Morfologické analýzy exprese nefrinu u progresivní glomerulonefropatie

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstraktní:

V této studii jsme se zaměřili na nefrin, jednu z klíčových molekul ve štěrbinové diafragmě podocytů, protože ačkoli existují zprávy o jeho expresi u lidí a potkanů, jejich přítomnost u běžných kosmanů nebyla hlášena. Zkoumali jsme expresi nefrinu a změny v glomerulech v závislosti na vývoji spontánně progresivní glomerulonefropatie u běžných kosmanů. Bylo hodnoceno devatenáct kosmanů obecných ve věku od dvou do deseti let. Ledvina byla vyšetřena mikroskopicky s hematoxylinem a eosinem a imunohistochemickým barvením na nefrin. Léze byly klasifikovány do tří stupňů podle dříve popsaného systému hodnocení renálních lézí. Nefrin-pozitivní plocha byla měřena morfometrickou analýzou a byl vypočten poměr nefrin-pozitivních. Exprese nefrinu byla pozorována podél glomerulární kapilární kličky v kontinuálním lineárním vzoru u renálních lézí stupně 0 až 2 a buď nespojitého lineárního nebo hrubého granulárního vzoru ve stupni 3. Exprese nefrinu měla tendenci významně klesat v závislosti na stupni renálních lézí . Předpokládá se, že změna exprese nefrinu hraje důležitou roli v progresi renálních lézí.

klíčová slova:nefrin, kosman,glomerulonefropatie, ledvina, patologie

výhody pouštní cistancheaRostlina Cistancheje dobré proledvina

Úvod

Je známo, že spontánní progresivní glomerulonefropatie u kosmanů obecných (Callithrix jacchus) se často vyskytuje od dvou let věku, přičemž závažnost lézí progreduje s věkem. Již dříve jsme uváděli primární a progresivní léze nefropatie u běžných kosmanů1. Primární glomerulární změny časného stadia nefropatie jsou charakterizovány vymizením výběžků podocytárních nohou a částečným ztluštěním bazální membrány glomerulů, o nichž se předpokládá, že způsobují únik proteinu z glomerulů, a lze je pozorovat ultramikroskopií, nikoli však světelnou mikroskopií1–3. Imunoglobulin navíc hraje důležitou roli v progresi nefropatie1, 2. IgM se ukládá na mezangium v ​​časném stadiu glomerulonefropatie a po první depozici IgM se oblast depozitu rozšiřuje na celý glomerulus a IgA a IgG jsou uloženo s progresí2. Světelným mikroskopem lze pozorovat hyalinní odlitky naznačující únik proteinu z glomerulů s progresí glomerulonefropatie4. Proteinurie zhoršuje progresi tubulointersticiálních lézí u běžných kosmanů4, stejně jako u lidí5, 6, a v nedávné studii glomerulů mohla být proteinurie vyvolána poruchami štěrbinové bránice, čímž by se propojily sousední výběžky chodidla (pedicely) podocytu. Štěrbinová bránice je mezibuněčný junkční komplex přítomný mezi sousedními výběžky chodidla a byly identifikovány některé molekuly související s jeho tvorbou3. Snížení exprese těchto molekul nebo dysfunkce štěrbinové bránice byly považovány za související s progresí proteinurie3. Nefrin, jedna z klíčových molekul exprimovaných ve štěrbinové diafragmě podocytů, je glykoprotein skládající se z 1241 aminokyselin a je známým biomarkerem používaným pro sledování poruchy štěrbinových bránic7–10. Molekuly související se štěrbinovými bránicemi nebyly studovány u nefropatie běžných kosmanů, ačkoli je známo, že se u nich vyskytuje změna výběžků podocytů a progrese proteinurie. Kromě toho existují zprávy o expresi nefrinu u lidí a potkanů7–12, ale ne u kosmanů. Zkoumali jsme proto expresi nefrinu v glomerulech a změny exprese nefrinu v závislosti na progresi léze pomocí imunohistochemických analýz.

cistanche tcm

Materiály a metody

Zvířata

Tato studie byla schválena Institucionálním výborem pro péči o zvířata a jejich použití Ústředního ústavu pro pokusná zvířata (CIEA; Kawasaki, Japonsko) a byla provedena v přísném souladu s Předpisy pro experimentování na zvířatech CIEA na základě pokynů pro správné chování Pokusy na zvířatech (Science Council of Japan, 2006). Bylo hodnoceno devatenáct kosmanů obecných (11 samců a 8 samic) od společnosti CLEA Japan Inc. (Tokio, Japonsko). Jejich věk se v době pitvy pohyboval od 2 do 10 let. Zvířata byla umístěna v klecích v místnosti pro zvířata udržované při teplotě 26 ± 3 stupně a vlhkosti 55 ± 20 procent. Byli krmeni LCMS-1M (CLEA Japan Inc., Tokio, Japonsko) a vodou z vodovodu. Zvířata byla humánně usmrcena v anestezii pentobarbitalem sodným kvůli různým příčinám umírání (jako je syntexe, zakřivení bederních obratlů, dislokace mandibulárního kloubu atd.). Analýza moči nebyla provedena, protože nebylo možné odebrat vzorky moči.

Histopatologie

Theledvinybyly promyty fyziologickým roztokem, následně 4% paraformaldehydem a poté fixovány v 10% neutrálně pufrovaném formalínu pro mikroskopické vyšetření. Vzorky byly zality v parafínu, nařezány na tloušťku 5 μm a obarveny hematoxylinem a eosinem (HE). Léze byly klasifikovány jako glomerulární, tubulární a intersticiální léze na základě publikovaných kritérií1. Stupně nefropatie byly rozděleny do čtyř skupin: stupeň 1 (3 muži a 1 žena), stupeň 2 (3 muži a 5 žen), stupeň 3 (1 muž a 3 ženy) a stupeň 4 (3 muži) (tabulka 1).

Pro imunohistochemii monoklonální protilátka proti extracelulární doméně lidského původunefrin(1:1,000, Nefring{{0}}, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA) byla použita jako primární protilátka. Řezy 5-μm byly zbaveny parafinu, rehydratovány, ošetřeny 3% peroxidem vodíku při pokojové teplotě po dobu 5 minut a poté zahřívány v autoklávu při 121 stupních po dobu 20 minut v roztoku pro získávání cíle (pH 6,0, Dako, Glostrup, Dánsko). Po ochlazení byly řezy inkubovány s primární protilátkou při 4 stupních přes noc. Peroxidázou konjugovaný anti-myší a anti-králičí IgG polymer (Histofine Simple Stain Rat MAX-PO(MULTI), Nichirei Bioscience Inc., Tokio, Japonsko) byl použit jako sekundární protilátka pro metodu založenou na polymeru13. Řezy byly inkubovány s protilátkou sekundárního polymeru při teplotě místnosti po dobu 30 minut a reagující produkty byly vizualizovány pomocí 3,3'-diaminobenzidinu jako chromogenu. Kontrabarvení bylo provedeno hematoxylinem. Pro negativní kontrolu byla vynechána primární protilátka.

Morfologická analýza

Pro morfologickou analýzu byly glomeruly s glomerulárním hilem předloženy k vyšetření a na každém sklíčku bylo zachyceno 16 až 28 glomerulů (tabulka 1) pomocí skeneru celých sklíček (Aperio AT2, Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL, USA) a odpovídající software pro prohlížení patologických diapozitivů (Aperio ImageScope, Leica Microsystems Inc.) při stejném rozlišení a velikosti obrazu.Nefrin-pozitivní a celé glomerulární oblasti byly vypočteny pomocí softwaru pro analýzu obrazu (Image-Pro V10, Mediacybenetics Inc., Rockville MD, USA) podle předchozí zprávy14 zakreslením oblasti zájmu kolem glomerulu. Celá glomerulární oblast byla definována jako oblast, kterou lze odlišit od bílého pozadí. Barevné prahy pro výpočetnefrin-pozitivní oblasti byly určeny podle každého stavu barvení. Prahové hodnoty pro červenou, zelenou a modrou byly 37–67, 31–77 a 32–88. Nefrin-pozitivní poměr byl vypočten dělením měřenínefrin-pozitivní oblast nad glomerulární oblastí. Statistická analýza byla provedena pomocí testu Jonckheere (úroveň významnosti: 5 procent, jednostranný test), aby se vyhodnotil trend mezi stupněm nefropatie a expresínefrin.

costanche

Výsledek

Patologická skóre a stupně jednotlivých renálních lézí jsou uvedeny v tabulce 1. Stejně jako v naší první zprávě1, stupeň lézí měl tendenci se s věkem zvyšovat a nebyl zde žádný zjevný rozdíl mezi pohlavími. Výsledky imunohistochemického barvenínefrinjsou znázorněny na obr. 1 anefrin-pozitivní poměr je znázorněn na Obr. 2 a Tabulce 1. Mezi skóre a stupni v tabulce 1 byly pro srovnání se skórem lézí ledviny, odvozeným z celkového skóre každé léze ledviny a skóre hyalinní léze.nefrin-pozitivní poměr (obr. 2 a 3). Jednotlivé případy v tabulce 1 jsou uvedeny ve vzestupném pořadí podle stupně renální léze. Exprese nefrinu byla pozorována spolu s glomerulární kapilární smyčkou v souvislém lineárním vzoru ve stupních 0 až 2 (obr. 1A–C) a v nespojitém lineárním nebo hrubém zrnitém vzoru ve stupních 3 (obr. 1D). V negativním kontrolním vzorku žádná pozitivní reakcenefrinbyl pozorován na jakémkoli místě.

Srovnánínefrin-pozitivní poměr ke stupni renální léze je znázorněn na obr. 2. V případech renálních lézí stupně 0 je průměr ± standardní odchylka (SD)nefrin-pozitivní poměr byl 5,66 ± 1,18 procenta a maximální, minimální a střední hodnoty byly 6,84 procenta, 4,27 procenta a 5,76 procenta. V případech 1. stupně byl průměr ± SD 3,99 ± 1,61 procenta a maximální, minimální a střední hodnoty byly 5,69 procenta, 1,19 procenta a 4,35 procenta. V případech stupně 2 byl průměr ± SD 3,82 ± 2,25 procenta a maximální, minimální a střední hodnoty byly 6,71 procenta, 1,58 procenta a 3,49 procenta. V případech stupně 3 byl průměr ± SD 2,52 ± 1.{44}}2 procenta a maximální, minimální a střední hodnoty byly 3,67 procenta, 2,17 procenta a 2,17 procenta. Souhrnně byly individuální rozdíly v expresi nefrinu malé v případech stupně 0, ale velké v případech stupně 1 nebo vyšší a sporadicky byla zjištěna nízká pozitivní exprese.Nefrinexprese měla tendenci klesat v závislosti na stupni renálních lézí (obr. 2). Mezi stupněm renální léze a byl signifikantně nižší trendnefrin-kladný poměr podle Jonckheereho testu (p=0.0166). Skóre hyalinní sádry ve srovnání se stupněm renální léze je znázorněno na obr. 3. V případech se skóre hyalinní sádry 0 byl průměr ± SD pozitivního poměru nefrinu 5,40 ± 1,32 procenta, v případě skóre 1 to bylo 4,10 ± 1,70 procenta a ve skóre 2 případů to bylo 3,37 ± 1,98 procenta. Podle Jonckheereho testu byl mezi skórem hyalinního obsazení a poměrem pozitivních nefrinů významně nižší trend (p=0.0654).

Diskuse

Pokles nefrinu koreloval s progresí renálních lézí během rozvoje glomerulonefropatie kosmanů. Anti-nefrinová protilátka použitá v této studii rozpoznávala extracelulární doménu na N-koncové straně. Tato extracelulární doména interaguje s molekulami NEPH1 a ​​tvoří strukturu podobnou zipu uvnitř štěrbinové diafragmy15. Lokalizace nefrinu v normálních glomerulech je podél glomerulární kapilární kličky a vzor barvení je lineární vzor kontinuálních jemných granulí jak u potkanů, tak u lidí11, 12, 16–18. Barvení provedené v této studii je vhodné; což je potvrzeno pozorováním, že stěny kapilár v kontaktu s mezangiální oblastí nebyly obarveny, zatímco stěny v kontaktu s podocyty ano. Za abnormálních podmínek, jako je nefrotický syndrom u lidí nebo puromycinová aminonukleosidová nefróza u potkanů, je barvení nefrinů v glomerulech nespojité a hrubě zrnité a intenzita imunohistochemického barvení je slabší než u normálních glomerulů11, 16, 17. V této studii vzor exprese nefrinu ve stupních 0 až 2 byl normální; avšak vzor barvení ve stupních 3 byl srovnatelný s abnormálním stavem. Při předchozím zkoumání exprese glomerulárního nefrinu u potkanů ​​Crl:CD(SD) s onemocněním s minimálními změnami byla exprese nefrinu neporušená, ačkoli výběžky podocytárních nohou vykazovaly vymazání pod elektronovou mikroskopií bez zjevných morfologických změn pozorovaných pod světelnou mikroskopií18. U běžného onemocnění ledvin u potkanů, chronické progresivní nefropatie (CPN), bylo prokázáno, že albuminurie doprovázená časným stádiem CPN může vést k menším změnám v glomerulární permeabilitě v důsledku selhání reabsorbce albuminu z proximálních tubulů19. U lidí byly provedeny výzkumy týkající se snížení exprese nefrinu při malých změnách10 nebo při jiných onemocněních ledvin14, 16. Na druhé straně byla zveřejněna zpráva o intaktní expresi nefrinu u nefrózy s minimálními změnami20. Stále se diskutuje o přítomnosti nebo nepřítomnosti změny exprese nefrinu u nefrotického onemocnění s minimální změnou. Ve skutečnosti bylo obtížné potvrdit zvýšení nebo snížení protilátkové reakce nefrinu vizuálním pozorováním u nefropatie kosmanů, ale pomocí obrazové analýzy bylo možné detekovat změnu v celé ledvině. Naše šetření naznačuje, že abnormalita štěrbinových bránic glomerulu se může podílet na progresi nefropatie u kosmanů obecných v důsledku poklesu nefrinu. Transformace pozitivního vzoru barvení nefrinu z lineárního na granulární vzor byla popsána u potkaního zvířecího modelu nefrotického onemocnění během vývoje léze11, 16, 21. Souvislost mezi abnormalitami štěrbinové membrány a proteinurií často hlášeno22, 23; proto se spekulovalo, že proteinurie může být způsobena dysfunkcí štěrbinové bránice. V naší studii o nefropatii kosmanů mohlo dojít k progresi permeability glomerulárních proteinů v důsledku dysfunkce štěrbinové bránice, protože morfologické rysy hyalinních odlitků byly pozorovány pouze u případů bez tubulointersticiálních změn. V této studii nebyl pozorován žádný statisticky významný rozdíl mezi skóre morfologických změn hyalinních odlitků a poklesem exprese nefrinu. Exprese nefrinu však má tendenci klesat v závislosti na skóre hyalinního obsazení, které je indikátorem úniku proteinu z glomerulu.

V našem předchozím výzkumu bylo pozorováno vymazání výběžků nohy v časném stadiu nefropatie kosmanů a oblast postiženého výběžku nohy byla rozšířena v závislosti na stupni renální léze1. Tabulka 2 ukazuje vztah mezi rychlostí redukce nefrinu v této studii a nálezy elektronové mikroskopie pro každý stupeň renální léze z předchozí studie. Předpokládá se, že vymazání je způsobeno poruchou aktinového cytoskeletu výběžků nohy24. Nefrin je defosforylován při konstrukci štěrbinové membrány a váže se na aktin prostřednictvím CD2AP a podocinu25, 26. Při poranění štěrbinové bránice se molekuly nefrinu shluknou, což vyvolá fosforylaci nefrinu, polymeraci aktinu a vymazání chodidel26. Fosforylace nefrinu také nastává rychle po indukci vymazání chodidla v modelu protaminsulfátu u myší27. Nefrin je glomerulární adhezní protein spojený se zráním, diferenciací, tvorbou procesů a signalizací podocytů24. Naše šetření ukázalo, že existuje korelace mezi redukcí exprese nefrinu, jak bylo stanoveno imunohistochemicky, a progresí stupně renální léze, což naznačuje expanzi vymýcení výběžků podocytárních nohou. Není však jasné, zda abnormality v proteinovém komplexu štěrbinové diafragmy způsobují poškození výběžků podocytové nohy nebo zda poškození podocytů způsobuje změny v štěrbinové membráně a redukci nefrinu. Protože se nefrin také účastní diferenciace podocytů, předpokládá se, že tento vztah bude dále objasněn údaji o regeneraci a diferenciaci podocytů.

Na závěr naše výsledky poskytují informace onefrinexprese u progresivní glomerulonefropatie u kosmanů obecných. Morfologická analýza odhalila nižší trendnefrinexprese v podocytech při progresivní glomerulonefropatii běžných kosmanů a alteracenefrinPředpokládá se, že exprese hraje důležitou roli v progresi renálních lézí.

Zveřejnění potenciálních střetů zájmů:

Autoři prohlašují, že nejsou ve střetu zájmů.

Potvrzení:

Autoři by rádi poděkovali panu Takayoshi Itovi za vynikající technickou pomoc, kterou poskytli. Autoři také děkují paní Kanae Tamatsukuri a panu Jamesi Haradovi za jazykovou úpravu rukopisu.

sistanch

Reference
1. Yamada N, Sato J, Kanno T, Wako Y a Tsuchitani M. Morfologická studie progresivní glomerulonefropatie u kosmanů obecných (Callithrix jacchus). Toxicol Pathol. 41: 1106–1115. 2013.
2. Yamada N, Hashimoto N, Kamiie J, Doi T, Sato J, Inoue T, Shirota K a Tsuchitani M. Vztah mezi ukládáním imunoglobulinů a časnými lézemi progresivní glomerulonefropatie u mladých kosmanů obecných. Veterinář Pathol. 55: 173–176. 2018.
3. Cara-Fuentes G, Clapp WL, Johnson RJ a Garin EH. Patogeneze proteinurie u idiopatického onemocnění s minimální změnou: molekulární mechanismy. Pediatr Nephrol. 31: 2179–2189. 2016.
4. Isobe K, Adachi K, Hayashi S, Ito T, Miyoshi A, Kato A a Suzuki M. Spontánní glomerulární a tubulointersticiální léze u běžných kosmanů (Callithrix jacchus). Veterinář Pathol. 49: 839-845. 2012.
5. Eddy AA. Proteinurie a intersticiální poranění. Transplantace nefrolového číselníku. 19: 277–281. 2004.
6. Hingorani S, Gooley T, Pao E, Sandmaier B a McDonald G. Močové cytokiny po HCT: důkaz renálního zánětu v patogenezi proteinurie aledvinachoroba. Transplantace kostní dřeně. 49: 403-409. 2014.
7. Kestilä M, Lenkkeri U, Männikkö M, Lamerdin J, McCready P, Putaala H, Ruotsalainen V, Morita T, Nissinen M, Herva R, Kashtan CE, Peltonen L, Holmberg C, Olsen
A a Tryggvason K. Pozičně klonovaný gen pro nový glomerulární protein --nefrin-- je mutován u vrozeného nefrotického syndromu. Mol Cell. 1: 575–582. 1998.
8. Langham RG, Kelly DJ, Cox AJ, Thomson NM, Holthöfer H, Zaoui P, Pinel N, Cordonnier DJ a Gilbert RE. Proteinurie a exprese proteinu diafragmy štěrbiny podocytů, nefrinu, u diabetické nefropatie: účinky inhibice enzymu konvertujícího angiotenzin. Diabetologie. 45: 572–1576. 2002.
9. Velšský GI a Saleem MA. Nefrinová signaturní molekula glomerulárního podocytu? J Pathol. 220: 328–337. 2010.
10. van de Lest NA, Zandbergen M, IJpelaar DHT, Wolterbeek R, Bruijn JA, Bajema IM a Scharpfenecker M. Ztráta nefrinu může být použita k predikci remise a dlouhodobého renálního výsledku u pacientů s onemocněním s minimálními změnami.ledvinyInt Rep. 3: 168–177. 2017.
11. Kawachi H, Koike H, Kurihara H, Yaoita E, Orikasa M, Shia MA, Sakai T, Yamamoto T, Salant DJ a Shimizu F. Klonování krysího nefrinu: exprese ve vyvíjejících se glomerulech a v proteinurických stavech.ledvinyInt. 57: 1949–1961. 2000.
12. Luimula P, Ahola H, Wang SX, Solin ML, Aaltonen P, Tikkanen I, Kerjaschki D a Holthöfer H. Nephrin u experimentálních glomerulárních onemocnění.ledvinyInt. 58: 1461–1468. 2000.
13. Janardhan KS, Jensen H, Clayton NP a Herbert RA. Imunohistochemie ve vyšetřovací a toxikologické patologii. Toxicol Pathol. 46: 488–510. 2018.
14. Koop K, Eikmans M, Baelde HJ, Kawachi H, De Heer E, Paul LC a Bruijn JA. Exprese molekul asociovaných s podocyty u získaného člověkaledvinanemocí. J Am Soc Nephrol. 14: 2063–2071. 2003.
15. Gerke P, Huber TB, Sellin L, Benzing T a Walz G. Homodimerizace a heterodimerizace glomerulárních podocytových proteinů nefrinu a NEPH1. J Am Soc Nephrol. 14: 918–926. 2003.
16. Doublier S, Ruotsalainen V, Salvidio G, Lupia E, Biancone L, Conaldi PG, Reponen P, Tryggvason K a Camussi G. Redistribuce nefrinu na podocytech je potenciálním mechanismem proteinurie u pacientů s primárně získaným nefrotickým syndromem. Am J Pathol. 158: 1723–1731. 2001.
17. Kawakami H, Kamiie J, Yasuno K, Kobayashi R, Aihara N a Shirota K. Dynamika absolutního množství nefrinu v jediném podocytu u potkanů ​​s puromycin aminonukleosidovou nefrózou vypočítaná pomocí kvantitativního glomerulárního proteomického přístupu s vybraným režimem monitorování reakce. Transplantace nefrolového číselníku. 27: 1324–1330. 2012.
18. Yasuno K, Honda K, Hakamata S, Kai K a Mori K. Onemocnění s minimální změnouledvinau mladé krysy Sprague Dawley. J Toxicol Pathol. 31: 55–59. 2018.
19. Obert LA a Frazier KS. Zapojení intrarenálního renin-angiotenzinového systému do patogeneze chronické progresivní nefropatie – překlenování informační propasti mezi obory. Toxicol Pathol. 47: 799-816. 2019.
20. Patrakka J, Ruotsalainen V, Ketola I, Holmberg C, Heikinheimo M, Tryggvason K a Jalanko H. Exprese nefrinu v pediatriiledvinanemocí. J Am Soc Nephrol. 12: 289–296. 2001.
21. Saran AM, Yuan H, Takeuchi E, McLaughlin M a Salant DJ. Komplement zprostředkovává redistribuci nefrinu a disociaci aktinu u experimentální membranózní nefropatie.ledvinyInt. 64: 2072–2078. 2003.
22. Gagliardini E, Benigni A, Tomasoni S, Abbate M, Kalluri R a Remuzzi G. Cílená downregulace extracelulárního nefrinu u lidské IgA nefropatie. Am J Nephrol. 23: 277–286. 2003.
23. Wakamatsu A, Fukusumi Y, Hasegawa E, Tomita M, Watanabe T, Narita I a Kawachi H. Role kalcineurinu (CN) vledvinaglomerulární podocyt: CN inhibitor zlepšil proteinurii inhibicí redistribuce CN ve štěrbinové diafragmě. Physiol Rep. 4: e12679. 2016.
24. Garg P. Přehled biologie podocytů. Am J Nephrol. 47 (Suppl 1): 3–13. 2018.
25. Ichimura K, Kurihara H a Sakai T. Organizace aktinových vláken procesů chodidel v podocytech potkana. J Histochem Cytochem. 51: 1589–1600. 2003.
26. Ronco P. Proteinurie: je to všechno v chodidle? J Clin Invest. 117: 2079–2082. 2007.
27. Verma R, Kovari I, Soofi A, Nihalani D, Patrie K a Holzman LB. Zapojení nefrinové ektodomény vede k aktivaci kinázy Src, fosforylaci nefrinu, náboru Nck a polymeraci aktinu. J Clin Invest. 116: 1346–1359. 2006.