinakamenné krystaly ukazují, že distribuce proteinů nejsou totožné s tradiční „vrstvou organické hmoty“ pozorovanou optickou mikroskopií (obr. 7a). In vitro důkaz o selektivní adsorpci OPN na CHSK krystal byl publikován Chien et al. (2009 a 2018)46,47. Podle těchto zpráv se OPN váže na typický krystalografický {110} povrch CHSK a začleňuje se do minerální fáze, což je v souladu s našimi výsledky (obr. 7b). Povrchová selektivní adsorpce/inkorporace je pravděpodobně výsledkem schopnosti každého proteinu vázat vápník a/nebo různých molekulárních kompatibilit mezi funkčními skupinami na molekulách proteinu a uspořádáním mřížkových iontů na povrchu každého krystalu.
Většina proteinů údajně inhibuje růst krystalů CaOx během tvorby kamenů48,49. Inhibice růstu krystalů peptidy je považována za krok přichycení a/nebo zablokování kink41–43. V předchozích studiích in vitro je známo, že OPN a RPTF-1 jsou inhibitory růstu krystalů CaOx48,49. Nicméně rozsah inhibice vledvinatvorba kamenů zůstává nejasná.
Současné pozorování ukazuje, že většina krystalů CHSK z ledvinových kamenů má typický krystalický habitus s plochami {101} (obr. 2b). Krystalové povrchy, které mají relativně pomalou rychlost růstu, jsou obecně dobře vyvinuté40. Toto financování ukazuje, že tempo růstu {101} ploch CHSK je pomalé ve srovnání s jinými povrchy (např. {110}). Preferenční adsorpce RPTF-1, která potenciálně zpomalila růst krystalů začleněním do CHSK, byla nalezena jako laminovaná struktura spolu s plochami {101} (obr. 2d). Na druhé straně jsme našli plochy {110} jako laminované struktury OPN uvnitř krystalu COD (obr. 2c). Tyto plochy {110} se objevily, protože laminovaná struktura OPN je vyvinutější než plochy {110} krystalů CHSK bez OPN získaných in vitro studií46. Plocha {110} CHSK s preferenční adsorpcí OPN není plocha krystalu, která se objevuje na CHSK typického krystalového habitu47. Absorpce OPN na {110} by extrémně zpomalila relativní rychlost růstu povrchu a zpomalení bylo dostatečně pomalé, aby se objevily plochy {110}. Jinými slovy, objevení se tváří {110} mění obecný habitus krystalů u mnoha vzorků ledvinových kamenů. Krystaly COM se objevují buď jako mozaiková textura nebo soustředná textura (obr. 3a a 5a). OPN i RPTF-1 jsou homogenně přítomny v COM zrnech v mozaikové struktuře (obr. 3c,d). Tus, účinky těchto proteinů na rychlost růstu tohoto typu COM nejsou jasné. V koncentrickém COM jsou lamelovité krystaly zarovnány radiálně od středu k vnější straně50. Krystalové plochy lištovitých krystalů nejsou jasné, ale vnější povrch sférického COM, který je vystaven moči, by měl mít stejné krystalografické plochy. Současné výsledky jasně ukazují, že OPN a RPTF-1 mají podobné profily distribučních linií, ve kterých se periodicky distribuují v soustředném COM jako intervalové vrstvy o velikosti přibližně 4 až 6 µm (obr. 4c, d, 5b, c a Doplňková tabulka S1). To ukazuje, že OPN a RPTF-1 mají zanedbatelný rozdíl v adsorpci a inkorporaci na specifických krystalových plochách COM vystavených moči. Předchozí práce in vitro ukázaly, že OPN má inhibiční účinky na růst COM {100}, {121} a {010} tváří 51. Když se vezme v úvahu tento inhibiční účinek, současný výsledek ukazuje, že koncentrický růst COM byl inhibován OPN a možná pomocí RPTF-1, protože RPTF-1 má podobnou kapacitu vázat vápník, a má tedy podobnou účinnost začlenění jako COM.
Obrázek 7. Schémata distribuce proteinu ve třech hlavních texturách v CaOx. (a) Distribuce proteinové matrice byla zohledněna v předchozích studiích (bílá barva: minerální fáze černá barva: organická hmota). (b) Specifická distribuce proteinů zjištěná v této studii (zelená: osteopontin (OPN), modrá: renální protrombinový fragment 1 (RPTF-1) a červená: kalgranulin A (Cal-A). Typ 1 idiomorfní CHSK, Typ2 mozaikový COM a typ 3 soustředně laminovaný COM.
In vivo inhibiční účinky Cal-A na růst krystalů CaOx.Adsorpce Cal-A na specifických plochách krystalů jak COM, tak COD krystalů nebyla v tomto výsledku vidět (obr. 2a a 3a). Cal-A má nižší schopnost vázat vápník než OPN a RPTF-1 a byl přítomen na vnější straně euhedrálních krystalů CHSK a kolem mozaikových zrn COM bez laminované struktury (obr. 2a,e a 3a,e). Je však také známo, že Cal-A inhibuje růst krystalů CaOx in vitro studie28. Tus, Cal-A mohl fungovat jako molekula surfaktantu, která ovlivňuje morfologii a rychlost růstu krystalů bez zabudování do krystalu39,40,52. Za normálních podmínek moči (tj. bez nepravidelně vysoké koncentrace Cal-A) může mít Cal-A nižší inhibiční účinek než OPN a RPTF-1 na růst krystalů COM a CHSK, protože OPN a RPTF{{17} } inhibují vývoj schodů na plochách krystalů přichycením a/nebo blokováním začleněním do krystalů. Kapacita proteinů v ledvinových kamenech vázat vápník by proto pomohla vyhodnotit rozsah jejich inhibičních účinků na růst CaOx V koncentrickém COM, Cal-A vykazoval neperiodické vrstvy, které měly vzdálenosti od 20 do 50 µm (obr. 4c,d , 5d a doplňková tabulka SI). Cal-A byl identifikován v moči tvořivých kamenů28. Přirozeně by tedy mělo docházet ke kolísání jeho koncentrace v moči. Vzhledem k jeho nižší afinitě k vápenatým iontům však nemusí být v textuře COM zaznamenány malé výkyvy koncentrace Cal-A. Cal-A se neperiodicky vylučuje močí jako protizánětlivé proteiny v reakci na zánět53,54. Tus, neperiodické vrstvy Cal-A mohou zaznamenat příležitostně vysoké koncentrace Cal-A v moči v důsledku nepravidelných změn prostředí, jako je infekce, poranění a krvácení. Jeho inhibiční účinek na růst COM by silně závisel na jeho koncentraci kolem rostoucích krystalů, protože několik peptidů má takovou závislost na růstu krystalů kalcitu42. Cal-A může slabě zpomalit růst COM částečným obsazením rostoucího povrchu, když je jeho koncentrace kolem krystalu nízká, protože protein není náchylný k zabudování do CaOx. V koncentrickém COM představují mezerové vrstvy obklopené drobnými usazeninami nalezenými pozorováním SEM téměř identická místa jako vrstvy Cal-A nalezené pomocí multi-IF zobrazení (obr. 6a-d). Proto, když vrstva Cal-A ztloustne v důsledku své nepravidelně vysoké koncentrace některými biologickými změnami, může Cal-A fungovat jako silný inhibitor růstu CaOx tím, že široce zabírá rostoucí povrch. Zánět, který je spouštěčem sekrece Cal-A, může také ovlivnit jiný krok tvorby kamenů, protože typ bílých krvinek (tj. makrofágy), které mají podpůrné a inhibiční účinky na tvorbu ledvinových kamenů, byl nalezen v experimentech využívajících model ledvinového kamene myši16.
Možná aplikace multi-IF zobrazení na celkovou tvorbu ledvinových kamenů.Tato práce rozšířila aplikaci multi-IF zobrazování proteinů na tvrdší biominerální vzorky, tj. ledvinové kameny. Nukleace krystalů, růst krystalů, agregace krystalů a adheze krystalů jsou považovány za důležité kroky při tvorbě ledvinových kamenů. OPN, RPTF-1 a Cal-A jsou ve studiích in vitro uváděny jako inhibitory nukleace, růstu a agregace CaOx48,49. Současná rozšířená aplikace multi-IF zobrazení poskytuje in vivo důkaz o inhibičním účinku na růst CaOx proteiny, který byl implikován předchozími studiemi in vitro. Zkoumání účinků proteinů v každém kroku bylo provedeno in vivo studiemi na myších a také řadou studií in vitro14,15,26. Například kritická renoprotektivní role OPN jako inhibitoru tvorby krystalů a inhibitoru adheze krystalů byla hlášena na základě experimentů in vivo na myších26, zatímco podpora adheze krystalů k tubulárním epiteliálním buňkám pomocí OPN a posílení CaOx kamenů tvorba byla hlášena na základě novějších experimentů in vivo s použitím myší s vyřazením OPN14,15. Zcela odlišná krystalová morfologie nalezená v ledvinových kamenech myši s vyřazením OPN také podporuje účinky OPN v několika krocích tvorby ledvinových kamenů. Předkládaný způsob vizualizace by byl užitečný při hodnocení účinků proteinu v těchto studiích in vitro na myších a dokonce by byl užitečný při hodnocení různých kroků tvorby lidských ledvinových kamenů. Tato nová analýza by nám umožnila interpretovat je in vivo účinky různých proteinů na tvorbu CaOx kamenů, což může otevřít cestu pro patologické vyšetření a personalizovanou medicínu ke zvládnutí onemocnění lidských ledvinových kamenů.
Metody
Etické prohlášení. Výzkumný projekt prezentovaný v tomto příspěvku byl schválen institucionální revizní komisí postgraduální lékařské fakulty univerzity Nagoya City. Všechny metody byly provedeny v souladu s příslušnými směrnicemi a předpisy. Písemný informovaný souhlas všech subjektů byl získán v souladu s postupy schválenými radou etické komise.
Sběr kamene a příprava kamenných řezů. Ledvinové kameny byly odebrány pacientům a byly analyzovány na městské univerzitě v Nagoji v Japonsku. Patnáct vzorků ledvinových kamenů CaOx bylo vybráno z našich tisíců sbírek lidských ledvinových kamenů na základě informací z objemové infračervené spektroskopie (IR) a byly připraveny tenké řezy. Objemové mineralogické složení kamene bylo odhadnuto pomocí IR analýzy. Na toto vyšetření ledvinových kamenů byla aplikována petrologická metodika tenkého řezu, původně navržená pro geologický výzkum55. Vzorky ledvinových kamenů byly zcela zality v epoxidové pryskyřici a nařezány. Průřez byl vybroušen brusivy (SiC a Al2O3) a poté byl vyleštěný povrch přilepen na podložní sklíčko pomocí epoxidové pryskyřice. Byl proveden druhý řez, aby se vytvořil vzorek o tloušťce 1- mm rovnoběžný se sklíčkem. Vzorek byl poté vyleštěn na tloušťku 20–30 µm a upraven leštěním diamantovou kaší.
Polarizovaná mikroskopie a infračervená spektrofotometrie s Fourierovou transformací.Optické vlastnosti každého krystalu tvořícího ledvinové kameny byly pozorovány polarizovanou mikroskopií s 20–30 µm silnými řezy fragmentů kamenů. Povrchový index každé roviny CHSK byl stanoven porovnáním pozorování s typickým tvarem krystalů CHSK vypočítaným pomocí VESTA56. Na základě optických vlastností byly krystaly klasifikovány a poté analyzovány infračerveným spektrofotometrem s Fourierovou transformací (FT/IR6100, JASCO). Rozsah vlnočtu měření byl 7800–350 cm-1. Všechna měření byla prováděna při teplotě okolí. Velikost měřicího bodu byla nastavena na 20 x 20 um2. Krystalové fáze byly identifikovány na základě získaného IR spektra s databází RRUFF.
Vícebarevné imunofluorescenční barvení proteinové matrice.Řezy kamenů použité pro analýzu minerálních fází byly také použity pro analýzu distribuce proteinů s barvením Multi-IF. Tenké řezy byly ošetřeny roztokem citrátu (pH 6.0) po dobu 1 minuty pro minimální leptání. Te řez byl promyt fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS), poté blokován po dobu 60 minut v 1% bovinním sérovém albuminu ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem s Tween 20 (PBST). Po zablokování byla sekce inkubována s primárními protilátkami přes noc při teplotě místnosti. Primárními použitými protilátkami byly myší monoklonální anti-kalgranulin A (ředění 1:100, Santa Cruz Biotechnology, sc-48352), králičí polyklonální anti-osteopontin (ředění 1:100, Santa Cruz Biotechnology, sc{16}} ) a ovčí monoklonální anti-lidský protrombin Fragment 1 (ředění 1:500, Cedarlane Ontario, Kanada, CL20111AP). Řez byl poté třikrát promyt PBS po dobu 10 minut před inkubací s fluorescenčně konjugovanými sekundárními protilátkami po dobu 1 hodiny, chráněný před světlem. Použité fluorescenčně konjugované sekundární protilátky byly anti-králičí IgG (H plus L) zkříženě adsorbované konjugované s Alexa Fluor 488, anti-myší IgG (H plus L) zkříženě adsorbované konjugované s Alexa Fluor 546 a anti-ovčí IgG (H plus L) Cross Adsorbed konjugovaný s Alexa Fluor 647. Po rozsáhlém 3násobném promytí PBS po dobu 10 minut byla fluorescence detekována pomocí konfokální autofluorescenční mikroskopie (Nikon A1R). Shromážděné vlnové délky excitace a emise zahrnovaly excitaci 487 nm (emise shromážděná mezi 500 a 550 nm), excitaci 561 nm (emise shromážděná mezi 570 a 620 nm) a 639 nm (emise shromážděná mezi 663 a 738 nm) pro OPN, RPTF{{ 46}}, respektive Cal-A. U části vzorků byla pozorována autofluorescence (AF), ale intenzita signálu byla mnohem nižší než proteinové signály diskutované v této studii. Byla také hodnocena vazba protilátek, které nejsou specifické pro cílové proteiny. Byla potvrzena nepřítomnost IF signálů z nespecifické protilátky. Negativní kontrolní testy byly provedeny k vyhodnocení nepřítomnosti falešně pozitivních signálů (doplňkový obr. S5). Pro barvení protilátek byly použity izotypové kontroly k detekci jakékoli nespecifické vazby. Konkrétně, primární protilátky použité pro kontroly byly králičí (DA1E) mAb IgG XP izotypová kontrola (1:100 ředění Cell Signaling), myší (G3A1) mAb IgG1 izotypová kontrola (1:100 ředění Cell Signaling) a ovčí mAb IgG izotyp (1 :100 ředění Novus) za použití stejných fluorescenčně značených sekundárních protilátek jako výše. Profily linií Te byly zkonstruovány pomocí ImageJ, ukazující nejvyšší a nejnižší kontrastní bod jako 100 procent a 0 procent, v tomto pořadí, pro každý protein.