Mortalinem/glukózou regulovaný protein 75 podporuje odolnost vůči cisplatině u rakoviny žaludku
Jul 25, 2022
Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací
Abstraktní
Léčba platinou je jednou z nejvíce převažujících chemoterapeutických strategií u pacientů s karcinomem žaludku (GC). Terapeutický účinek je však méně než uspokojivý, z velké části kvůli získané rezistenci k platinovým lékům. Proto lepší pochopení základních mechanismů může výrazně zlepšit terapeutickou účinnost GC. V této studii jsme se zaměřili na zkoumání funkcí/mechanismů souvisejících s chemorezistencí a klinický význam glukózou regulovaného proteinu 75 (GRP75) v GC. Zde naše data ukázala, že ve srovnání s buňkami SGC7901 byla exprese GRP75 výrazně vyšší v rezistenci na cisplatinu (buňky (SGC7901 *). Knockdown GRP75 zrušil udržování mitochondriálního membránového potenciálu (MP) a inhiboval jaderný faktor erytroidní{{{ 10}}příbuzný faktor 2 (NRF2), fosfatidylinositol 3 kináza/protein kináza B (Pl3K/AKT), hypoxií indukovatelný faktor 1a (HIF-1a) a c-myc, což vedlo k zablokování aktivace jejich následné cíle. Tyto procesy zeslabily antioxidační/apoptózové schopnosti a změnily metabolické přeprogramování v buňkách SGC7901, což vedlo k opětovné senzibilizaci těchto buněk na cisplatinu. Nadměrná exprese GRP75 v buňkách SGC7901 však způsobila opačné účinky. Model xenograftů potvrdily výše uvedené výsledky.U pacientů s GC, kteří dostávali platinovou chemoterapii a metaanalýzu, byla vysoká hladina GRP75 pozitivně spojena s agresivními charakteristikami a špatnou prognózou, včetně, ale bez omezení na gastr. rakoviny tlustého střeva a byl nezávislým prediktorem celkového přežití. Souhrnně naše studie ukázala, že GRP75 se podílel na rezistenci GC na cisplatinu a že GRP75 by mohl být potenciálním terapeutickým cílem pro obnovení lékové odpovědi v buňkách rezistentních na platinu a užitečným aditivním prognostickým nástrojem při vedení klinického řízení pacientů s GC.
Úvod
Rakovina žaludku (GC) byla první nejčastější incidencí a druhou nejčastější úmrtností na rakovinu trávicího systému v Číně. Současnou léčbou pokročilého GC byla chirurgická operace kombinovaná se systémovou chemoterapií, ale míra dlouhodobého přežití byla méně než uspokojivá kvůli vysoké pooperační recidivě2. V klinické praxi byly platinové léky jedním z léků první volby pro pokročilé GC chemoterapie 3. Získaná rezistence na léky se však vždy objevila po několika cyklech léčby na bázi platiny a ukazuje na špatnou prognózu.cistanchProto bylo naléhavě nezbytné osvětlit potenciální mechanismy a identifikovat nové terapeutické strategie k překonání rezistence vůči platinovým lékům u pacientů s GC.
Cistanche může proti stárnutí
Glukózou regulovaný protein 75 (GRP75) byl stresem indukovatelný molekulární chaperon, který patřil do rodiny proteinů tepelného šoku4. Nadměrná exprese GRP75 byla úzce spojena s progresí nádoru u různých lidských rakovin5-7. Zde jsme prostřednictvím zkoumání metaanalýzy zjistili, že vysoká hladina GRP75 naznačuje významně špatnou prognózu u několika rakovin trávicího systému (kolorektální karcinom, cholangiokarcinom a rakovina slinivky břišní). Co se týče lékové rezistence, inhibice GRP75 zvrátila rezistenci na cisplatinu a doxorubicin u hepatocelulárního karcinomu a rakoviny vaječníků. pozitivní nádory měly horší prognózu ve srovnání s GRP75 negativními nádory v GC s normální funkcí p53. Nicméně p53 byl jedním z nejčastěji mutovaných genů v GC (postihující více než 50 procent pacientů)l2-15. Proto jsme předpokládali že kromě klasické represe aktivity p53 by se GRP75 mohl podílet na indukci/udržování odolnosti vůči platinovým lékům v GC pomocí a{24}}nezávislého způsobu.
V této studii přispěla vyšší exprese GRP75 k rezistenci na cisplatinu v buňkách SGC7901 a v modelu xenograftů. Mechanicky GRP75 indukoval/udržoval rezistenci na cisplatinu prostřednictvím regulace antioxidačních/apoptotických schopností a vlastností metabolického přeprogramování.cistanche AustrálieU pacientů s GC přispěla nadměrná exprese GRP75 k agresivním charakteristikám a špatné prognóze. Naše výsledky ukázaly, že GRP75 podporoval rezistenci na cisplatinu v GC a mohl by být biomarkerem pro predikci odpovědi na léčbu platinou.cistanche výhodyZacílení na GRP75 může poskytnout nové chápání systémové chemoterapie GC.
Výsledek
Účinky GRP75 na rezistenci na cisplatinu v testech životaschopnosti GC buněk byly použity k ověření rezistence buněk SGC7901~, Ipsos (uM) cisplatiny pro buňky SGC7901 a SGC7901CR byly: 5,518 vs. 72,46 (obr. Na základě databází KM-Plotter zvýšená exprese GRP75 indikovala špatnou prognózu (obr. 1B). Navíc výrazně zvýšená exprese GRP75 v buňkách SGC7901CR ve srovnání s jeho rodičovskými buňkami SGC7901 (obr. 1C), což naznačuje, že GRP75 by mohl přispívat k rezistenci na cisplatinu. K ověření této hypotézy byly buňky SGC7901~ transfekovány scramble- nebo GRP75 siRNA a hodnoty IC50 (uM) cisplatiny pro buňky SGC7901CK transfekované scrambled- nebo GRP75 siRNA byly: 50,83 vs. 20.86, v tomto pořadí (obr. 1D). V porovnání,
nadměrná exprese GRP75 transfekcí plasmidů GRP75 do buněk SGC7901 ukázala, že IC50 cisplatiny pro buňky SGC7901 transfekované plasmidy GRP75 byly 3,825 vs. 6,98 (obr. 1E). Souhrnně tyto výsledky odhalily, že GRP75 hrál zásadní roli při udržování/vyvolávání rezistence na cisplatinu u GC, ale mechanismy zůstaly dalším zkoumáním.
Potenciální mechanismy, které jsou základem GRP75, způsobily rezistenci na cisplatinu
Stáhli jsme mikročipové datové sady GSE122130 (SGC7901CR vs. SGC7901) a GSE14209 (tkáně, rezistentní na cisplatinu vs. citlivé na cisplatinu) z GEO, poté jsme provedli GO-Biological proces a KEGG-Pathway obohacení a na základě analýzy obohacení KEGG-DAV10 výsledky jsou uvedeny na obr. 2A-D. Základní rozdíly biologických procesů mezi buňkami SGC7901C* a buňkami SGC7901 zahrnovaly oxidaci-redukce, apoptotický proces (obr. 2A), analýza obohacení KEGG-Pathway zjistila, že soubory DEGs úzce korelovaly s metabolickými cestami, a fosfatidylinositol 3 kináza/protein kináza B (PI3K/AKT) dráha (obr. 2B). Odezva na lék byla zahrnuta do podstatných rozdílů biologických procesů mezi nádorovými tkáněmi rezistentními na cisplatinu a citlivými na cisplatinu a metabolická dráha byla také základním článkem v analýze obohacení KEGG-Pathway (obr. 2C, D). Kromě toho byla pomocí databáze String zkonstruována síť 60 proteinů, které významně interagovaly s GRP75, a poté analýza KEGG-Pathway ukázala, že metabolické dráhy hrají důležitou roli mezi GRP75 a jeho interaktory (obr. 2E). Na základě těchto výsledků jsme předpokládali, že antioxidace/apoptóza a metabolické přeprogramování mohou podporovat přežití a růst GC, což vede k rezistenci na cisplatinu. Mechanismy účasti GRP75 na regulaci však vyžadovaly další studium (obr. 2F).
Účinky GRP75 na antioxidační a antiapoptózu Zde byla intracelulární hladina ROS v buňkách SGC7901CR zvýšená ve srovnání s jeho rodičovskými protějšky (obr. 3A), což naznačuje, že buňky SGC7901Ck byly vystaveny relativně vyšším podmínkám oxidačního stresu. Předchozí studie odhalila, že GRP75 se podílel na stabilizaci MMP, důležitého zdroje tvorby ROS. Zde knockdown GRP75 zrušil udržování MMP v buňkách SGC7901CK indukované cisplatinou a nadměrná exprese GRP75 měla opačný účinek v buňkách SGC7901 (obr. 3B).cistanche cholesterolPoté jsme potvrdili vztah mezi GRP75 a antioxidací a antiapoptózou. Jak je znázorněno na obr. 3C, knockdown GRP75 snížil hladinu jaderného faktoru erytroidního-2-faktoru 2 (NRF2) a jeho downstream cílových genů (HO-1 a NQO-1) v SGC7901 ~ buněk a nadměrná exprese GRP75 vykazovala opačný účinek v buňkách SGC7901. Kromě toho knockdown GRP75 nebo NRF2 v buňkách SGC7901CR dále zvýšil intracelulární generace ROS, apoptózu (obr. 3D) a kaspázové -3 aktivity (doplňkový obr. S1) indukované cisplatinou. Naproti tomu nadměrná exprese GRP75 v buňkách SGC7901 významně zeslabila generace ROS indukované cisplatinou, buněčnou apoptózu (obr. 3E) a aktivity kaspázy -3 (doplňkový obrázek S1). Tyto výsledky odhalily, že GRP75 udržovaná/indukovaná rezistence na cisplatinu může být způsobena indukcí antioxidace a antiapoptózy v GC buňkách.
Účinky GRP75 na metabolické přeprogramování Dále jsme dále zkoumali, kdy GRP75 indukoval změnu metabolického přeprogramování. Stále více důkazů ukázalo, že metabolismus nádorových buněk nebyl abnormální změnou jedné metabolické dráhy, ale přeprogramováním celé buněčné metabolické sítě17. Mnoho klasických onkogenů nebo signálních drah bylo přímo či nepřímo zapojeno do metabolického přeprogramování, jako je PI3K/AKT, hypoxií indukovatelný faktor la (HIF-la), c-myc atd.“'819. Proto jsme ověřili, zda byl GRP75 podílí se na metabolickém přeprogramování GC buněk. Jak je znázorněno na obr. 4A, pozorovali jsme zvýšené hladiny p-AKT, HIF-la a c-myc v buňkách SGC7901CR ve srovnání s jeho rodičovskými buňkami SGC7901. Navíc v buňkách SGC7901CR došlo ke snížení GRP75 snížil cisplatinou indukované hladiny p-AKT, HIF-la a c-Myc proteinů a jejich downstream cíle související s glykolýzou (HK2: hexokináza 2; PDK1: pyruvátdehydrogenáza kináza 1; a LDHA: řetězec laktátdehydrogenázy A). Naopak nadměrná exprese GRP75 v buňkách SGC7901 vykazovala opačný účinek (obr. 4B, C). Dále, knockdown GRP75 nebo AKT v buňkách SGC7901CR ukázal významný pokles vychytávání glukózy a životaschopnosti/růstu buněk vyvolané cisplatinou; zvýšená exprese GRP75 v buňkách SGC7901 výrazně zvýšila schopnost vychytávání glukózy a životaschopnost/růst buněk způsobenou cisplatinou (obr. 4D-F). Souhrnně tato data naznačovala, že GRP75 udržovaná/indukovaná rezistence na cisplatinu v GC buňkách může být prostřednictvím účasti na metabolickém přeprogramování zprostředkovaném p-AKT, HIF-la a c-myc.
Potvrzení in vitro dat v modelu xenoimplantátu [0072] Poté jsme zkoumali potenciální klinickou relevanci GRP75 in vivo. Údaje o xenoimplantátech ukázaly, že léčba samotnou cisplatinou nebo knockdown samotného GRP75 může inhibovat růst nádoru; avšak léčba cisplatinou kombinovaná s knockdown GRP75 významně usnadnila cisplatinou indukovanou inhibici růstu nádoru (obr. 5A). Kromě toho testy IHC a qPCR ukázaly, že cisplatina plus GRP75 siRNA významně snížila expresi Ki67, GRP75, NRF2, p-AKT a downstream cílů ve srovnání s léčbou samotnou cisplatinou, ale zvýšila apoptózu (jak bylo stanoveno barvením TUNEL, obr. 5B , C). Souhrnně tyto výsledky ukázaly, že prostřednictvím regulace antioxidačních/antiapoptózových schopností a metabolického přeprogramování stimuloval GRP75 in vivo přežití a růst, což následně vedlo k rezistenci GC na cisplatinu.
Identifikace GRP75 jako charakteristického faktoru podporujícího rakovinu a klinický význam GRP75 v GC
Poté jsme hodnotili expresi GRP75 v po sobě jdoucích řezech vzorků GC. Jak je znázorněno na obr. 6A, ve srovnání se sousedními nenádorovými žaludečními tkáněmi bylo v tkáních GC pozorováno značné zvýšení exprese GRP75. Nadměrná exprese GRP75 byla prokázána v tkáních GC pomocí skóre intenzity IHC (obr. 6B). Silnější barvení na GRP75 bylo také pozorováno se zvyšující se TNM klasifikací stadia maligních nádorů (obr. 6C, D). Potom jsme těchto 116 GC vzorků rozdělili do dvou skupin („GRP75 nízká“ vs. GRP75 vysoká, podle IHC-intenzity, obr. 6E). Příčné průměry nádorů ve skupině „GRP75 high" byly významně větší než ty ve skupině „GRP75 low" (obr. 6F). Dále jsme potvrdili klinickou prognózu GRP75 u GC. Kaplan-Meierova analýza přežití také ukázala, že pacienti s GC ve skupině „GRP75 high" měli horší celkové přežití než pacienti ve skupině „GRP75 low" (obr. 6G).
Multivariační analýza zjistila, že GRP75 byl nezávislým prediktorem celkového přežití (tabulka 1).vedlejší účinky cistanche deserticola,V souhrnu tyto výsledky naznačují, že GRP75 měl charakteristickou roli ve vedoucí progresi GC, rezistenci na cisplatinu a špatné prognóze. Metaanalýza vysoké hladiny GRP75 s prognózou Vývojový diagram vyhledávání a výběru literatury a metaanalýza byly uvedeny na doplňkovém obrázku S2. K výpočtu a analýze hodnoty HR byly použity model náhodného účinku a model fixního účinku, oba ukázaly, že vysoké hladiny GRP75 jsou významně spojeny se špatnými výsledky pacientů. Sdružená HR byla 1,91 (95 procent CI 1,62 až 2,25), s heterogenitou (I'=0.0 procent ,p =0,559) (obr. 7A). Poté jsme provedli analýzu podskupin, která ukázala, že hladina exprese GRP75 u gastrointestinálního karcinomu (sdružená HR byla 1,99,95 procenta CI 1,64 až 2,43) má významný vztah se špatnou prognózou přežití. Podobné výsledky byly jistě také nalezeny u jiných nádorů (sdružená HR byla 1,74,95 procenta CI 1,29 až 2,33) (obr. 7B). Oba
Beggův nálevkový graf a Eggerův test byly použity k posouzení možného publikačního zkreslení zahrnutých studií. V analýze asociace mezi GRP75 a OS byla p-hodnota Beggova testu a Eggerova testu 0.076 a 0,024, v tomto pořadí (obr. 7C a D). Eggerův test má však vyšší senzitivitu při hodnocení publikační zaujatosti. Proto byla použita metoda trim and fill, aby byly naše výsledky věrohodnější. Jak je znázorněno na obr. 7E, upravená HR v modelu s pevným efektem byla 1,785 (95 procent CI 1,530 až 2,081, p<0.001), and="" in="" the="" random="" effect="" model="" was="" 1.792="" (95%="" ci="" 1.515="" to=""><0.001), which="" was="" not="" significantly="" different="" from="" overall="" hr.="" in="" our="" analysis,="" a="" high="" level="" of="" grp75="" showed="" a="" poor="" prognosis="" including="" but="" not="" limited="" to="" gastrointestinal="" cancer,="" which="" was="" highly="" consistent="" with="" our="">
Diskuse
V této studii jsme použili jedno z chemoterapeutik první linie pro pacienty s GC, platinové léky. Klasicky by se platinové léky mohly kovalentně vázat na guanin na řetězci DNA a blokovat tak replikaci a transkripci DNA2. Avšak kvůli lékové rezistenci a nežádoucím vedlejším účinkům bylo naléhavě nezbytné identifikovat nové terapeutické strategie pro zvrácení rezistence u pacientů s GC. Kromě toho se u pacientů s GC vyvinula léková rezistence po podání několika cyklů cisplatiny a naše výsledky ukázaly, že buňky SGC7901® vykazovaly významnou rezistenci vůči cisplatině ve srovnání s buňkami SGC7901.
GRP75 (mortalin/mot-2/HSPA9) sehrál klíčovou roli při regulaci iniciace a progrese rakoviny u lidí-7. Nedávno se ukázalo, že GRP75 má také kritickou roli v rezistenci na chemoterapii. „Kromě GRP75 hrály kritickou roli v rezistenci na cisplatinu další proteiny tepelného šoku prostřednictvím PI3K/AKT/NF-KB a dalších cest21-24 Molekulární mechanismus rezistence na GRP75 a cisplatinu byl však popsán jen zřídka. Zde naše studie odhalila, že GRP75 podporoval antioxidační/apoptózní schopnosti a změnil metabolické přeprogramování, což vedlo k rezistenci na cisplatinu v GC buňkách. Také jsme zjistili, že GRP75 byl upregulován v SGC7901~ buněk a ve vzorcích tkání od pacientů a korelovala s lékovou rezistencí, přežitím, růstem a špatnými výsledky. Mezitím multivariační analýza zjistila, že GRP75 je nezávislým prediktorem celkového přežití. Kromě toho metaanalýza ukázala, že vysoká hladina GRP75 ukázala špatnou prognózu včetně, ale bez omezení na GC, což bylo vysoce konzistentní s naším výzkumem. Všechny výše uvedené výsledky potvrdily, že cílení na GRP75 by mohlo lze očekávat, že se stane novým přístupem ke zvrácení rezistence na cisplatinu a zlepšení prognózy pacientů s GC.
Za fyziologických podmínek byly buňky nevyhnutelně vystaveny ROS z vnějších faktorů a intracelulárního aerobního metabolismu. Jako dvousečný meč byly vhodné ROS důležité signální molekuly, které regulují normální funkci buněk, zatímco nadměrné ROS vedly k apoptóze. Proto v těle existoval přesný antioxidační regulační systém pro udržení redoxní rovnováhy a apoptotických procedur 20. Na rozdíl od fyziologických podmínek však byly hladiny ROS nádorů obecně významně vyšší než u normálních kontrol stejného tkáňového původu, což určovalo existenci speciálního antioxidační systém v nádorových buňkách, zejména u nádorových buněk rezistentních na léky27-29. Naše výsledky potvrdily, že buňky SGC7901CR vykazovaly relativně vyšší hladinu ROS ve srovnání s buňkami SGC7901 a že GRP75 zvýšil kapacity antioxidace/apoptózy. Nádorové buňky měly dlouhou historii metabolických abnormalit. Již ve 30. letech 20. století Otto Warburg zjistil, že nádorové buňky preferují glykolýzu. Dokonce i za podmínek s dostatkem kyslíku si nádorové buňky stále udržovaly vysokou rychlost glykolýzy pro tvorbu ATP. Tento abnormální metabolický vzorec byl nazván „Warburgův efekt“3031. Metabolické změny vedené Warburgovým efektem byly nedávno označovány jako metabolické přeprogramování a studie těchto změn poskytly hlubší pochopení metabolismu GC buněk. Bylo prokázáno, že GC buňky a normální buňky vykazovaly metabolické rozdíly nejen v metabolismu glukózy, ale také v metabolismu lipidů a aminokyselin³2-35. V tomto výzkumu jsme zjistili, že změny v metabolismu glukózy byly jedním z klíčových spojuje udržování buněčného růstu, což případně vede k rezistenci na GC cisplatinu.
Jak jsme zmínili, klasické onkogeny a signální dráhy jako PI3K/AKT, HIF-la a c-myc byly přímo či nepřímo zapojeny do metabolického přeprogramování. Aktivace dráhy PI3K/AKT v nádorových buňkách zvýšila mnoho metabolických aktivit. Za prvé, umožnilo buňkám vstřebávat glukózu, aminokyseliny a další živiny. Za druhé, AKT zvýšila glykolýzu a produkci laktátu prostřednictvím svých účinků na genovou expresi a aktivitu enzymů a byla dostatečná k vyvolání War-burgova efektu v rakovinných buňkách. Za třetí, aktivace této cesty zvýšila biosyntézu makromolekul a stimulovala expresi lipogenních genů a syntézu lipidů'7. Kromě toho GRP75-aktivované AKT a proteinkinázy 1 a 2 regulované extracelulárním signálem inhibovaly Baxovy konformační změny a apoptózu 8. Nádorové buňky se adaptovaly na hypoxii zahrnující metabolické přeprogramování prostřednictvím upregulace cílových genů HIF-la, aby stimulovaly vychytávání glukózy, glykolýzu, produkce a sekrece kyseliny mléčné, ukládání glykogenu, katabolismus glutaminu³ a podpora akumulace triglyceridů v kapičkách lipidů³. Nedávno se ukázalo, že GRP75 se může specificky vázat na HIF-la a cílit na vnější mitochondriální membránu, spojenou s VDAC1 a HK2, které zabránily apoptóze'. C-myc mohl zprostředkovat metabolické přeprogramování mnoha způsoby a metabolické přeprogramování zprostředkované c-myc bylo z velké části dosaženo ovlivněním mitochondrií. Na jedné straně c-myc také podporoval glykolýzu přímou regulací exprese glykolytických enzymů, včetně LDHA, HK2 a PDK11938. Na druhé straně c-myc aktivované enzymy zapojené do metabolismu glutaminu prostřednictvím transkripce podporovaly využití glutaminu mitochondriemi v nádorových buňkách. Tento efekt se nazývá „glutaminolýza“. Navíc nadměrná exprese GRP75-snížila cyklin-B1 a upregulovala cyklin-D1 a c-myc, aby podpořil růst buněk rakoviny vaječníků*. Na základě našich současných výsledků jsme poskytli nové chápání rezistence GC cisplatiny prostřednictvím GRP75 jako potenciálně důležitého článku v regulaci sítí metabolického přeprogramování nádorů.
Závěry
Závěrem jsme prokázali, že nadměrná exprese GRP75 by mohla podporovat přežití/růst v GC buňkách regulací sítí antioxidace/apoptózy a metabolického přeprogramování, a tím indukovat rezistenci na cisplatinu
Materiály a metody
Buňky, činidla a kultivační podmínky
GC cell lines, SGC7901 cells (mutant-type of p53), and cisplatin-resistance cells (SGC7901CB) were obtained from and STR identified by KeyGENE Bio Co. Ltd (Nanjing, China). Cisplatin(Pt(NH3)2Clz, >99.0 procent čistota), byl zakoupen od Sigma-Aldrich (Shanghai, Čína). Buňky byly kultivovány v médiu RPMI-1640 (Gibco, Grand Island, NY, USA), doplněném 10 procenty fetálního hovězího séra (FBS), 100 U/ml penicilinu, 100 ug/ml streptomycinu (Gibco) a inkubovány v 5 procentech CO2 při 37 stupních. Pro udržení fenotypu rezistence na cisplatinu byly buňky SGC7901CR inkubovány v médiu obsahujícím cisplatinu （5μM）.
Xenoimplantáty a léčba
Tato studie byla schválena Institucionálním výborem pro péči a použití zvířat na lékařské univerzitě Nanjing a se zvířaty bylo zacházeno humánně as ohledem na zmírnění utrpení. Nahé myši BALB/c byly získány z SLRC Laboratory Animal Center (Shanghai, Čína) a konvenčně chovány, jak jsme popsali dříve*1. Pro xenograftovou studii byly 2x10 stupňů SGC7901CK buňky ve 100 ul matrigelu injikovány subkutánně do boků myší po dobu 5 týdnů. Abychom určili účinky GRP75 na rezistenci GC na cisplatinu, provedli jsme intratumorální a intraperitoneální injekční test. Stručně, myši byly náhodně rozděleny do 4 skupin (5 myší na skupinu): (1)MOCK, (2)GRP75KD, (3)MOCK＋cisplatina, a（4）GRP75KD＋cisplatina. 100 ul siRNA （si-Con nebo si-GRP75, 100 nM) byly intratumorální injekce každé 3 dny. Skupinám podrobeným terapii cisplatinou (5 mg/kg) byly podávány intraperitoneální injekce 3krát týdně a ostatní skupiny byly perfundovány stejným objemem fyziologického roztoku. Nádory byly měřeny každý týden a jejich objemy byly vypočteny pomocí vzorce: V=Y (šířka2 délka). Po 5 týdnech byly myši usmrceny a nádorové tkáně byly odebrány pro další zkoumání.
Pacienti a vzorky tkání
Tato studie byla schválena komisí lékařské etiky druhé přidružené nemocnice, lékařské univerzity v Nanjing a přidružené nemocnice č. 2 lékařské univerzity v Nanjingu a od každého pacienta byl získán písemný informovaný souhlas účastníka. Klinicko-patologická data byla uvedena v doplňkové tabulce S1. Tkáňový mikročip byl zkonstruován společností Zhuoli Biotechnology Co.Ltd (Shanghai, Čína), jak jsme popsali dříve*
Buněčná transfekce
Pro transfekci, kódovanou a pcDNA-3.1-GRP75-Flag byly syntetizovány společností General Biotech (Shanghai, Čína); zatímco siRNA byly uvedeny v doplňkové tabulce S2. Buňky byly přechodně transfekovány pomocí činidla lipofectamine 3000 (Invitrogen, Carlsbad, USA) podle protokolu výrobce. Stručně, buňky byly naneseny na 6-jamkové destičky v hustotě 1 x 10 stupňů buněk v médiu RPMI 1640 obsahujícím 10 procent FBS bez antibiotik. Po inkubaci po dobu 24 hodin byly buňky přechodně transfekovány 5 ng/ml míchaným nebo GRP75-Flag, nebo 20nM si-Con nebo si-GRP75 po dobu 12h. Po transfekci byly buňky kultivovány v čerstvém médiu doplněném 10% FBS po dobu dalších 24 hodin, než byly použity pro další experimenty.
Kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase (qPCR) Použité primery byly uvedeny v doplňkové tabulce S3. Izolace celkové RNA, transkripce RNA na cDNA a provedení qRT-PCR pomocí přístroje Applied Biosystems 7300HT byly všechny podle naší předchozí studie 2. -Aktin byl amplifikován, aby byla zajištěna integrita cDNA a normalizována exprese. Zásobné změny v expresi každého genu byly vypočteny metodou komparativního prahového cyklu (Ct) pomocí vzorce 2-(4ACt)
Tento článek je převzat z Dai et al. Cell Death Discovery (2021) 7:140 https://doi.org/10.1038/s41420-021-00517-w
