MTHFD2 je metabolický kontrolní bod řídící efektor a regulační osud a funkci T buněk

Grafický abstrakt

autoři:

Ayaka Sugiura, Gabriela Andrejeva, Kelsey Voss, ..., Ashutosh K. Mangalam, Joshua D. Rabinowitz, Jeffrey C. Rathmell

Korespondence:

jeff.rathmell@vumc.org

Stručně :

K podpoře rychlé proliferace T buněk je nutná syntéza nukleotidů. Sugiura a kol. ukazují, že de novo metabolismus purinů signalizuje přímou diferenciaci a funkci T buněk a identifikují MTHFD2 jako metabolický kontrolní bod a terapeutický cíl pro zánětlivá onemocnění.

Zvýraznění

• MTHFD2 je rozhodující pro aktivované CD4 T buňky pro udržení de novo syntézy purinů

• Nedostatek MTHFD2 podporuje fenotypy podobné buňkám Treg a metabolismus v buňkách Th17 d Inhibice MTHFD2 potlačuje signalizaci mTORC1 a mění metylaci histonů

• MTHFD2 může být zaměřen na ochranu proti zánětu a autoimunitě in vivo

MTHFD2 je metabolický kontrolní bod řídící osud a funkci efektorových a regulačních T buněk

Ayaka Sugiura,¹Gabriela Andrejeva,¹Kelsey Voss,¹Darren R. Heintzman,¹Xincheng Xu,⁵Matthew Z. Madden,¹Xiang Ye,¹Katherine L. Beier,¹Nowrin U. Chowdhury,²Melissa M. Wolfová,²Arissa C. Youngová,¹Dalton L. Greenwood,¹Allison E. Sewellová,¹Shailesh K. Shahi,³Samantha N. Freedman,³Alanna M. Cameronová,⁴Patrik Foerch,⁴Tim Bourne,⁴Juan C. Garcia-Canaveras,⁵John Karijolich,¹Dawn C. Newcomb,²Ashutosh K. Mangalam,³Joshua D. Rabinowitz,⁵a Jeffrey C. Rathmell^1,6,*

¹Vanderbilt Center for Immunobiology, Department of Patology, Microbiology and Immunology, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN 37232, USA

²Department of Medicine, Division of Hematology and Oncology, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN 37232, USA

³Ústav patologie, University of Iowa, Iowa City, IA 52242, USA

⁴Sitryx Therapeutics Limited, Magdalen Centre, Oxford Science Park, Oxford, UK

⁵Katedra chemie, Ludwig Cancer Research Institute, Princeton Branch, Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics, Princeton University, Princeton, NJ 08544, USA6Vedoucí kontakt

*Korespondence: jeff.rathmell@vumc.org

https://doi.org/10.1016/j.immuni.2021.10.011

SOUHRN

Antigenní stimulace podporuje přeprogramování metabolismu T buněk tak, aby vyhovovaly zvýšeným biosyntetickým, bioenergetickým a signalizačním požadavkům. Ukázali jsme, že enzym metabolismu jednoho uhlíku (1C) methylentetrahydrofolátdehydrogenáza 2 (MTHFD2) reguluje de novo syntézu purinů a signalizaci v aktivovaných T buňkách, aby podpořil proliferaci a produkci zánětlivých cytokinů. V patogenních pomocných T -17 buňkách (Th17) MTHFD2 zabránil aberantní upregulaci transkripčního faktoru FoxP3 spolu s nevhodným ziskem supresivní kapacity. Deficit MTHFD2 také podporoval diferenciaci regulačních T (Treg) buněk. Mechanicky vedla inhibice MTHFD2 k vyčerpání zásob purinů, akumulaci purinových biosyntetických meziproduktů a snížení signalizace mTORC1 senzorem živin. MTHFD2 byl také rozhodující pro regulaci methylace DNA a histonů v buňkách Th17. Důležité je, že nedostatek MTHFD2 snižoval závažnost onemocnění u mnoha modelů zánětlivých onemocnění in vivo. MTHFD2 je tedy metabolickým kontrolním bodem pro integraci purinového metabolismu se signalizací patogenních efektorových buněk a je potenciálním terapeutickým cílem v rámci metabolických drah 1C.

ÚVOD

Účinná mobilizace adaptivní imunitní reakce vyžaduje silnou aktivaci CD4 plus T buněk, aby podstoupily rychlý buněčný růst a proliferaci. To zahrnuje metabolické přeprogramování, řízené senzorem živin mTORC1, z katabolického klidového stavu do anabolického růstového stavu se zvýšenými biosyntetickými, bioenergetickými a signalizačními požadavky. V závislosti na cytokinovém prostředí se CD4 plus T buňky diferencují na efektorové i regulační podskupiny, které mají odlišné metabolické programy řídící jejich efektorové funkce (Bantug et al., 2018; Buck et al., 2015). Rovnováha těchto podskupin je kritická pro normální imunitu při prevenci zánětlivých a autoimunitních onemocnění. Například roztroušená skleróza (RS) je charakterizována zvýšeným množstvím pomocných T-buněk produkujících interleukin-17 (IL- 17)-17 (Th17) a sníženými nebo neúčinnými supresivními regulačními T (Treg) buňkami (Dendrou et al., 2015). Zaměření na specifické metabolické programy těchto podskupin T buněk nabízí alternativní přístup k imunoterapii.

Terapie založená na buněčném metabolismu začala v roce 1948, kdy se ukázalo, že chemoterapeutika proti folátům jsou účinná u dětí s akutní lymfoblastickou leukémií (Farber et al., 1948). Folát přispívá k metabolismu jednoho uhlíku (1C) pro biosyntézu purinů, vytváření donorů methylu a udržování buněčné redoxní rovnováhy (Ducker a Rabinowitz, 2017; Yang a Vousden, 2016). Od té doby bylo vyvinuto mnoho léků, včetně metotrexátu (MTX), fluorouracilu (5-FU) a merkaptopurinu (6-MP), aby se zaměřily na tuto cestu. Rychle proliferující buňky, včetně rakovinných buněk a aktivovaných T buněk, sdílejí závislost na těchto drahách při syntéze DNA a RNA. MTX se stále běžně používá k léčbě autoimunitních onemocnění, jako je revmatoidní artritida (RA) (Brown et al., 2016). Avšak kvůli široké expresi cílových enzymů jsou tato terapeutická činidla spojena s běžnými a potenciálně závažnými nepříznivými účinky. Identifikace cílů metabolických enzymů, které jsou selektivně důležité v požadovaných buněčných populacích, by mohla vést k vývoji bezpečnějších a účinnějších imunoterapií.

Metabolismus 1C zahrnuje folátové a methioninové cykly s přenosem jednotlivých uhlíkových jednotek. Serin slouží jako donor 1C k aktivaci tetrahydrofolátu (THF) na 5,10-methylenTHF se současnou produkcí glycinu. 5,10-methylenTHF lze poté oxidovat pomocí NAD(P) za vzniku purinového prekurzoru 10- formylTHF. Alternativně lze 10-formylTHF syntetizovat z formiátu a THF způsobem závislým na ATP. V cytosolické dráze je produkce 10-fomylTHF zprostředkována methylenTHF dehydrogenázou 1 (MTHFD1). Ztráta MTHFD1 hladoví buňky po cytosolickém 10-formylTHF, ablaci purinové biosyntetické kapacity a mutace v MTHFD1 způsobují těžkou kombinovanou imunodeficienci (SCID) (Field et al., 2015). Mitochondriální dráha se opírá o mitochondriální MTHFD2 a MTHFD1-podobné (MTHFD1L).

Obrázek 1. Metabolismus 1C a MTHFD2 jsou upregulovány v aktivovaném CD4^PlusT buněk a v kontextu EAE

(A) Změna druhů metabolismu nukleotidů v in vitro diferencovaném CD4^PlusPodskupiny T buněk ve srovnání s naivními buňkami měřenými hmotnostní spektrometrií (n=3 biologických replikátů).

(B) Pracovní postup pro cílený screening CRISPR v modelu zánětu plic in vivo.

(C) Změna v množství gRNA z 1C metabolismu cíleného in vivo screeningu CRISPR v primárním CD4^PlusT buňky (statistická analýza provedená MAGeCK, n=3 biologických replikátů).

(D) mRNA exprese genů identifikovaných v (C) během vývoje a aktivace T buněk (data z prohlížeče dat ImmGen RNA-seq).

(E) Proteinová exprese genů identifikovaných v (C) v naivním a aktivovaném CD4^PlusT buňky (data z Immunological Proteome Resource [ImmPRes]).

(F) mRNA exprese genů identifikovaných v (C) v plné krvi jedinců s uvedenými zánětlivými poruchami ve srovnání se zdravými kontrolními jedinci (Aune et al., 2017). RA-MTX, RA při léčbě MTX; SLE, systémový lupus erythematodes; MS-Tx naivní, léčebně naivní MS v době diagnózy; RS zavedená, RS v léčbě a v remisi onemocnění; n=3–8 dárců.

(G) IHC ukazující barvení CD3 a MTHFD2 v segmentu cauda equina míchy myší se symptomatickou EAE při zvětšení 2003 (nahoře; stupnice, 100 mm) a 4003 (dole; stupnice, 50 mm) zvětšení (data jsou reprezentativní ze dvou nezávislých experimentů).

(H a I) Relativní (H) střední intenzita fluorescence (MFI) a (I) mRNA exprese MTHFD2 v CD4^PlusT buňky ze sleziny a míchy myší se symptomatickou EAE a sleziny kontrolních myší (průměr ± SD, jednocestná ANOVA, data jsou reprezentativní pro dva nezávislé experimenty se 6 celkovými biologickými replikáty).

(J) Exprese mRNA MTHFD2 v nediferencovaném CD4^PlusT buňky 0, 5 a 24 hodin po aktivaci protilátkami anti-CD3 a anti-CD28 (průměr ± SD, jednosměrná ANOVA, n=3 biologických replikátů).

(K) Relativní MTHFD2 MFI během 5 dnů po aktivaci v podskupinách CD4 plus T buněk, normalizované na klidové buňky (průměr ± SD, n=3 biologických replikátů). Viz také obrázek S1. Statisticky významné výsledky jsou označeny (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p="" procent="">

MTHFD2 je jedním z nejvíce indukovaných a nadměrně exprimovaných genů u všech nádorů (Nilsson et al., 2014). Ačkoli je MTHFD2 široce upregulován během embryogeneze, má malou nebo žádnou expresi ve většině dospělých tkání (Nilsson et al., 2014). V protinádorové terapii (Zhu a Leung, 2020) může inhibice MTHFD2 vést ke zvýšenému oxidačnímu stresu (Ju et al., 2019; Wan et al., 2020), závislosti na glycinu (Koufaris et al., 2016) a nedostatečné syntéza purinů (Ben-Sahra et al., 2016; Pikman et al., 2016). Deficit MTHFD2 může také potlačit aktivitu mTORC1 prostřednictvím mnoha mechanismů, včetně deplece guaninu a následné inhibice GTPázy Rheb aktivující mTORC1- (Emmanuel et al., 2017). Nedostatek MTHFD2 také způsobuje akumulaci meziproduktů dráhy syntézy purinů, včetně analogu adenosinmonofosfátu (AMP) 5-aminoimidazolkarboxamid ribonukleotidu (AICAR) (Ducker et al., 2016), který může aktivovat proteinkinázu aktivovanou AMP (AMPK) k inhibici mTORC1 (Su et al., 2019).

Protože metabolismus 1C integruje více vstupů živin a je terapeuticky upravitelný, zkoumali jsme roli 1Cmetabolismu v CD4^PlusPodskupiny buněk T efektor (Teff) a Treg. Prostřednictvím nezaujatého cíleného screeningu in vivo CRISPR-Cas9- v primárních myších T buňkách jsme identifikovali MTHFD2 jako zásah, který byl také konzistentně upregulován u jedinců se zánětlivými poruchami. Zejména nedostatek MTHFD2 zhoršil proliferaci a funkci buněk Teff. Deficit MTHFD2 také podporoval aberantní expresi FoxP3 a supresivní aktivitu v buňkách Th17 a zároveň podporoval diferenciaci buněk Treg. Tyto účinky byly spojeny s akumulací AICAR, sníženými koncentracemi purinů, downregulací signalizace mTORC1, zvýšeným mitochondriálním metabolismem a změněnou methylací DNA a histonů. In vivo zacílení na MTHFD2 chránilo před více modely zánětlivých onemocnění. Tato data ukazují, že MTHFD2 slouží jako metabolický kontrolní bod v buňkách Th17 a Treg a zdůrazňují potenciál tohoto enzymu jako cíle pro protizánětlivou imunoterapii.

VÝSLEDEK

Metabolismus 1C a syntéza purinů jsou u CD4 rozdílně aktivní^PlusPodskupiny T buněk

Předpokládali jsme, že syntéza nukleotidů se může u CD4 lišit^PlusPodskupiny T buněk. CD4^PlusT buňky byly diferencovány in vitro na Th1, Th17 a Treg buňky a shromážděny po 72 h pro hmotnostní spektrometrii. Množství druhů nukleotidů bylo obecně zvýšeno ve všech podskupinách ve srovnání s naivními buňkami (obrázek 1A). Je pozoruhodné, že meziprodukty syntézy purinů byly rozdílně hojné, s nejvyšší akumulací glycinamid ribonukleotidu (GAR), 1- (fosforibosyl) imidazolkarboxamidu (SAICAR) a AICAR v buňkách Th17 (obrázek S1A).

Testovat závislost CD4^PlusT lymfocyty na enzymech v metabolismu 1C jsme provedli in vivo screening založený na CRISPR-Cas9-v primárním CD4^PlusT buňky (obrázek 1B). Byla zkonstruována vlastní knihovna vodicí RNA (gRNA) pro cílení enzymů v metabolismu 1C spolu s komplexem tuberózní sklerózy 2 (TSC2) jako pozitivní kontrola a necílené negativní kontroly (NTC). CD4^PlusT buňky izolované z ovalbuminového (OVA)-specifického T buněčného receptoru (TCR) transgenních OT-II Cas9 dvojitě transgenních myší byly transdukovány touto knihovnou a intravenózně přeneseny do Rag1^{__ /__}hostitelé. Myši byly poté imunizovány intranazálním OVA k vyvolání zánětu plic. T buňky získané z plic těchto myší byly sekvenovány a bylo stanoveno obohacení nebo deplece gRNA vzhledem ke vstupním frekvencím. TSC2 gRNA byla obohacena, což podporuje inhibiční roli tohoto proteinu v T buňkách. Naproti tomu gRNA PPAT, AHCY, MAT2A a MTHFD1 byly významně vyčerpány a gRNA GART, DHFR, DNMT1, MTRR, MTR, SHMT2 a MTHFD2 byly sníženy v menší míře, což naznačuje, že tyto geny přispívají k proliferaci T buněk a zánětlivé funkci in vivo (obrázky 1C a S1B).

Dále jsme zkoumali expresní profil genů identifikovaných ze screeningu. Ačkoli všechny byly upregulovány koordinovaně ve vyvíjejících se thymocytech, MTHFD2 mRNA a protein byly indukovány nejsilněji ve stimulovaných periferních T buňkách (obrázky 1D a 1E). Navíc v samostatně publikovaném souboru dat o sekvenování RNA (RNA-seq) z plné krve jedinců s různými zánětlivými a autoimunitními onemocněními (Aune et al., 2017) byl MTHFD2 konzistentně nadměrně exprimován napříč různými stavy, včetně ulcerózní kolitidy, Crohnovy choroby. , celiakie, RA, systémový lupus erythematodes (SLE), psoriáza, psoriatická artritida, Sjo¨ Grenův syndrom a RS (obrázek 1F). Je pozoruhodné, že jedinci s nedávno diagnostikovanou RS měli významně zvýšenou expresi MTHFD2 ve srovnání se zdravými dárci nebo jedinci s RS podstupujícími terapii s remisí onemocnění (obrázek S1C). Tedy CD4^PlusProliferace a přežití T ​​lymfocytů závisí na určitých genech metabolismu 1C a exprese těchto genů se liší v závislosti na stádiích vývoje, aktivace a diferenciace T lymfocytů, stejně jako v nastavení patologického zánětu.

Obrázek 2. Nedostatek MTHFD2 zhoršuje CD4^PlusProliferace a funkce T buněk

(A–D) Proliferace měřená (A) ředěním CellTrace Violet (CTV), (B) životaschopnost, (C) exprese CD25 a (D) exprese TF v CD4^PlusPodskupiny T buněk ošetřené MTHFD2i po dobu 72 hodin po aktivaci (průměr ± SD, jednocestná ANOVA, data jsou reprezentativní pro tři nezávislé experimenty s 9 celkovými biologickými replikáty).

MTHFD2 je vysoce upregulován v CD4 infiltrujícím CNS^PlusT buňky u experimentální autoimunitní encefalomyelitidy (EAE) a u aktivovaného CD4^PlusT buňky in vitro

Regulace MTHFD2 nebyla u CD4 plus T buněk dobře popsána. Pro měření exprese MTHFD2 v zánětlivých lézích in vivo, CD4^PlusT buňky z myelin-specifických TCR transgenních 2D2 myší byly aktivovány a adoptivně přeneseny do Rag1^{__ /__}myši k vyvolání EAE. Poté, co myši začaly vykazovat paralýzu zadních nohou, byl segment cauda equina míchy analyzován imunohistochemicky (IHC). Myši, které dostaly 2D2 T buňky, vykazovaly obohacení MTHFD2 a CD3^Plusbuňky, které chyběly v kontrole (obrázek 1G). Chcete-li přímo určit, zda CD4^PlusT buňky upregulovaly MTHFD2 v zanícených lézích, T buňky ze sleziny a míchy myší vystavených myelinovému oligodendrocytovému glykoproteinu (MOG) a modelu EAE indukovanému toxinem černého kašle (PTX) byly shromážděny pro analýzu. CD4 infiltrující do CNS^PlusT buňky nadměrně exprimovaly MTHFD2 ve srovnání s odpovídající slezinnou CD4^PlusT buňky z kontrolních a EAE myší, jak bylo měřeno průtokovou cytometrií (obrázek 1H) a qRT-PCR (obrázek 11). Kinetika exprese MTHFD2 v CD4^PlusDále byly měřeny T buňky in vitro. Robustní upregulace MTHFD2 mRNA byla detekována po 5 hodinách stimulace a začala klesat o 24 hodin (obrázek 1J), zatímco diferencovaná CD4^PlusPodskupiny T buněk dosáhly nejvyšší exprese proteinu MTHFD2 48 hodin po aktivaci (obrázek 1K). Tato data ukazují, že MTHFD2 je upregulován v CD4^PlusT buňky s aktivací in vitro a v místě zánětu in vivo.

CD4^PlusPodskupiny T buněk rozdílně vyžadují MTHFD2 pro aktivaci, proliferaci, přežití a produkci cytokinů

Dále jsme testovali roli MTHFD2 v aktivaci, diferenciaci, proliferaci a funkci podskupiny CD4 plus T buněk. CD4^PlusT buňky byly aktivovány in vitro v přítomnosti cytokinů pro optimální diferenciaci Th1, Th17 a Treg buněk a vehikula nebo inhibitoru MTHFD2 (MTHFD2i; DS18561882) (Kawai et al., 2019). Po 72 hodinách měly všechny podskupiny sníženou proliferaci (obrázek 2A) a počet živých cyklujících buněk (obrázky S2A a S2B). Životaschopnost byla snížena u buněk Th1 a Th17 (obrázek 2B) a aktivace, měřená expresí CD25, byla snížena ve všech podskupinách (obrázek 2C). Exprese transkripčního faktoru charakterizujícího linii (TF) byla snížena v Th1 buňkách (T-bet^Plus), ale beze změny v buňkách Th17 (ROR t^Plus) a změnil se minimálně v buňkách Treg (FoxP3^Plus) (obrázek 1D). Pro měření funkce Teffových buněk byly buňky znovu stimulovány 12-myristát 13-acetátem (PMA) a ionomycinem. Významně méně buněk Th1 exprimovalo interferon-g (IFNg) a méně buněk Th17 exprimovalo IL-17, když byly diferencovány v přítomnosti MTHFD2i (obrázek 2E). Nebylo to způsobeno zhoršenou počáteční aktivací, protože tyto fenotypy byly zachovány, když byla expozice léku zpožděna až 24 hodin po aktivaci, ačkoli exprese TF charakterizující linii věku byla v tomto nastavení nezměněna (obrázky S2C–S2F). MTHFD2 je tedy vyžadován pro maximální CD4^PlusAktivace T buněk, proliferace, přežití a produkce cytokinů.

Abychom geneticky potvrdili tyto farmakologické účinky, vytvořili jsme Mthfd2^fl/flmyší kmen a zkřížili jej s Cd4- cre transgenními myšmi, aby se dosáhlo podmíněné genetické delece. Jak se očekávalo, aktivovaný CD4^PlusT buňky z Mthfd2^fl/flCD4-cre plus (CD4^ΔMthfd2) myši měly nižší expresi MTHFD2 ve srovnání s buňkami z Mthfd2^fl/flCD4-cre^Plus(divoký typ [WT]) sourozenci (obrázek 2F). Na začátku měly myši CD4DMthfd2 o něco méně CD4^PlusT buňky ve slezině ve srovnání s WT (obrázek 2G). Po in vitro aktivaci a diferenciaci, počtu buněk a životaschopnosti CD4^ΔMthfd2Th17 buňky a v menší míře Treg buňky byly významně nižší (obrázek 2H). Kromě toho byla exprese CD25 snížena v buňkách Th17 a Treg a měla nižší tendenci u buněk Th1 (obrázek 2I). Nakonec CD4^ΔMthfd2Th1 a Th17 buňky měly nižší expresi T-bet a RORt, v daném pořadí. FoxP3 v buňkách Treg však zůstal nezměněn (obrázek 2J). Navzdory změnám v expresi TF produkovaly Teff buňky, které se diferencovaly, normální množství cytokinů (obrázek 2K). Rozdíly ve výsledcích mezi farmakologickým a genetickým přístupem lze přičíst načasování a úplnosti ztráty funkce enzymu během vývoje a potenciálních kompenzačních mechanismů.

MTHFD2i indukuje expresi FoxP3 v buňkách Th17 a zvyšuje diferenciaci buněk Treg

Vzhledem k závislosti Teff buněk na MTHFD2 jsme testovali MTHFD2i regulaci FoxP3 a Treg buněk. Zejména léčba MTHFD2i indukovala aberantní upregulaci FoxP3 v Th1 a výrazněji v buňkách Th17 způsobem závislým na dávce (obrázek 3A). K tomu také došlo, když bylo ošetření odloženo do 24 hodin po aktivaci (obrázek 3B). Podobný trend byl pozorován u buněk CD4DMthfd2 Th17 (obrázek 3C). Tato upregulace FoxP3 byla funkční, protože buňky Th17 ošetřené MTHFD2i získaly supresivní kapacitu, když byly kokultivovány s CD8^PlusT buňky (obrázek 3D). MTHFD2i tak může podporovat fenotypy podobné buňkám FoxP3 a Treg v buňkách Th17. MTHFD2i také zvýšil diferenciaci indukovaných Treg buněk. Buňky Treg byly diferencovány řadou koncentrací transformujícího růstového faktoru b (TGF-b) v přítomnosti MTHFD2i. Při každé testované koncentraci kromě nejvyšší se exprese FoxP3 s léčbou MTHFD2i zvýšila (obrázky 3E a 3F). Tento fenotyp byl také udržován opožděnou léčbou MTHFD2i (obrázek 3G).

Obrázek 3. Nedostatek MTHFD2 indukuje expresi FoxP3 a podporuje posun směrem k oxidativní fosforylaci

(A) Exprese FoxP3 v buňkách Th1 a Th17 ošetřených MTHFD2i 72 hodin po aktivaci (průměr ± SD, jednocestná ANOVA, data jsou reprezentativní pro tři nezávislé experimenty s celkem 9 biologickými replikáty).

(B) Exprese FoxP3 v buňkách Th1 a Th17 aktivovaná po dobu 24 hodin a poté ošetřena vehikulem nebo 500 nM MTHFD2i po dobu 48 hodin (průměr ± SD, nepárový t test, data jsou reprezentativní pro tři nezávislé experimenty s 9 celkovými biologickými replikáty).

(C) Exprese FoxP3 v buňkách Th1 a Th17 od sourozenců WT a CD4DMthfd2 72 hodin po aktivaci (průměr ± SD, nepárový t test, data jsou reprezentativní pro tři nezávislé experimenty s 9 celkovými biologickými replikáty).

(D) Supresivní test měřící aberantní supresivní kapacitu Th17 buněk ošetřených MTHFD2i. Předem ošetřené buňky Th17 byly společně kultivovány s CD8 plus T buňkami obarvenými CTV, aby se změřila proliferace po aktivaci protilátkami anti-CD3 a anti-CD28 (průměr ± SD, jednosměrná ANOVA, n=3 biologických replikátů) .

(E) Exprese FoxP3 v buňkách Treg diferencovaných s řadou koncentrací TGF-b a ošetřených MTHFD2i (průměr ± SD, nepárový t test, data jsou reprezentativní pro tři nezávislé experimenty s 9 celkovými biologickými replikacemi).

(F) Grafy průtokové cytometrie pro data uvedená v tabulce (E).

(G) Exprese FoxP3 v buňkách Treg aktivovaná a diferencovaná nízkými koncentracemi TGF-b po dobu 24 hodin a poté ošetřena MTHFD2i po dobu 48 hodin (průměr ± SD, nepárový t test, data jsou reprezentativní pro tři nezávislé experimenty s 9 celkovými biologickými replikáty ).

(H) Zátěžový test Seahorse XF Cell Mito provedený na buňkách Th17 a Treg ošetřených MTHFD2i (průměr ± SD, n=3 biologických replikátů). (I) Bazální ECAR, bazální OCR, maximální OCR a bazální OCR/ECAR poměr měřený v (H) (průměr ± SD, nepárový t test, data jsou reprezentativní pro dva nezávislé experimenty s celkem 6 biologickými replikáty). Statisticky významné výsledky jsou označeny (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p procento 0,001).

Buňky Treg mají větší mitochondriální metabolismus než buňky Th17 (Michalek et al., 2011). Pro stanovení metabolických důsledků léčby MTHFD2i byly Th17 a Treg buňky hodnoceny analýzami extracelulárního toku. MTHFD2i zvýšil bazální a maximální rychlost spotřeby kyslíku (OCR) Th17 buněk, aby ukázal posun směrem k mitochondriální respiraci (obrázek 3H). Naopak buňky Th17 a Treg měly sníženou bazální extracelulární acidifikaci (ECAR) při léčbě MTHFD2i, což naznačuje sníženou glykolýzu (obrázek 3I). Bazální poměr OCR k ECAR byl významně zvýšen u buněk Th17 a Treg, protože MTHFD2i posunul metabolický program z glykolýzy směrem k oxidativní fosforylaci. Tato data ukazují, že MTHFD2i zvyšuje expresi FoxP3 v buňkách Th17 a buňkách Treg diferencovaných za podmínek nízkého TGF-b a posouvá buňky Th17 k metabolismu více podobnému buňkám Treg.

Nedostatek MTHFD2 v lidských CD4 plus T buňkách snižuje proliferaci a životaschopnost buněk Th17 a zároveň zvyšuje expresi FOXP3 a tlumí aktivitu mTORC1

Pro testování převoditelnosti výše uvedených zjištění na lidské buňky, CD4^PlusT buňky izolované z periferní krve zdravých dárců byly diferencovány in vitro na Th1, Th17 a Treg buňky a ošetřeny vehikulem nebo MTHFD2i od okamžiku aktivace. Proliferace byla významně snížena u buněk Th17 a Treg ošetřených MTHFD2i (obrázek 4A) a buňky Th17 také vykazovaly zvýšenou apoptózu (obrázek 4B). Snížená proliferace v buňkách Th17 byla rekapitulována genetickým přístupem pomocí malé interferující RNA (siRNA) (obrázky 4C a S2G). Podobně jako u myších buněk byla exprese FOXP3 vyšší v lidských Th17 buňkách ošetřených MTHFD2i a měla vyšší tendenci u lidských Treg buněk ošetřených MTHFD2i (obrázky 4D a S2H). Vzhledem k tomu, že osa mTORC1-AMPK je kritická pro diferenciaci Th17 a Treg buněk, byla také měřena fosforylace mTORC1 cílového ribozomálního proteinu S6 (fosfo-S6). To ukázalo sníženou aktivitu mTORC1 v buňkách Th17 s MTHFD2i nebo siMTHFD2 (obrázek 4E). Ztráta proliferační kapacity a indukce exprese FOXP3 v buňkách Th17 a Treg tedy může být rekapitulována v primárním lidském CD4^PlusT buňky.

Obrázek 4. Nedostatek MTHFD2 zhoršuje proliferaci a indukuje expresi FOXP3 v lidských Th17 buňkách

(A) Proliferace měřená ředěním CTV v podskupinách lidských CD4 plus T buněk ošetřených vehikulem nebo 2 mM MTHFD2i po dobu 72 hodin po aktivaci protilátkami anti-CD3 a anti-CD28 (párový t test, data jsou reprezentativní pro tři nezávislé experimenty s 5 –6 zdravých dárců).

(B) Apoptóza měřená annexinem V v lidských CD4 plus T buňkách ošetřených MTHFD2i po dobu 72 hodin (párový t test, data jsou reprezentativní pro tři nezávislé experimenty s 5–6 zdravými dárci).

(C) Exprese Ki-67 v lidských CD4 plus T buňkách transdukovaných NTC nebo siMTHFD2 (párový t test, data reprezentují tři nezávislé experimenty se 4 zdravými dárci pacientů).

(D) Exprese FOXP3 v lidských CD4 plus T buňkách ošetřených MTHFD2i po dobu 72 hodin (párový t test, data jsou reprezentativní pro tři nezávislé experimenty s 6–10 zdravými dárci).

(E) Změna exprese fosfo-S6 v lidských CD4 plus T buňkách ošetřených MTHFD2i po dobu 72 hodin nebo transdukovaných siMTHFD2 (průměr ± SD, jeden vzorek t test, data reprezentující tři nezávislé experimenty se 4–6 zdravými dárci). Statisticky významné výsledky jsou označeny (* p < 0.{{10}}5,="" **="" p="">< 0,01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p="" procent="">

T buňky se spoléhají na enzymatickou funkci MTHFD2 a fenotypy mohou být zachráněny produktem

MTHFD2 je nutný pro udržení mitochondriálního formiátu pro syntézu purinů (Ma et al., 2017), ale může také hrát neenzymatické role. Podpora esenciální enzymatické aktivity vedlo ošetření MTHFD2i ke kompenzačnímu vychytávání formiátu z média v podskupinách CD4 plus T buněk (obrázek 5A). Jednotka 1C použitá pro syntézu formiátu je poskytnuta konverzí serinu na glycin a intracelulární serin se akumuloval, zatímco glycin byl vyčerpán působením MTHFD2i ve všech podskupinách (obrázek 5B). Koncentrace methioninu se také mírně zvýšily, což naznačuje inhibici cyklu methioninu. Jak se očekávalo, vzhledem k tomu, že krok konverze serin-glycin je před MTHFD2, tyto změny nebyly zachráněny poskytnutím formiátu v médiu.

Obrázek 5. Účinky MTHFD2i na podskupiny T buněk jsou zachráněny exogenním formiátem

(A) Příjem formiátu měřený pomocí1H-magnetické rezonanční spektroskopie (MRS) v podskupinách CD4 plus T buněk ošetřených vehikulem nebo 500 nM MTHFD2i po dobu 72 hodin po aktivaci (průměr ± SD, nepárový t test, data jsou reprezentativní pro dva nezávislé experimenty se 6 celkovými biologickými replikacemi).

(B) Změna koncentrací serinu, glycinu a methioninu v CD4 plus T buňkách ošetřených 500 nM MTHFD2i nebo 500 nM MTHFD2i plus 1 mM formiátem po dobu 4–6 hodin ve srovnání s vehikulem, měřeno hmotnostní spektrometrií (průměr ± SD, n { {8}} biologických replikátů).

(C) Počet živých buněk, životaschopnost a exprese CD25 v MTHFD2i ošetřených CD4 plus T buňkách zachráněných 1 mM formiátem nebo 60 mM roztokem adeninu a guaninu purinu po dobu 72 hodin po aktivaci (průměr ± SD, jednosměrná ANOVA, data jsou reprezentativní ze tří nezávislých experimentů s celkem 9 biologickými replikáty).

(D) Počet živých buněk, životaschopnost a exprese CD25 v CD4 plus T buňkách od WT nebo CD4DMthfd2 sourozenců zachráněných formiátem nebo puriny po dobu 72 hodin po aktivaci (průměr ± SD, jednocestná ANOVA, n=3 biologických replikátů ).

Dále jsme testovali, zda přidání formiátu nebo roztoku adeninu a guaninu purinu může zachránit nedostatečnou enzymatickou funkci a zvrátit následné účinky nedostatku MTHFD2. 1 mM formiát skutečně obnovil proliferaci, životaschopnost a aktivaci v buňkách ošetřených MTHFD2i (obrázek 5C). Purinová suplementace zachránila proliferaci ve všech podskupinách a aktivaci v buňkách Th1 a Th17, ale nikoli životaschopnost ve všech podskupinách a aktivaci v buňkách Treg. Formate také zachránil proliferaci, životaschopnost a aktivaci v CD4^ΔMthfd2T buňky (obrázek 5D). Zhoršená produkce cytokinů v buňkách Th1 a Th17 ošetřených MTHFD2i byla obrácena na množství vehikula přidáním formiátu nebo purinu (obrázek 5E). Pozoruhodné je, že aberantní upregulace FoxP3 v buňkách Th17 byla zachráněna přidáním purinu, ale nikoli formiátu, zatímco přidání formiátu a purinu snížilo expresi FoxP3 na výchozí hodnotu v buňkách Treg diferencovaných s nízkými koncentracemi TGF-b (obrázek 5F). Zdá se, že fenotypy MTHFD2i jsou závislé na udržování mitochondriálních formiátů nebo purinů MTHFD2.

MTHFD2 reguluje aktivitu mTORC1 a metylaci DNA a histonů v CD4^PlusT buňky

V imortalizovaných rakovinných buňkách může nedostatek MTHFD2 vést k akumulaci meziproduktů syntézy purinů GAR, SAICAR a AICAR, které jsou před 10-formylTHF zprostředkovanými kroky formylace (Ducker et al., 2016). CD4^PlusPodskupiny T buněk byly kultivovány po dobu 72 hodin před expozicí MTHFD2i po dobu 4–6 hodin. Tento krátký časový rámec byl zvolen tak, aby se předešlo jakýmkoli sekundárním efektům, včetně kompenzačních změn. Přechodná léčba MTHFD2i vedla k akumulaci GAR, SAICAR a AICAR ve všech podskupinách (obrázek 6A). Tento účinek byl plně zachráněn přidáním 1 mM formiátu, což podporuje enzymatickou roli MTHFD2. Nukleotidy a nukleobáze, včetně guaninu, byly také depletovány MTHFD2i a zachráněny formiátem v buňkách Th17 a Treg (obrázek 6B).

Obrázek 6. MTHFD2i vede k akumulaci meziproduktů syntézy purinů, tlumí aktivitu mTORC1 a změněnou metylaci DNA a histonů

(A) Změna koncentrací GAR, SAICAR a AICAR v CD4 plus T buňkách ošetřených 500 nM MTHFD2i nebo 500 nM MTHFD2i plus 1 mM formiátem po dobu 4–6 hodin vzhledem k vehikulu, měřeno hmotnostní spektrometrií (průměr ± SD, jedna- způsob ANOVA, n=3 biologických replikací).

(B) Změna druhů metabolismu nukleotidů v buňkách Th17 a Treg ošetřených MTHFD2i s nebo bez formiátu po dobu 4–6 hodin vzhledem k vehikulu, měřeno hmotnostní spektrometrií (n=3 biologických replikátů).

(C) Imunoblot fosfo-S6, S6, Rheb, fosfo-ACC, ACC, HIF-1a a b-aktin v CD4 plus T buňkách ošetřených MTHFD2i s nebo bez formiátu po dobu 72 hodin po aktivaci (data reprezentující tři nezávislé experimenty s n=3 biologickými replikáty).

(D) Změna v metabolitech cyklu TCA v buňkách Th17 ošetřených MTHFD2i s nebo bez formiátu po dobu 6 hodin vzhledem k vehikulu, měřeno hmotnostní spektrometrií (průměr ± SD, jednocestná ANOVA, n=3 biologických replikátů).

(E) Teplotní mapy poměru kontroly H3K27me3 ku IgG v oblastech ±10- kb kolem promotorů známých genů UCSC v buňkách Th17 a Treg ošetřených MTHFD2i, měřeno pomocí CUT&RUN (data shromážděná ze 3 biologických replikátů).

(F) Tepelná mapa střední frekvence metylace DNA lokusu Foxp3 podle místa CpG v buňkách Th1 a Th17 ošetřených vehikulem nebo 500 nM MTHFD2i a v buňkách nTreg od sourozenců WT nebo CD4DMthfd2 (Moodův test, n=3 biologických replikátů).

(G) Tabulka (F) podle proximálního promotoru, distálního promotoru a TSDR (párový t test). Viz také obrázky S3 a S4. Statisticky významné výsledky jsou označeny (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p="" procent="">

AICAR a nukleotidy jsou zavedené regulátory osy mTORC1-AMPK (Emmanuel et al., 2017; Kim et al., 2016). Exprese fosfo-S6 byla skutečně snížena léčbou MTHFD2i ve všech podskupinách a plně obnovena přidáním formiátu (obrázky 6C a S3A). GTP-vazebný protein Rheb, obligátní aktivátor mTORC1, může být citlivý na intracelulární dostupnost guaninu (Emmanuel et al., 2017) a exprese Rheb byla tlumena ošetřením MTHFD2i (obrázky 6C a S3B). AICAR je analog adenosinu a aktivátor AMPK (Rae a Mairs, 2019; Su et al., 2019). 72 hodin po aktivaci se však fosforylace AMPK nebo jejích cílů, acetyl-koenzym A(CoA) karboxylázy (fosfo-ACC) a kinázy aktivující autofagii (fosfo-ULK1) podobné Unc{19}}, při léčbě MTHFD2i nezměnila (Obrázky 6C, S3C a S3D). Aktivita mTORC1 podporuje Th17 a zeslabuje diferenciaci buněk Treg částečně prostřednictvím indukce glykolytického metabolismu závislého na HIF-1a (Shi et al., 2011). V souladu s tím byla exprese HIF{31}}snížena v buňkách Th17 ošetřených MTHFD2i a CD4DMthfd2 (obrázky 6C, S3E a S3F). Tyto změny v aktivitě mTORC1 nebyly spojeny s žádnými deficity v signalizaci TCR, jak bylo měřeno expresí Nur77 s restimulací a bez restimulace (obrázek S3G). Aktivita převaděče signálu a aktivátoru transkripce 3 (STAT3), která je kritická pro vývoj buněk Th17, se při léčbě MTHFD2i nezměnila nebo se mírně zvýšila (obrázek S3H). Snížená aktivita mTORC1 a posun od glykolýzy směrem k oxidativní fosforylaci při léčbě MTHFD2i naznačovaly změny v relativním množství metabolitů cyklu trikarboxylových kyselin (TCA). Koncentrace sukcinátu a fumarátu byly významně sníženy pomocí MTHFD2i, ale byly zachráněny formiátem (obrázek 6D).

Metabolity TCA jsou známými inhibitory DNA a histondemethyláz (Su et al., 2016) a vyčerpání sukcinátových a fumarátových zásob může podporovat hypomethylovaný stav. Tri-methylace H3K27 (H3K27me3) napříč genomem byla měřena sekvenováním CUT&RUN (štěpení pod cíli a uvolňování pomocí nukleázy) (Skene a Henikoff, 2017). Buňky Th17 ošetřené MTHFD2i skutečně snížily H3K27me3 ve srovnání s vehikulem (obrázky 6E a S4A). Methylace DNA v lokusu Foxp3 byla také měřena sekvenováním bisulfátu, aby se určilo, zda diferenciální methylace přispěla k upregulaci FoxP3 indukované MTHFD2i. Ačkoli se několik lokusů CpG lišilo ve frekvenci methylace mezi podmínkami vehikula a MTHFD2i, nebyl v demethylované oblasti specifické pro buňky Treg (TSDR) žádný rozpoznatelný vzor. Nebyly také žádné rozdíly mezi buňkami nTreg (CD4 plus CD25 plus) izolovanými z myší WT a CD4DMthfd2 (obrázek 6F), ačkoli čistota každé obohacené populace byla nízká (obrázek S4B). V buňkách Th17 ošetřených MTHFD2i však došlo k významnému snížení frekvence methylace DNA v oblasti proximálního promotoru Foxp3 ve srovnání s vehikulem (obrázek 6G), což ukazuje na možné zvýšení transkripce pomocí MTHFD2i.

Kromě udržování intracelulárního formiátu přispívá aktivita MTHFD2 k buněčné redoxní rovnováze prostřednictvím konverze NAD^Plusna NADH a NADP^Plusna NADPH (Shin et al., 2017) a podpora transsulfurační dráhy a následné syntézy glutathionu. Buňky Th17 ošetřené MTHFD2i měly snížené koncentrace NAD^Plus, NADH, NADP^Plusa NADPH, který byl zachráněn formiátem (obrázek S4C). Nicméně NAD^Plus/NADH a NADP^PlusPoměry /NADPH se za podmínek nezměnily. To v kombinaci s nedostatkem změn v buněčných reaktivních formách kyslíku (ROS) a mitochondriálním superoxidu (obrázek S4D) naznačuje, že změny v redoxním stavu pravděpodobně nebudou hlavním přispěvatelem k fenotypu MTHFD2i.

Nedostatek MTHFD2 in vivo snižuje závažnost mnoha zánětlivých onemocnění

Účinnost MTHFD2 jako terapeutického cíle byla dále testována v in vivo modelu hypersenzitivity opožděného typu závislé na T buňkách (DTH). Myši byly imunizovány a stimulovány na uchu hemocyaninem přílipky (KLH) pro vyvolání lokálního zánětu a ošetřeny perorálním vehikulem nebo MTHFD2i. Léčba neprokázala žádnou zjevnou toxicitu, protože zvířata si udržela svou hmotnost (obrázek S5A). Důležité je, že tloušťka a hmotnost ucha byly zvýšeny u kontrolních DTH myší, ale ne u zvířat léčených inhibitorem, což ukazuje na ochranu před zánětem po léčbě MTHFD2i (obrázky 7A, 7B a S5B). KLH-specifický imunoglobulin G (IgG) byl také snížen při nejvyšší dávce inhibitoru, což ukazuje na potenciální účinky přesahující funkci B buněk (obrázek 7C).

Obrázek 7. Zacílení MTHFD2 in vivo snižuje závažnost onemocnění v modelech DTH, EAE a IBD

(A a B) Relativní tloušťka ucha (A) a hmotnost biopsie (B) 10 den po KLH s imunizací CFA a 3 dny po stimulaci KLH pro indukci DTH (jednocestná ANOVA). Myši byly léčeny dvakrát denně perorálně 0, 100 nebo 300 mg/kg MTHFD2i (průměr ± SEM, n=8 biologických replikátů).

(C) Koncentrace KLH-specifického IgG v den 10 KLH-indukovaného DTH (průměr ± SEM, Kruskal-Wallisův test, n=8 biologických replikátů).

(D) Průměrné klinické skóre v průběhu času u sourozenců WT a CD4DMthfd2 imunizovaných MOG s CFA a PTX k vyvolání EAE (průměr ± SEM, více Mann-Whitney testů, data jsou reprezentativní pro dva nezávislé experimenty, každý s 5 biologickými replikáty).

(E) Počet buněk a frekvence CD4 plus T buněk v míše EAE myší při maximální závažnosti onemocnění (průměr ± SEM, nepárový t test, data jsou reprezentativní pro dva nezávislé experimenty s 9 celkovými biologickými replikáty).

(F) Exprese CD25 a CD44 v CD4 plus T buňkách z míchy EAE myší (průměr ± SEM, nepárový t test, n=4 biologických replikátů).

(G a H) Počet buněk (G) T-bet plus , RORgt plus , FoxP3 plus , FoxP3 plus /T-bet plus poměr, FoxP3 plus /RORgt plus poměr a (H) IL-17 plus , IFNg plus a IL-17 plus IFNg plus CD4 plus T buňky z míchy EAE myší (průměr ± SEM, nepárový t test, data jsou reprezentativní pro dva nezávislé experimenty s 9 celkovými biologickými replikáty).

(I) H&E, anti-CD3 IHC a Luxol Fast Blue (LFB) barvení na myelin v míše myši WT bez imunizace a sourozenci WT a CD4DMthfd2 s EAE na vrcholu onemocnění (zvětšení 2003, reprezentativní pro 5 biologických replikátů ).

(J) Změna tělesné hmotnosti v průběhu času Rag1^__/__myši, kterým byly ip injikovány WT nebo CD4DMthfd2 naivní CD4 plus T buňky k indukci kolitidy IBD (průměr ± SEM, vícenásobné t testy, n=8 biologických replikátů).

(K a L) Počet buněk (K) celkových CD4 plus T buněk a (L) T-bet plus , RORgt plus a FoxP3 plus CD4 plus T buněk z MLN myší IBD (průměr ± SEM, nepárový t test n { {4}} biologických replikátů). Viz také obrázky S5 a S6. Statisticky významné výsledky jsou označeny (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p="" procent="">

Podobně duální inhibitor MTHFD1/2 LY345899 (Gustafsson et al., 2017) byl účinný při zmírňování onemocnění v modelu EAE. EAE byla indukována pomocí MOG a PTX a myši byly léčeny denně intraperitoneální (ip) injekcí DMSO nebo LY345899. Léčba inhibitory vedla k významnému snížení závažnosti onemocnění a kumulativnímu klinickému skóre ve srovnání s vehikulem (obrázky S5C a S5D). Myši byly usmrceny v den 26 a buňky infiltrující míchu byly shromážděny pro imunitní profilování. Je pozoruhodné, že výrazně méně CD45^Plus, CD4^Plusa CD8^Plusbuňky infiltrovaly míchu myší ošetřených LY345899- (obrázky S5E–S5G). Ve frekvenci ROR t nedošlo k žádným změnám^Plusnebo FoxP3^Plusbuňky mezi infiltrujícími CD4^PlusT buňky (obrázek S5H). Došlo však ke snížení frekvence IFNg plus IL-17 plus buněk a zvýšení IL-17 plus buněk (obrázek S5I), což naznačuje možný přechod na méně patogenní fenotyp.

K přímému testování vnitřní závislosti T buněk na MTHFD2 in vivo byli sourozenci WT a CD4DMthfd2 z jednoho vrhu podrobeni třem různým modelům: EAE, zánětlivé onemocnění střev (IBD) a alergické onemocnění dýchacích cest. EAE byla opět indukována pomocí MOG a PTX a podobně jako v experimentu s inhibitorem měly myši CD4DMthfd2 významně sníženou závažnost onemocnění během 26 dnů (obrázek 7D). Samostatná kohorta byla usmrcena při vrcholu onemocnění 15. den po indukci pro fenotypizaci T buněk (obrázky S6A a S6B). I když CD4^Plusnebo CD8^PlusPočty T buněk se ve slezině nezměnily (obrázek S6C), infiltrace CD4 plus T buněk do míchy byla významně snížena (obrázek 7E). CD4 plus T buňky infiltrující míchu u myší CD4DMthfd2 měly podobnou expresi CD25 jako WT, ale sníženou expresi CD44, což ukazuje na částečně narušenou aktivaci (obrázek 7F). Čísla T-betu^PlusBuňky RORt plus a FoxP3 plus (obrázek 7G), stejně jako buňky IL-17 plus a IFNg plus (obrázek 7H), byly také sníženy v míše CD4DMthfd2 myší ve srovnání s WT. Je pozoruhodné, že poměry buněk FoxP3 plus k T-bet plus a RORgt plus byly zvýšeny u myší CD4DMthfd2 ve srovnání s WT na vrcholu onemocnění, což odráží in vitro nálezy zvýšené exprese FoxP3 s deficitem MTHFD2 (obrázek 7G). Ačkoli frekvence buněk exprimujících TF mezi infiltrujícími buňkami měla celkově vyšší tendenci, frekvence exprese cytokinů byla nezměněna (obrázky S6D a S6E). Histologie míchy kontrolních myší bez EAE a WT a CD4^ΔMthfd2myši s EAE vykazovaly zvýšenou celularitu a CD3 pozitivitu v míše u WT myší, která byla spojena s demyelinizací, jak ukazuje barvení Luxol Fast Blue (obrázek 7I). Tyto změny chyběly u kontroly bez EAE a CD4^ΔMthfd2myši.

Úloha MTHFD2 byla dále testována na modelech IBD a alergických onemocnění dýchacích cest. WT a CD4DMthfd2 naivní CD4 plus T buňky byly přeneseny do Rag1/příjemců k zahájení IBD. Ačkoli myši, které dostávaly WT buňky, začaly s progresí IBD ztrácet na váze, příjemci CD4DMthfd2 T buněk nadále přibývali na váze (obrázek 7J). Významně nižší počty a frekvence CD4DMthfd2 T buněk byly nalezeny ve slezinách (obrázek S6F) a mezenterických lymfatických uzlinách (MLNs), které drénují tlusté střevo (obrázky 7K a S6G). Počty T-bet plus, RORt plus a FoxP3 plus CD4DMthfd2 T buněk byly také sníženy u MLN, ale frekvence FoxP3 plus buněk byla zvýšena (obrázky 7L a S6H). V tomto pozdním stádiu však nebyly žádné rozdíly v poměru počtu buněk FoxP3/T-bet a FoxP3/RORgt v MLN (obrázek S6I). Podobně jako u nálezů MTHFD2 jako mírného zásahu ve screeningu in vivo zánětu dýchacích cest CRISPR (obrázek 1C), měly myši CD4DMthfd2 vystavené alergickému onemocnění dýchacích cest vyvolanému Alternaria trend snížené abundance neutrofilů v tekutině z bronchioalveolární laváže (BALF), i když ne. změny byly pozorovány v počtu lymfocytů, eozinofilů a makrofágů BALF (obrázek S7A).

Nakonec byl testován účinek MTHFD2i na obecnou imunitní aktivitu. OVA-specifický OT-II CD45.2^PlusCD4^PlusT buňky byly adoptivně přeneseny do CD45.1^Plusmyši, které byly poté imunizovány subkutánně emulzí OVA s kompletním Freundovým adjuvans (CFA) a léčeny denně perorálním vehikulem nebo MTHFD2i. Tělesná hmotnost se za všech podmínek nezměnila (obrázek S7B). Rozšíření přeneseného OT-II CD45.2^PlusU imunizovaných myší ošetřených MTHFD2i bylo mírně zpožděno, ale počet vehikul dosáhl 7. den (obrázky S7C–S7E). Frekvence IFNg plus buněk však byla snížena při drenáži LN (obrázek S7F). Tato data ukazují, že in vivo léčba MTHFD2i umožňuje antigen-specifickou expanzi T buněk po akutní stimulaci, i když s utlumenou produkcí zánětlivých cytokinů.

DISKUSE

Aktivace, diferenciace a funkce T buněk vyžadují odpovídající metabolické přeprogramování, aby byly splněny zvýšené požadavky buněk na energii, biosyntetické stavební bloky a signální molekuly. V této studii jsme zkoumali funkci metabolismu 1C v primárních CD4 plus T buňkách. Pomocí kombinace in vivo primárního T buněčného screeningu na bázi CRISPR a dat genové exprese byl MTHFD2 identifikován jako potenciální cíl pro protizánětlivé terapie. Inhibice nebo nedostatek MTHFD2 obecně vedly ke snížení proliferace CD4 plus T buněk. Je pozoruhodné, že to bylo spojeno s indukcí exprese FoxP3 a supresivní funkcí v buňkách Th17, stejně jako se zvýšenou diferenciací Treg buněk. Tato data naznačují, že MTHFD2 může fungovat jako metabolický kontrolní bod v Th17-Treg buněčné ose, přičemž léčba MTHFD2i převádí rovnováhu z patogenního na protizánětlivější fenotyp. Inhibice MTHFD2 nebo genetická deficience skutečně zlepšily závažnost onemocnění v mnoha in vivo modelech autoimunity a hypersenzitivity.

Metabolismus 1C se skládá z metabolismu serinu-glycinu, folátového cyklu a methioninového cyklu a je ústředním prvkem několika procesů, včetně de novo syntézy purinů, vytváření methyldonorů a redoxní regulace (Yang a Vousden, 2016). Metabolismus 1C je silně zapojen do stimulace TCR (Tan et al., 2017) a je nutný k podpoře expanze T buněk (Ma et al., 2017). Folátový cyklus je rozdělen na cytosolické a mitochondriální složky. V cytosolu MTHFD1 vzájemně převádí 5,10-methylenTHF, 10-formylTHF a formiát. V mitochondriích jsou stejné reakce prováděny pomocí MTHFD2 a MTHFD1L. Tyto výsledné meziprodukty se používají k podpoře formylačních kroků v de novo syntéze purinů. MTHFD1 a MTHFD2 mohou také modulovat redoxní stav prostřednictvím generace NAD(H) a NADP(H) (Ducker a Rabinowitz, 2017). Ačkoli některé typy buněk vykazují flexibilitu při přepínání na cytosolický zdroj v podmínkách dysfunkce mitochondriální dráhy (Ducker et al., 2016), bylo dříve navrženo, aby T buňky závisely převážně na mitochondriální dráze, aby poskytovaly jednotky 1C a redukční druhy (Ron- Harel a kol., 2016). Ukázalo se také, že T buňky se spoléhají na vychytávání serinu a imunitní reakce in vivo mohou být modulovány množstvím serinu v potravě. Účinky serinového hladovění jsou zprostředkovány omezením biosyntézy purinů i v přítomnosti neporušených záchranných drah a lze je obejít poskytnutím glycinu a formiátu (Ma et al., 2017). Naše data k těmto zjištěním přispívají a poukazují na MTHFD2 jako na kritický regulátor, který ovlivňuje CD4^PlusProliferace a diferenciace T buněk.

Echanicoside

Ačkoli metabolismus 1C hraje v buněčném metabolismu širokou roli, zjistili jsme, že některé funkce byly odlišné pro vybrané podskupiny T buněk. Všechny lidské a myší T buňky proliferovaly v menší míře s deficitem MTHFD2, což ukazuje na sdílenou funkci pro MTHFD2 pro podporu růstu a dělení T buněk. Účinky deficitu MTHFD2 na diferenciaci T buněk a efektorovou funkci se však v každé testované podskupině lišily. Th1 buňky vykazovaly zhoršenou diferenciaci se sníženou indukcí T-bet a sníženou produkcí cytokinů. Th17 buňky také měly změněnou diferenciaci a sníženou produkci cytokinů. Ačkoli ROR t nebyl změněn, MTHFD2-deficientní Th17 buňky upregulovaly Treg buňky TF FoxP3 a získaly schopnost potlačit proliferaci aktivovaných CD8 plus T buněk. Buňky Treg vykazovaly zvýšenou diferenciaci za podmínek nízkého TGF-b. Nyní je dobře známo, že každá z těchto podskupin může mít odlišné metabolické požadavky (Bantug et al., 2018; Buck et al., 2015). Naše data ukazují, že MTHFD2 je také selektivně vyžadován pro buňky Teff a zároveň podporuje osud a funkci buněk Treg. Je pozoruhodné, že tyto výsledky se liší od nedostatků GLUT1, GLS nebo ASCT2, které zhoršují nebo mění diferenciaci buněk Teff, přičemž mají mírné účinky na přímou podporu diferenciace buněk Treg nebo transdiferenciaci Th17 na buňky Treg (Johnson et al., 2018; Macintyre et al. ., 2014; Nakaya a kol., 2014).

Zdá se, že tyto odlišné osudy T buněk jsou závislé na enzymatické aktivitě MTHFD2, protože účinky nedostatku MTHFD2 byly zachráněny formiátovými nebo purinovými nukleobázemi. Ačkoli jsme nezjistili žádný významný účinek změněné redoxní rovnováhy s nedostatkem MTHFD2, změna syntézy purinů de novo se zdá být kritická. Léčba MTHFD2i vedla ke snížení koncentrací purinů, zejména guaninu, a současně vyvolala akumulaci meziproduktů syntézy purinů GAR, SAICAR a AICAR. Tyto meziprodukty vyžadují formylaci pro další biosyntézu a účinky byly zachráněny, když byl do média přidán formiát metabolitu odvozený od MTHFD2-, což podporuje biochemický mechanismus cílený pro MTHFD2i. De novo syntéza nukleotidů pro podporu syntézy DNA a RNA je nezbytná pro proliferaci T buněk (Que' me' neur et al., 2003, 2004). Zdá se tedy, že součástí mechanismu, kterým MTHFD2i narušuje expanzi T buněk, je nedostatečná tvorba nukleotidů.

Flavonoid

Selhání při syntéze adekvátních nukleotidů může potlačit efektorové T buňky prostřednictvím mnoha mechanismů. AMPK a mTORC1 jsou hlavními hnacími silami metabolického přeprogramování s obecně protichůdnými rolemi v buňkách Teff a Treg (Bantug et al., 2018; Buck et al., 2015). Ukazujeme, že léčba MTHFD2i v T buňkách vedla k akutní akumulaci AICAR, metabolitu pozoruhodného jako analog adenosinu a aktivátor AMPK (Rae a Mairs, 2019; Su et al., 2019). Nebyl však žádný důkaz zvýšené aktivity AMPK ve vybraných časových bodech. To může odrážet další regulaci AMPK, ale AICAR může mít také účinky nezávislé na AMPK (Dembitz et al., 2019). mTORC1 je také citlivý na koncentrace purinů, protože snížená dostupnost guaninu potlačuje aktivitu aktivátoru mTORC1 Rheb (Emmanuel et al., 2017; Hoxhaj et al., 2017). Akumulace AICAR a snížení aktivity mTORC1 tak mohou přispívat ke zhoršené tvorbě Th1 a Th17 buněk ošetřených MTHFD2i a zvýšené tvorbě Treg buněk. Potlačení signalizace mTORC1 může také přispět k posunu v metabolickém programu od glykolýzy k mitochondriální respiraci a změně abundance metabolitu TCA v buňkách Th17 ošetřených MTHFD2i. Dráha mTORC1 hraje ústřední roli při podpoře anabolického metabolismu a může řídit akumulaci TF ATF4, což zase může indukovat expresi MTHFD2 (Ben-Sahra et al., 2016).

Metabolický tok je vázán na epigenetickou regulaci, protože metabolity přispívají k mnoha epigenetickým modifikacím (Sharma a Rando, 2017), včetně metabolismu 1C, aby se vytvořil univerzální donor methyl S-adenosyl methionin (SAM) pro metylaci proteinů a DNA. Experimenty se sledováním uhlíku v aktivovaných T buňkách však naznačují, že jednotky 1C odvozené z glukózového a exogenního serinu významně nepřispívají k methioninovému cyklu a methylaci (Ma et al., 2017). Metabolický tok může také ovlivnit methylační vzorce prostřednictvím změn v množství metabolitů TCA, včetně alfa-ketoglutarátu, fumarátu a sukcinátu. Konkrétně fumarát a sukcinát inhibují DNA a histondemethylázy (Su et al., 2016). V souladu s deplecí těchto metabolitů v buňkách Th17 ošetřených MTHFD2i byla H3K27me3 široce redukována napříč genomem a methylace DNA byla snížena specificky na proximálním promotoru Foxp3, což může přispívat k transdiferenciačnímu fenotypu. Fenotyp transdiferenciace buněk Th17 nebyl zachráněn suplementací formiátu, což naznačuje, že k regulaci FoxP3 pravděpodobně přispívají další dráhy, jako je aktivita jiných mechanismů snímání koncentrace nukleotidů

akteosid (verbaskosid)

Bylo také popsáno, že MTHFD2 hraje neenzymatické role, které mohou přispívat k prozánětlivým účinkům tohoto enzymu. V rakovinných buňkách může mít MTHFD2 jaderné funkce, které se lokalizují společně s místy replikace DNA, aby podpořily progresi buněčného cyklu (Gustafsson Sheppard et al., 2015). U myších kmenových buněk bylo ukázáno, že MTHFD2 moduluje opravu DNA, aby udržela genomovou stabilitu (Yue et al., 2020). U karcinomu ledvin bylo zjištěno, že MTHFD2 je zásadní pro metabolické přeprogramování prostřednictvím metylace mRNA (Green et al., 2019). Ačkoli se tyto role pro MTHFD2 vzájemně nevylučují s našimi zjištěními, schopnost formiátu zachránit mnoho fenotypů nedostatku MTHFD2 v T buňkách naznačuje, že enzymatická aktivita MTHFD2 je primární hnací silou proliferace a osudu T buněk.

MTHFD2 byl do značné míry považován za lékový cíl v protirakovinných podmínkách. Může být také slibným protizánětlivým cílem a nabízí méně nežádoucích účinků ve srovnání s aktuálně dostupnými antifoláty, vzhledem k nízké expresi ve většině dospělých tkání. Například jeden cíl MTX, DHFR, je exprimován extenzivně v dospělých tkáních (Nilsson et al., 2014). Proto může být MTX spojen s řadou nežádoucích účinků, včetně gastrointestinální toxicity. Mechanismus účinku MTX navíc zůstává špatně pochopen navzdory jeho rozsáhlé historii (Cronstein a Aune, 2020). Vysoce regulovaná exprese MTHFD2 a potenciál pro redundanci s cytosolickou cestou MTHFD1 může vést k selektivní závislosti specifických buněčných populací na MTHFD2. Naše zjištění identifikují MTHFD2 jako kritický metabolický kontrolní bod v CD4^PlusT buňky. Ačkoli existuje široké překrývání mezi biologií rakovinných buněk a biologií rychle proliferujících T buněk, zjistili jsme, že podskupiny CD4 plus T buněk vykazují další citlivost prostřednictvím modulace buněčné diferenciace a funkce. Je pravděpodobné, že zacílení MTHFD2 v terapiích rakoviny může omezit protinádorovou imunitu. Nicméně nastavení, jako je kolorektální karcinom, kde zánět zprostředkovaný Th17 buňkami přispívá k onemocnění, mohou být pro MTHFD2is velmi vhodné. Citlivost T buněk na MTHFD2is může být účinnou formou imunoterapie v nastaveních CD4^PlusZánět řízený T buňkami mimo rakovinu a vede k méně nežádoucím účinkům než v současnosti dostupná terapeutická činidla.

Omezení studia

MTHFD2i použitý v této studii má hodnotu IC50 0,0063 mM pro MTHFD2 a 0,57 mM pro MTHFD1; proto nelze vyloučit menší mimocílové účinky duální inhibice MTHFD2 a MTHFD1. Vzhledem k tomu, že aberantní upregulace FoxP3 v buňkách Th17 nebyla zachráněna poskytnutím formiátu, ale aktivita mTORC1 ano, mechanismus, který je základem tohoto fenotypu, vyžaduje další zkoumání. Kromě toho byly všechny modely in vivo provedeny s léčbou MTHFD2i nebo genetickou ablací od doby indukce onemocnění a fenotypování T buněk bylo provedeno v jediném časovém bodě. Aby se lépe charakterizoval účinek deficitu MTHFD2 na patogenezi onemocnění, další studie by měly zahrnovat experimenty s časovým průběhem se sériovou charakterizací populací T buněk, aby se definitivně určilo, zda jsou podskupiny CD4 plus T buněk ovlivněny odlišně in vivo. Konečně, aby se zlepšila relevance této studie pro klinické aplikace, měla by být testována účinnost léčby MTHFD2i zahájené po nástupu onemocnění.

STAR★METODY

Podrobné metody jsou uvedeny v online verzi tohoto dokumentu a zahrnují následující:

• TABULKA KLÍČOVÝCH ZDROJŮ

• DOSTUPNOST ZDROJŮ

• B Kontakt vedení

• B Dostupnost materiálů

• B Dostupnost dat a kódů

  
  

• EXPERIMENTÁLNÍ MODEL A PODROBNOSTI PŘEDMĚTU

• B Myši B Lidské T buňky

• B buněčné linie

  
  

• PODROBNOSTI METOD

• B In vitro myší CD4^PlusAktivace a diferenciace T buněk

• B Test suprese buněk Th17

• B Lidský CD4 in vitro^PlusPodmínky kultivace T buněk

• B Screening CRISPR B Metabolomika hmotnostní spektrometrie

• B Protonová nukleární magnetická rezonanční spektroskopie (1H-MRS)

• B Imunoblotting

• B CUT&RUN B Cílené sekvenování Bisulfitového sekvenování NextGen EpigenDx

• B In vivo EAE modely pro IHC a průtokovou cytometrii

• B In vivo ošetření LY345899 v modelu EAE

• B In vivo léčba DS18561882 v modelu DTH B In vivo model IBD s WT a CD4^ΔMthfd2sourozenci

• B In vivo model alergického onemocnění dýchacích cest s WT a CD4^ΔMthfd2sourozenci

• B In vivo ošetření DS18561882 v modelu imunizace OVA

  
  

• KVANTIFIKACE A STATISTICKÁ ANALÝZA

DOPLŇUJÍCÍ INFORMACE

Doplňující informace lze nalézt online na https://doi.org/10.1016/j. imunní.2021.10.011.

PODĚKOVÁNÍ

Děkujeme členům laboratoře Rathmell za přispění k tomuto projektu. Děkujeme Thomasu Auneovi za poskytnutí dat RNA-seq a J. Coolsovi (VIB) za poskytnutí konstruktu pMx-U6-gRNA-GFP. Děkujeme Maxu R. Van Belkumovi za navržení primerů MTHFD2 qPCR. Děkujeme Nello Mainolfifi, Vipin Suri, Adam Friedman a Mark Manfredi z Raze Therapeutics, Inc. (Boston, MA) za poskytnutí sloučeniny Raze 1459, která byla použita k potvrzení nálezů (data nejsou uvedena). Diagramy byly vytvořeny pomocí BioRender. Uznáváme sdílený zdroj Translational Pathology Shared Resource podporovaný grantem podpory NCI/NIH Cancer Center 5P30 CA68485-19 a grantem sdílené instrumentace S10 OD023475-01A1 pro Leica Bond RX. Tato práce byla podpořena cenou William E. Paul Distinguished Innovator Award pro Lupus Research Alliance (pro JCR), R01s DK105550 (pro JCR), HL136664 (pro JCR a DCN), CA217987 (pro JCR), AI153167 (pro JCR), AI137075 (do AKM), T32 DK101003 (KV) a T32 GM007347 (do AS).

AUTORSKÉ PŘÍSPĚVKY

AS, GA a JCR navrhly výzkum. AS, GA, KV, DRH, XX, MZM, XY, KLB, NC, MMW, ACY, DLG, AES, SKS, SNF, AMC, PF, TB a JCG-C. provedla výzkum. AS, GA, XY, JK, DCN, AKM, JDR a JCR analyzovaná data. AS a JCR napsal příspěvek s příspěvky ostatních autorů.

PROHLÁŠENÍ O ZÁJMECH

JCR je zakladatelem, členem vědeckého poradního výboru a akcionářem Sitryx Therapeutics; člen vědeckého poradního výboru a akcionář společnosti Caribou Biosciences; člen vědeckého poradního sboru NirogyTherapeutics; v posledních 3 letech konzultoval společnosti Merck, Pfizer a Mitobridge; a získal podporu výzkumu od Incyte Corp., CalitheraBiosciences a Tempest Therapeutics. JDR je spoluzakladatelem a akcionářem společností Raze Therapeutics, Toran, Serien Therapeutics a Farber Partners a poradcem a akcionářem společností Agios Pharmaceuticals, Kadmon Pharmaceuticals, Bantam Pharmaceuticals, Colorado Research Partners, RafaelHoldings, Barer Institute a LEAF Pharmaceuticals; obdržel honoráře za konzultace a financování výzkumu od společností Pfizer a Rafael a je vynálezcem patentů v držení Princetonské univerzity. AMC, PF a TB jsou zaměstnanci Sitryx Therapeutics.

INKLUZE A ROZMANITOST

Pracovali jsme na zajištění rovnováhy pohlaví při výběru jiných než lidských subjektů. Jeden nebo více autorů tohoto článku se identifikuje jako nedostatečně zastoupená etnická menšina ve vědě. Zatímco jsme citovali odkazy vědecky relevantní pro tuto práci, aktivně jsme také pracovali na podpoře genderové vyváženosti v našem referenčním seznamu. Seznam autorů tohoto příspěvku zahrnuje přispěvatele z místa, kde byl výzkum proveden, kteří se podíleli na sběru dat, návrhu, analýze a/nebo interpretaci díla.

REFERENCE

Anderson, GR, Winter, PS, Lin, KH, Nussbaum, DP, Cakir, M., Stein, EM, Soderquist, RS, Crawford, L., Leeds, JC, Newcomb, R., et al. (2017). Krajina terapeutické kooperativity u mutantních rakovin KRAS odhaluje principy řízení evoluce nádorů. Cell Rep. 20, 999–1015.

Aune, TM, Crooke, PS, 3., Patrick, AE, Tossberg, JT, Olsen, NJ, a Spurlock, CF, 3. (2017). Exprese dlouhých nekódujících RNA v autoimunitě a vazbě na funkci zesilovače a genetické varianty ohrožující autoimunitní onemocnění. J. Autoimmun. 81, 99-109.

Bantug, GR, Galluzzi, L., Kroemer, G. a Hess, C. (2018). Spektrum metabolismu T buněk ve zdraví a nemoci. Nat. Rev. Immunol. 18, 19–34. Ben-Sahra, I., Hoxhaj, G., Ricoult, SJH, Asara, JM a Manning, BD (2016). mTORC1 indukuje syntézu purinů prostřednictvím kontroly mitochondriálního tetrahydrofolátového cyklu. Science 351, 728–733.

Brown, PM, Pratt, AG, a Isaacs, JD (2016). Mechanismus účinku methotrexátu u revmatoidní artritidy a hledání biomarkerů. Nat. Rev. Rheumatol. 12, 731–742.

Buck, MD, O'Sullivan, D., a Pearce, EL (2015). Metabolismus T buněk řídí imunitu. J. Exp. Med. 212, 1345–1360.

Cantor, JR, Abu-Remaileh, M., Kanarek, N., Freinkman, E., Gao, X., Louissaint, A., Jr., Lewis, CA a Sabatini, DM (2017). Fyziologické médium obnovuje buněčný metabolismus a odhaluje kyselinu močovou jako endogenní inhibitor UMP syntázy. Cela 169, 258–272.e17.

Cronstein, BN a Aune, TM (2020). Methotrexát a jeho mechanismy účinku u zánětlivé artritidy. Nat. Rev. Rheumatol. 16, 145–154.

Dembitz, V., Tomic, B., Kodvanj, I., Simon, JA, Bedalov, A., and Visnjic, D. (2019). Ribonukleosid AICAr indukuje diferenciaci myeloidní leukémie aktivací ATR/Chkl prostřednictvím deplece pyrimidinu. J. Biol. Chem. 294, 15257–15270.

Dendrou, CA, Fugger, L. a Friese, MA (2015). Imunopatologie roztroušené sklerózy. Nat. Rev. Immunol. 15, 545–558.

Ducker, GS a Rabinowitz, JD (2017). Metabolismus jednoho uhlíku ve zdraví a nemoci. Cell Metab. 25, 27–42.

Ducker, GS, Chen, L., Morscher, RJ, Ghergurovich, JM, Esposito, M., Teng, X., Kang, Y., and Rabinowitz, JD (2016). Zvrat cytosolického toku jednoho uhlíku kompenzuje ztrátu mitochondriální folátové dráhy. Cell Metab. 23, 1140–1153.

Emmanuel, N., Ragunathan, S., Shan, Q., Wang, F., Giannakou, A., Huser, N., Jin, G., Myers, J., Abraham, RT a Unsal-Kacmaz, K (2017). Dostupnost purinového nukleotidu Reguluje aktivitu mTORC1 prostřednictvím Rheb GTPázy. Cell Rep. 19, 2665–2680.

Farber, S., Diamond, LK, Mercer, RD, Sylvester, RF a Wolff, JA (1948). Dočasné remise u akutní leukémie u dětí způsobené antagonistou kyseliny listové, 4-aminopteroyl-glutamovou kyselinou. N. Engl. J. Med. 238, 787-793.

Field, MS, Kamynina, E., Watkins, D., Rosenblatt, DS a Stover, PJ (2015). Nové pohledy na metabolické a nutriční determinanty těžké kombinované imunodeficience. Vzácné Dis. 3, e1112479.

Fuseini, H., Yung, JA, Cephus, JY, Zhang, J., Goleniewska, K., Polosukhin, VV, Peebles, RS, Jr., a Newcomb, DC (2018). Testosteron snižuje zánět dýchacích cest způsobený domácím prachem typu 2 a IL-17A. J. Immunol. 201, 1843–1854.

Govindaraju, V., Young, K. a Maudsley, AA (2000). Chemické posuny protonové NMR a vazebné konstanty pro mozkové metabolity. NMR Biomed. 13, 129–153.

Green, NH, Galvan, DL, Badal, SS, Chang, BH, LeBleu, VS, Long, J., Jonasch, E. a Danesh, FR (2019). MTHFD2 spojuje methylaci RNA s metabolickým přeprogramováním u karcinomu ledviny. Oncogene 38, 6211-6225.

Gustafsson, R., Jemth, A.-S., Gustafsson, NMS, F€ arnega˚rdh, K., Loseva, O., Wiita, E., Bonagas, N., Dahllund, L., Llona-Minguez, S., H€ aggblad, M., et al. (2017). Krystalová struktura cíle pro vznikající rakovinu MTHFD2 v komplexu s inhibitorem na bázi substrátu. Cancer Res. 77, 937-948.

Gustafsson Sheppard, N., Jarl, L., Mahadessian, D., Strittmatter, L., Schmidt, A., Madhusudan, N., Tegne´r, J., Lundberg, EK, Asplund, A., Jain, M a Nilsson, R. (2015). Enzym MTHFD2 spojený s folátem je jaderný protein a podporuje buněčnou proliferaci. Sci. Rep. 5, 15029.

Hoxhaj, G., Hughes-Hallett, J., Timson, RC, Ilagan, E., Yuan, M., Asara, JM, Ben-Sahra, I. a Manning, BD (2017). Signální síť mTORC1 snímá změny v hladinách buněčných purinových nukleotidů. Cell Rep. 21, 1331–1346.

Johnson, MO, Wolf, MM, Madden, MZ, Andrejeva, G., Sugiura, A., Contreras, DC, Maseda, D., Liberti, MV, Paz, K., Kishton, RJ, et al. (2018). Odlišná regulace diferenciace Th17 a Th1 buněk metabolismem závislým na glutamináze. Cela 175, 1780–1795.e19.

Ju, H.-Q., Lu, Y.-X., Chen, D.-L., Zuo, Z.-X., Liu, Z.-X., Wu, Q.-N., Mo, H.-Y., Wang, Z.-X., Wang, D.-S., Pu, H.-Y., a kol. (2019). Modulace redoxní homeostázy inhibicí MTHFD2 u kolorektálního karcinomu: Mechanismy a terapeutické důsledky. J. Natl. Cancer Inst. 111, 584–596.

Kawai, J., Toki, T., Ota, M., Inoue, H., Takata, Y., Asahi, T., Suzuki, M., Shimada, T., Ono, K., Suzuki, K., a kol. (2019). Objev silného, ​​selektivního a perorálně dostupného inhibitoru MTHFD2 (DS18561882) s protinádorovou aktivitou in vivo. J. Med. Chem. 62, 10204–10220.

Kim, J., Yang, G., Kim, Y., Kim, J. a Ha, J. (2016). Aktivátory AMPK: mechanismy účinku a fyziologické aktivity. Exp. Mol. Med. 48, e224.

Koufaris, C., Gallage, S., Yang, T., Lau, C.-H., Valbuena, GN, a Keun, HC (2016). Potlačení MTHFD2 v MCF-7 buňkách rakoviny prsu zvyšuje glykolýzu, závislost na exogenním glycinu a citlivost na vyčerpání folátů. J. Proteome Res. 15, 2618–2625.

Li, W., Xu, H., Xiao, T., Cong, L., Láska, MI, Zhang, F., Irizarry, RA, Liu, JS, Brown, M. a Liu, XS (2014). MAGECK umožňuje robustní identifikaci esenciálních genů z CRISPR/Cas9 knockout screenů na úrovni genomu. Genome Biol. 15, 554.

Ma, EH, Bantug, G., Griss, T., Condotta, S., Johnson, RM, Samborska, B., Mainolfifi, N., Suri, V., Guak, H., Balmer, ML, a kol. (2017). Serin je nezbytný metabolit pro expanzi efektorových T buněk. Cell Metab. 25, 345–357.

Macintyre, AN, Gerriets, VA, Nichols, AG, Michálek, RD, Rudolph, MC, Deoliveira, D., Anderson, SM, Abel, DE, Chen, BJ, Hale, LP, a kol. (2014). Glukózový transportér Glut1 je selektivně nezbytný pro aktivaci CD4 T buněk a funkci efektoru. Cell Metab. 20, 61–72.

Michálek, RD, Gerriets, VA, Jacobs, SR, Macintyre, AN, MacIver, NJ, Mason, EF, Sullivan, SA, Nichols, AG a Rathmell, JC (2011). Špičkové: odlišné glykolytické a lipidové oxidativní metabolické programy jsou nezbytné pro efektorové a regulační podskupiny CD4 plus T buněk. J. Immunol. 186, 3299-3303.

Nakaya, M., Xiao, Y., Zhou, X., Chang, J.-H., Chang, M., Cheng, X., Blonska, M., Lin, X., and Sun, S.-C . (2014). Zánětlivé reakce T buněk se spoléhají na aminokyselinový transportér ASCT2, který usnadňuje vychytávání glutaminu a aktivaci kinázy mTORC1. Imunita 40, 692–705.

Nilsson, R., Jain, M., Madhusudhan, N., Sheppard, NG, Strittmatter, L., Kampf, C., Huang, J., Asplund, A., and Mootha, VK (2014). Exprese metabolických enzymů zdůrazňuje klíčovou roli MTHFD2 a mitochondriální folátové dráhy u rakoviny. Nat. Commun. 5, 3128.

Palmer, LD, Maloney, KN, Boyd, KL, Goleniewska, AK, Toki, S., Maxwell, CN, Chazin, WJ, Peebles, RS, Jr., Newcomb, DC a Skaar, EP (2019). Innate Immune Protein S100A9 chrání před alergickým zánětem dýchacích cest zprostředkovaným 2-pomocnými buňkami typu T. Dopoledne. J. Respir. Cell Mol. Biol. 61, 459–468.

Pikman, Y., Puissant, A., Alexe, G., Furman, A., Chen, LM, Frumm, SM, Ross, L., Fenouille, N., Bassil, CF, Lewis, CA, a kol. (2016). Zacílení na MTHFD2 u akutní myeloidní leukémie. J. Exp. Med. 213, 1285–1306.

Que'me' neur, L., Gerland, L.-M., Flacher, M., Ffrench, M., Revillard, J.-P., and Genestier, L. (2003). Diferenciální kontrola buněčného cyklu, proliferace a přežití primárních T lymfocytů purinovými a pyrimidinovými nukleotidy. J. Immunol. 170, 4986–4995.

Que' me' neur, L., Beloeil, L., Michallet, M.-C., Angelov, G., Tomkowiak, M., Revillard, J.-P., and Marvel, J. (2004). Omezení de novo biosyntézy nukleotidů interferuje s klonální expanzí a diferenciací na efektorové a paměťové CD8 T buňky. J. Immunol. 173, 4945–4952.

Rae, C. a Mairs, RJ (2019). Aktivace AMPK pomocí AICAR senzibilizuje buňky rakoviny prostaty k radioterapii. Oncotarget 10, 749–759.

Ron-Harel, N., Santos, D., Ghergurovich, JM, Sage, PT, Reddy, A., Lovitch, SB, Dephoure, N., Satterstrom, FK, Sheffer, M., Spinelli, JB, et al. (2016). Mitochondriální biogeneze a remodelace proteomu podporují metabolismus jednoho uhlíku pro aktivaci T buněk. Cell Metab. 24, 104–117.

Shahi, SK, Freedman, SN, Murra, AC, Zarei, K., Sompallae, R., Gibson Corley, KN, Karandikar, NJ, Murray, JA a Mangalam, AK (2019). Prevotella histicola, komensál lidského střeva, je stejně účinný jako COPAXONE ve zvířecím modelu roztroušené sklerózy. Přední. Immunol. 10, 462.

Shalem, O., Sanjana, NE, Hartenian, E., Shi, X., Scott, DA, Mikkelson, T., Heckl, D., Ebert, BL, Root, DE, Doench, JG a Zhang, F. (2014). Knokautový screening CRISPR-Cas9 na úrovni genomu v lidských buňkách. Science 343, 84–87.

Sharma, U., and Rando, OJ (2017). Metabolické vstupy do epigenomu. Cell Metab. 25, 544–558.

Shi, LZ, Wang, R., Huang, G., Vogel, P., Neale, G., Green, DR, and Chi, H. (2011). Glylytická dráha závislá na HIF1alfa organizuje metabolický kontrolní bod pro diferenciaci T H17 a Treg buněk. J. Exp. Med. 208, 1367–1376.

Shin, M., Momb, J., and Appling, DR (2017). Lidská mitochondriální MTHFD2 je duální redoxní kofaktor-specifická methylentetrahydrofolátdehydrogenáza/methyltetrahydrofolátcyklohydroláza. Rakovina Metab. 5, 11.

Skene, PJ a Henikoff, S. (2017). Účinná strategie cílené nukleázy pro mapování vazebných míst DNA s vysokým rozlišením. eLife 6, e21856.

Su, C.-C., Hsieh, K.-L., Liu, P.-L., Yeh, H.-C., Huang, S.-P., Fang, S.-H., Cheng, W.-C., Huang, K.-H., Chiu, F.-Y., Lin, I.-L., a kol. (2019). AICAR indukuje apoptózu a inhibuje migraci a invazi v buňkách rakoviny prostaty prostřednictvím dráhy závislé na AMPK/mTOR. Int. J. Mol. Sci. 20, 1647.

Su, X., Wellen, KE a Rabinowitz, JD (2016). Metabolická kontrola metylace a acetylace. Curr. Opin. Chem. Biol. 30, 52–60.

Tan, H., Yang, K., Li, Y., Shaw, TI, Wang, Y., Blanco, DB, Wang, X., Cho, J.-H., Wang, H., Rankin, S. , a kol. (2017). Integrativní profilování proteomiky a fosfoproteomiky odhaluje dynamické signální sítě a cesty bioenergetiky, které jsou základem aktivace T buněk. Imunita 46, 488–503.

Toffalini, F., Kallin, A., Vandenberghe, P., Pierre, P., Michaux, L., Cools, J., and Demoulin, J.-B. (2009). Fúzní proteiny TEL-PDGFR a FIP1L1-PDGFR unikají ubikvitinaci a degradaci. Haematologica 94, 1085–1093.

Wan, X., Wang, C., Huang, Z., Zhou, D., Xiang, S., Qi, Q., Chen, X., Arbely, E., Liu, C.-Y., Du, P. a Yu, W. (2020). Cisplatina inhibuje SIRT3-deacetylaci MTHFD2, aby narušila buněčnou redoxní rovnováhu v buňce kolorektálního karcinomu. Cell Death Dis. 11, 649.

Wang, L., Xing, X., Chen, L., Yang, L., Su, X., Rabitz, H., Lu, W., and Rabinowitz, JD (2019). Špičkový anotační a ověřovací engine pro necílenou LC-MS metabolomiku. Anální. Chem. 91, 1838–1846.

Yang, M. a Vousden, KH (2016). Metabolismus serinu a jednoho uhlíku u rakoviny. Nat. Rev. Rak 16, 650–662.

Yue, L., Pei, Y., Zhong, L., Yang, H., Wang, Y., Zhang, W., Chen, N., Zhu, Q., Gao, J., Zhi, M., a kol. (2020). Mthfd2 moduluje mitochondriální funkci a opravu DNA pro udržení pluripotence myších kmenových buněk. Zprávy o kmenových buňkách 15, 529–545.

Zhu, Z. a Leung, GKK (2020). Více než jen metabolický enzym: MTHFD2 jako nový cíl pro protirakovinnou terapii? Přední. Oncol. 10, 658.

STAR★METODY

TABULKA KLÍČOVÝCH ZDROJŮ

DOSTUPNOST ZDROJŮ

Vedoucí kontakt

Další informace a požadavky na zdroje a činidla by měly být zaslány a budou splněny po dokončení příslušného MTA vedoucím kontaktem, Dr. Jeffrey Rathmellem (jeff.rathmell@vumc.org).

Dostupnost materiálů

Plazmidy a myší linie generované v této studii budou na vyžádání k dispozici po dokončení příslušné MTA.

Dostupnost dat a kódů

Sekvenační data CUT&RUN byla uložena v GEO a jsou veřejně dostupná k datu publikace (GSE180356). Mikroskopická data a původní snímky western blot uvedené v tomto dokumentu budou na vyžádání sdíleny vedoucím kontaktem. Jakékoli další informace potřebné k opětovné analýze údajů uvedených v tomto dokumentu jsou na vyžádání k dispozici u hlavního kontaktu.

Pro imunitu klikněte na Cistanches