Monoterpenové složky z Cistanche Tubulosa — Chemické struktury kankanosidů A — E a Kankanol —

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Haihui XIE, Toshio MORIKAWA, Hisashi MATSUDA, Seikou NAKAMURA, Osamu MURAOKA a Masayuki YOSHIKAWA

Abstraktní

Byly izolovány čtyři nové iridoidní glykosidy, kankanosidy A (1), B (2), C (3) a D (4), chlorovaný iridoid kankanol (5) a acyklický monoterpenový glykosid, kankanosid E (6). z methanolového extraktu sušených stonků Cistanche tubulosa (SCHRENK) R. WIGHT (Orobanchaceae) spolu s 16 známými sloučeninami. Struktury těchto nových sloučenin (1–6) byly určeny na základě chemických a fyzikálně chemických důkazů.

klíčová slova:Cistanche tubulosa; kankanosid; kankanol; iridoidní; monoterpen; Orobanchaceae

Cistanche tubulosa(SCHRENK) R. WIGHT (Orobanchaceae)je vytrvalá parazitická rostlina rostoucí na kořenech druhů Salvadora nebo Calotropis a rozšířená v severní Africe, Arábii a asijských zemích.1) Stonky této rostliny (japonsky Kanka-nikujuyou) se tradičně používají k léčbě impotence, sterility lumbago a tělesná slabost.2) Dříve bylo z čínské a pákistánské C. tubulosa izolováno několik iridoidů, monoterpenoidů, fenylethanoidů a lignanů. 1,3–7) V průběhu našich sériových studií o bioaktivních složkách z čínské přírodní medicíny8–18) čtyři nové iridoidní glykosidy, kankanosidy A (1), B (2), C (3) a D (4 ), chlorovaný iridoid, kankanol (5) a acyklický monoterpenový glykosid, kankanosid E (6), byly izolovány z metanolového extraktu tohoto rostlinného léku spolu s 16 známými sloučeninami včetně 12 monoterpenů (7-18). Tento článek se zabývá izolací a objasněním struktury nových monoterpenových složek (1–6).

Cistanche tubulosa

Metanolový extrakt ze sušených stonkůCistanche tubulosa(26,8 procent z tohoto rostlinného léku) bylo podrobeno kolonové chromatografii na silikagelu s normální fází a reverzní fází a opakované HPLC, čímž byly získány kankanosidy A (1, 0.0{{10 }}54 procent ), B(2, 0.030 procent), C (3, 0.00 27 procent ) a D (4, {{40}}.0015 procent ), kankanol (5, 0.0{ {66}}34 procent ) a kankanosid E (6, 0.027 procent ) spolu s kyselinou mussaenosidovou19) (7, 0.020 procent ) , kyselina geniposidová19) (8, 0,030 procenta), 8-kyselina epiloganová7) (9, 0,033 procenta), glurosid19) (10, 0,14 procenta), antirrhide20) (11, 0,0079 procenta), ajugol19) (112, procenta), bartsioside19) (13, 0,21 procenta), 6-deoxykatalpol19) (14, 0,11 procenta), argyol21) (15, 0,0030 procenta), cistanin22,23) (16, 0,0040 procenta), cis tachlorin22) 17, 0,0035 procenta), (2E,6Z)-8-bD-glukopyranosyloxy-2,6-dimethyl-2,6-kyselina oktadienová24) (18, 0,0028 procenta ), D mannitol25) (4,19 p ercent ), uridin25) (0,0069 procent ), (3R)-3-hydroxy-2- pyrrolidinon26,27) (0,0020 procent) a (3R)-3-hydroxy-1-methyl{ {97}}pyrrolidinon27) (0,0059 procenta).

Struktura kankanosidu A (1) Kankanosid A (1) byl získán jako amorfní prášek a vykazoval negativní optickou rotaci ([a]D25 107,4 stupně v MeOH). IR spektrum 1 ukázalo absorpční pás při 1647 cm1 přiřaditelný olefinové funkci navíc k silným absorpčním pásům při 3410 a 1076 cm1 naznačujících glykosidovou skupinu. Při bombardování rychlými atomy pozitivními a negativními ionty (FAB)-MS 1 byly kvazimolekulární iontové píky pozorovány při m/z 369 (M Na) a 345 (MH) a analýza FAB-MS s vysokým rozlišením odhalila molekulární vzorce 1 je C16H26O8. Kyselou hydrolýzou 1 s 1,0 M kyselinou chlorovodíkovou (HCl) se uvolnila D-glukóza, která byla identifikována HPLC analýzou za použití optického rotačního detektoru.8,10—12,15—18) 13C-NMR (tabulka 2) spektra 1, která byla přiřazena různými NMR experimenty,28) ukázala signály přiřaditelné dvěma methylům [d 1,31 (s, 10-H3), 1,51 (br s, {{47} }H3)], dva methyleny [d 1,49, 2,02 (oba m, 6a- a 6b-H), 1,64, 1,67 (oba m, 7b- a 7a-H)], dva methiny [d 2,21 (dd, J 2,7 , 9,5 Hz, 9-H), 2,71 (m, 5-H)] a a,b-nenasycená acetalová skupina [d 5,33 (d, J 2,7 Hz, 1-H ), 5,95 (br s, 3-H)] spolu s b-glukopyranosylovou skupinou [d 4,62 (d, J 7,9 Hz, 1-H)]. Jak je znázorněno na obr. 1, experiment 1H–1H korelační spektroskopie (1H–1H COSY) na obr. 1 ukázal přítomnost dílčích struktur napsaných tučně. V experimentu korelace heteronukleárních mnohočetných vazeb (HMBC) na 1 byly pozorovány korelace na dlouhé vzdálenosti mezi následujícími protony a uhlíky (3-H, 1-H a 1-C; 11- H3 a 3-C; 3-H, 5-H, 6-H2, 9-H, 11-H3 a 4- C ; 11-H3 a 5-C; 10-H3 a 7-C; 1-H, 7-H2, 9-H, 10-H3 a 8-C; 10-H3 a 9-C; 7-H2 a 10-C), jak je znázorněno na obr. 1. Enzymatická hydrolýza 1 s b-glukosidázou poskytla aglykon, kanagenin a (1a), jak je znázorněno na obr. 3. Porovnání 13C NMR spektra pro 1 se spektrem pro 1a odhalilo glykosylační posun kolem polohy 1- v 1 [1: dC 94,1 (1-C), 134,6 (3-C), 53,3 (9-C); 1a: dC 92,9 (1-C), 135,3 (3-C), 54,7 (9-C)]. Konektivita bD-glukopyranosylové skupiny v 1 byla tedy také objasněna tak, že je v 1-poloze la. Dále byla relativní stereostruktura 1 charakterizována experimentem nukleární Overhauserovy zesílení spektroskopie (NOESY), který ukázal NOE korelace mezi následujícími protonovými páry (1-H a 10-H3; 3-H a 11-H3; 5-H a 6b-H, 9-H; 6b-H a 7b-H; 7a-H a 10-H3; 7b-H a {{ 190}}H), jak je znázorněno na obr. 2. Nakonec byla absolutní konfigurace 1-polohy v 1 stanovena aplikací pravidla 13C NMR glykosylačního posunu 1,1-disacharidu,29), které bylo zjištěno aplikovat na hemiacetalové sloučeniny.30,31) Bylo potvrzeno, že stereostruktura 1-polohy v 1 je zachována v la srovnáním1H-NMR analýzy včetně NOESY experimentu. Bylo zjištěno, že hodnoty glykosylačního posunu [Dd 1,2 ppm (1-C) a 0,9 ppm (1- C), v pyridinu-d5] jsou charakteristické pro kombinaci R, Rhemiacetal, která odpovídala absolutní stereostruktuře 1 jak je znázorněno na obr. 3. V důsledku toho byla absolutní konfigurace v poloze 1- 1 určena jako konfigurace S a absolutní stereostruktura 1 byla objasněna, jak je znázorněno.

Struktury kankanosidu B (2) a C (3) Kankanosid B (2) byl také izolován jako amorfní prášek s negativní optickou rotací ([a]D26 118,7 stupně v MeOH). Infračervené spektrum 2 vykazovalo absorpční pásy při 3410, 1647 a 1{{5{{80}}}}85 cm1, které lze připsat hydroxylovým, olefinovým a etherovým funkcím. Molekulární vzorec C15H24O10 2 byl stanoven pomocí kvazimolekulárních iontových píků v pozitivních iontech FAB-MS a pomocí FAB-MS s vysokým rozlišením. Kyselá hydrolýza 2 s 1,0 M HCl uvolnila D-glukózu, která byla identifikována HPLC analýzou za použití optického rotačního detektoru. Tabulka 2) spektra28) ze 2 ukazuje signály přiřaditelné dvěma methylenům [d 1,40 (DDD, J 5,2, 7,3, 13,5 Hz, 6a-H), 2,52 (DDD, J 7,0, 9,2, 13,5 Hz, 6b-H), 3. , 3,99 (oba d, J 11,9 Hz, 10-H2)], čtyři methiny [d 2,21 (dd, J 6,4, 8,6 Hz, 9-H), 2,83 (m, 5- H), 4,02 (dd, J 5,2, 7,0 Hz, 7-H), 5,49 (d, J 6,4 Hz, 1-H)] a cisolefifinový pár [d 4,95 (dd, J 4,0 , 6,1 Hz, 4-H), 6,22 (dd, J 1,8, 6,1 Hz, 3-H)], společně s b-glukopyranosylovou skupinou [d 4,72 (d, J 7,9 Hz, 1- H)]. Protonové a uhlíkové signály v 1H- a 13C-NMR datech 2 byly podobné signálům 6-deoxykatalpolu (14), s výjimkou signálů způsobených 7- a 8- pozice. Jak je znázorněno na obr. 1, experiment 1 H–1 H COZY na obrázku 2 ukázal přítomnost dílčích struktur napsaných tučně a v experimentu HMBC byly pozorovány korelace na dlouhé vzdálenosti mezi následujícími protonovými a uhlíkovými páry ({{ 122}}H, 1-H a 1-C; 1-H a 3-C; 10-H2 a 7- C; 1-H , 7-H, 9-H, 10-H2 a 8-C; 7-H, 10-H2 a 9-C 7-H a 10-C). Relativní stereostruktura 2 byla charakterizována experimentem NOESY, který ukázal NOE korelace mezi následujícími protonovými páry (1-H a 10-H2; 3- H a 4-H; 5-H a 6b-H, 9-H; 6b-H a 7-H; 7-H a 9-H), jak je znázorněno na obr. 2. Nakonec alkalické zpracování 14 s 5% vodným hydroxidem draselným (KOH) poskytlo 2 a 19, 32), takže stereostruktura 2 byla vyjasněna.

Kankanosid C (3) byl izolován jako amorfní prášek s negativní optickou rotací ([a]D 26 34.0 stupeň v MeOH). Ve FAB-MS pro negativní ionty 3 byl pozorován pár izotopových kvazimolekulárních iontových píku při m/z 399 a 401 (MH) . Molekulární vzorec 3 byl stanoven jako C15H25ClO10 měřením FAB-MS s vysokým rozlišením. Kyselá hydrolýza 3 s 1,0 M HCl uvolnila D-glukózu, která byla identifikována HPLC analýzou za použití optického rotačního detektoru. Tabulka 2) spektra28) ze 3 ukazuje signály přiřaditelné třem methylenům [d 1,70 (br dd, J cca 3, 13 Hz, 4a-H), 2,70 (br dd, J cca 6, 13 Hz, 4b-H) , 1,68 (br d, J asi 13 Hz, 6a H), 2,44 (m, 6b-H), 4,01, 4,04 (oba d, J 11,3 Hz, 10-H2)], pět methinů [d 2,47 (dd, J 2,5, 7,9 Hz, 9-H), 2,61 (m, 5-H), 3,94 (br s, 7-H), 5,10 (br d, J cca. 3 Hz, 3-H), 5,48 (d, J 2,5 Hz, 1-H)] a b-glukopyranosylová skupina [d 4,60 (d, J 8,0 Hz, 1-H)]. Protonové a uhlíkové signály v 'H- a 13C-NMR spektrech 3 byly superponovatelné se signály 2, s výjimkou signálů způsobených polohami 3- a 4-. Pozice bD-glukopyranosylové a chlorové funkce v 3 byly objasněny z experimentů H–H COSY a HMBC, jak je ukázáno na obr. 1. Následně byla planární struktura 3 zkonstruována tak, jak je znázorněno. Relativní stereostruktura 3 byla určena experimentem NOESY, ve kterém byly pozorovány korelace NOE mezi následujícími protonovými páry (1-H a 3-H, 10-H2; 3- H a 4a-H; 4b-H a 5- H; 5-H a 6b-H, 9-H; 6b-H a 7-H; {{121} }H a 9-H), jak je znázorněno na obr. 2.

Struktury Kankanosidu D (4) a Kankanolu (5) Kankanosid D (4) byl izolován jako amorfní prášek s negativní optickou rotací ([a]D 25 30,6 stupně v MeOH). IR spektrum 4 ukázalo absorpční pás při 1655 cm1, který lze připsat olefinové funkci, a silné absorpční pásy při 3410 a 1078 cm1 svědčící o jeho glykosidické struktuře. V FAB-MS pro kladné ionty 4 byl pozorován kvazimolekulární iontový pík při m/z 341 (M Na). Molekulární vzorec C15H26O7 4 byl stanoven měřením FAB-MS s vysokým rozlišením. Kyselá hydrolýza 4 s 1,0 M HCl uvolnila D-glukózu,8,10-12,15-18), zatímco (R)-rotundita (4a) 33,34) byla získána enzymatickou hydrolýzou 4 s b-glukosidázou. 'H-NMR (tabulka 3, CD3OD) a 13C-NMR (tabulka 4) spektra28) 4 ukázala signály přiřaditelné methylu [d 1,69 (s, 10-H3)], třem methylenům [d 1,41, 2,06 (oba m, 4-H2), 1,51, 2,01 (oba m, 6a- a 6b-H), 2,23 (br dd, J cca 8, 15 Hz, 7a-H), 2,37 (br dd , J asi 8, 15 Hz, 7b-H)], methin [d 2,90 (m, 5-H)] a dva methyleny nesoucí kyslíkovou funkci {d [3,56 (DDD, J 2,8, 7,4 , 13,2 Hz), 3,97 (DDD, J 4,9, 8,0, 13,2 Hz), 3-H2], 4,04, 4,18 (oba d, J 12,2 Hz, 1-H2)} spolu s b- glukopyranosylová část [d 4,25 (d, J 7,7 Hz, 1-H)]. Poloha bD-glukopyranosylové části v 4 byla objasněna experimentem HMBC jako 3-poloha (obr. 1). Na základě tohoto důkazu bylo stanoveno, že absolutní stereostruktura 4 je taková, jak je uvedeno.

Kankanol (5) byl získán jako amorfní prášek s pozitivní optickou rotací ([a]D25 11,1 stupně). Chemická ionizace (CI)-MS 5 ukázala pár píků izotopových iontů při m/z 221 a 223 v důsledku kvazimolekulárního iontu (MH). Měření CI-MS s vysokým rozlišením 5 odhalilo molekulární vzorec C9H13ClO4. 'H-NMR (tabulka 1, CD3OD) a 13C-NMR (tabulka 2) spektra28) sloučeniny 5 ukázala přítomnost následujících funkcí: tři methyleny [d 1,60 (DDD, J 2,5, 5,5, 13,1 Hz, 4a-H), 1,80 (br dd, J cca 3, 13 Hz, 4b H), 1,83 (br d, J cca 12 Hz, 6a-H), 2,57 (m, 6b-H), 3,75 , 3,88 (oba d, J 9,2 Hz, 10-H2)], pět methinů [d 2,76 (dd, J 4,3, 8,0 Hz, 9-H), 2,50 (m, 5- H), 3,80 (br s, 7-H), 5,17 (br d, J asi 3 Hz, 3-H), 5,26 (d, J 4,3 Hz, 1-H) ]. Rovinná struktura 5 byla potvrzena experimenty 1 H–1 H COSY a HMBC. To znamená, že experiment 1 H–1 H COZY na 5 ukázal přítomnost dílčích struktur napsaných tučně a v experimentu HMBC byly pozorovány korelace na dlouhé vzdálenosti, jak je znázorněno na obr. 1. Relativní stereostruktura 5 byla určeno experimentem NOESY, ve kterém byly pozorovány korelace NOE mezi následujícími protonovými páry (1-H a 9-H; 3-H a 4a-H; 4b-H a {{ 93}} H; 5-H a 6b-H, 9-H; 6b-H a 7-H; 7-H a 9-H), jak je uvedeno na obr. 2. Srovnáním 'H- a 13C-NMR dat pro 5 s těmi pro 14a, která byla získána zpracováním 14 s 5% vodnou HCl, jak je ukázáno v grafu 1,35) poloha chloru skupina v 5 byla podporována jako 3-pozice. Kromě toho acetylace sloučeniny 5 anhydridem kyseliny octové (Ac20) a pyridinem poskytla 3,7-oxid (5a), zatímco sloučenina 14a poskytla diacetát (14b) za stejných acetylačních podmínek. Tento důkaz nás také vedl k potvrzení pozice funkce chlóru na pozici 3b (graf 3). Následně bylo stanoveno, že stereostruktura 5 je taková, jak je uvedeno.

Struktura Kankanosidu E (6) Kankanosid E (6) byl izolován jako amorfní prášek s negativní optickou rotací ([a]D 25 20.0 stupeň v MeOH). IR spektrum 6 vykazovalo absorpční pásy při 3410, 1647, 1085 cm1, které lze připsat glykosidickým a karbonylovým funkcím, zatímco jeho UV spektrum vykazovalo absorpční maximum při 211 nm (loge 4,63), což ukazuje na přítomnost b-nenasycené karboxylové kyseliny. Molekulární vzorec C16H28O8 6 byl charakterizován pomocí FAB-MS s kladnými a zápornými ionty a měřením MS s vysokým rozlišením. Kyselá hydrolýza 6 uvolněné D-glukózy, 8,10—12,15—18), zatímco kyselina (2E,6R)-8-hydroxy-2,6-dimethyl- 2-oktanová (6a) 36) byl získán enzymatickou hydrolýzou 6 s b-glukosidázou. 'H-NMR (tabulka 3, CD3OD) a 13C-NMR (tabulka 4) spektra28) sloučeniny 6 indikovala přítomnost (2E,6R)-8-hydroxy-2,6- skupina dimethyl-2-oktanové kyseliny [d 0,95 (d, J 6,4 Hz, 10-H3), 1,30, 1,48 (oba m, 5-H2), 1,45, 1,70 (oba m, { {70}}H2), 1,65 (m, 6-H), 1,81 (s, 9-H3), 2,22 (2H, m, 4-H2), 3,61, 3,94 (obě m, 8-H2), 6,78 (dd, J 1,2, 7,3 Hz, 3-H)] spolu s bD-glukopyranosylovou částí [d 4,26 (d, J 7,6 Hz, 1-H)] . Porovnáním signálů uhlíku v 13C-NMR spektru 6 se signály 6a byl pozorován glykosylační posun kolem 8-polohy 6. Poloha glukosidové vazby byla také potvrzena experimenty HMBC, jak je ukázáno na Obr. 1. V důsledku toho byla objasněna absolutní stereostruktura sloučeniny 6 na kyselinu (2E,6R)-8-b-D-glukopyranosyloxy-2,6-dimethyl-2-oktanovou.

cistanche extrakt přínos

Experimentální

K získání fyzikálních dat byly použity následující přístroje: specifické rotace, digitální polarimetr Horiba SEPA-300 (l 5 cm); UV spektra, Shimadzu UV-1600 spektrometr; IR spektra, spektrometr Shimadzu FTIR-8100; hmotnostní spektrometr EI-MS, CI-MS a CI-MS s vysokým rozlišením, JEOL JMS-GCMATE; FAB-MS a MS s vysokým rozlišením, hmotnostní spektrometr JEOL JMS-SX 102A; 'H-NMR spektrum, JEOL EX-270 (270 MHz) a JNM-LA500 (500 MHz) spektrometry; 13C-NMR spektra, JEOL EX-270 (68 MHz) a JNM-LA500 (125 MHz) spektrometry s tetramethylsilanem jako vnitřním standardem; a HPLC detektor, Shimadzu RID-6A index lomu a SPD- 10Avp UV-VIS detektory. Pro analytické a preparativní účely byly použity kolony HPLC, YMC-Pack ODS-A (250 4,6 mm vnitřní průměr) a (250 20 mm vnitřní průměr) kolony.

Pro chromatografii byly použity následující experimentální podmínky: sloupcová chromatografie na silikagelu s běžnou fází, silikagel BW-200 (Fuji Silysia Chemical, Ltd., Aichi, Japonsko, 15{{10}}-35 0 síť); sloupcová chromatografie na silikagelu s reverzní fází, Chromatorex ODS DM1020T (Fuji Silysia Chemical, Ltd., Aichi, Japonsko, 100-200 mesh); TLC, předem potažené TLC desky se silikagelem 60F254 (Merck, 0,25 mm) (běžná fáze) a silikagelem RP- 18 F254S (Merck, 0,25 mm) (reverzní fáze); HPTLC s reverzní fází, předem potažené TLC desky se silikagelem RP-18 WF254S (Merck, 0,25 mm); a detekce bylo dosaženo postřikem 1% Ce(SO4)2–10% vodnou H2SO4 s následným zahřátím.

Přírodní materiál

Sušené stonky Cistanche tubulosa (SCHRENK) R. WIGHT byly zakoupeny v Urumqi, provincie Xinjiang, Čína v lednu 2005 prostřednictvím společnosti Eishin Trading Co., Ltd. Osaka, Japonsko, a botanickou identifikaci provedl profesor Jia Xiaoguang z institutu tradiční čínštiny v Xinjiang a Etnologické léky. Poukazový vzorek (2005.01. Xinjiang-01) této rostliny je uložen v naší laboratoři.

Extrakce a izolace

Sušené stonky C. tubulosa (5,{1}} kg) byly rozdrceny na prášek a extrahovány třikrát methanolem pod zpětným chladičem po dobu 3 hodin. Odpařením rozpouštědla za sníženého tlaku byl získán methanolický extrakt (1340 g, 26,8 procenta z tohoto rostlinného léku). Metanolový extrakt (160 g) byl podroben kolonové chromatografii na normální fázi silikagelu [3,2 kg, CHCl3–MeOH–H2O (10 : 3 : 1→7 : 3 : 1, nižší vrstva →6 : 4 : 1) MeOH] za vzniku šesti frakcí [Fr. 1 (5.{85}}4 g), Fr. 2 (9,84 g), Fr. 3 (7,80} g), Fr. 4 (13,28 g), Fr. 5 (113,6{{104}} g) a Fr. 6 (7,61 g)]. Frakce 1 (5.00 g) byla oddělena sloupcovou chromatografií na silikagelu s reverzní fází [150 g, MeOH–H2O (40 6: 60→ 5{{ 162}} : 50→60 : 40, obj./obj.)→MeOH], čímž se získá pět frakcí [Fr. {{50}} (83{{201}} mg), Fr. 1-2 (590 mg), Fr. 1-3 (180 mg), Fr. 1-4 (124 mg) a Fr. 1-5 (3200 mg)]. Fr. {{60}} (830 mg) byl dále separován pomocí HPLC [MeOH–H2O (10 : 90, obj./obj.)] za vzniku kankanolu (5, 20 mg, 0,0034 procent), argyol (15, 18 mg, 0,0030 procent), cistanin (16, 24 mg, 0,0040 procent) a Fr. 1-1-2 (62 mg), který byl dále separován pomocí HPLC [MeOH–H2O (2 : 98, obj./obj.)] za vzniku (3R)-3-hydroxy-2-pyrrolidinonu (0,0020 procent ) a (3R)-3-hydroxy-1-methyl-2-pyrrolidinon (0,0059 procenta). Fr. 1-2 (590 mg) byl purifikován pomocí HPLC [MeOH–H2O (35 : 65, obj./obj.) a CH3CN- H2O (20 : 80, obj./obj.)] za vzniku cistanchlorinu (17, 21 mg, 0,0035 procento ). Frakce 2 (9,72 g) byla podrobena sloupcové chromatografii na silikagelu s reverzní fází [290 g, MeOH-H2O (20 : 80 —> 30 : 70 — 40 : 60 —> 60 : 40, obj./obj.) — MeOH] až af ford sedm zlomků [Fr. 2-1 (1986 mg), Fr. 2-2 (1563 mg), Fr. 2-3 (3931 mg), Fr. 2-4 (375 mg), Fr. 2-5 (486 mg), Fr. 2-6 (460 mg) a Fr. 2-7 (336 mg)]. Fr. 2-1 (466 mg) bylo separováno pomocí HPLC [MeOH-H20 (5 : 95, obj./obj.)], čímž byl získán uridin (0,0069 procent). Fr. 2-2 (535 mg) bylo separováno pomocí HPLC [MeOH–H2O (10 : 90, obj./obj.)] za vzniku antirrhidu (11, 15 mg, 0,0079 procenta) a 6-deoxykatalpolu (14, 214 mg, 0,11 procenta). Fr. 2-3 (535 mg) bylo separováno pomocí HPLC [MeOH–H2O (20 : 80, obj./obj.)], čímž byl získán glurosid (10, 110 mg, 0,14 procenta) a bartsiosid (13, 164 mg, 0,21 procenta) . Fr. 2-4 (375 mg) bylo separováno pomocí HPLC [MeOH–H2O (30 : 70, obj./obj.)], čímž byly získány kankanosidy A (1, 32 mg, 0,0054 procenta) a D (4, 9 mg, 0,0015 procenta ). Fr. 2-6 (460 mg) bylo dále separováno pomocí HPLC [MeOH–H2O (45 : 55, obj./obj.)] za vzniku kankanosidu E (6, 161 mg, 0,027 procenta) a (2E,6Z){{192 }}bD-glukopyranosyloxy-2,6-dimethyl-2,6-oktadienová kyselina (18, 17 mg, 0,0028 procenta). Frakce 3 (7,60 g) byla podrobena sloupcové chromatografii na silikagelu s reverzní fází [230 g, MeOH-H2O (20 : 80 —> 40 : 60 — 50 : 50 — 60 : 40, obj./obj.) — MeOH]. pět zlomků [Fr. 3-1 (2652 mg), Fr. 3-2 (593 mg), Fr. 3-3 (3610 mg), Fr. 3-4 (190 mg) a Fr. 3-5 (336 mg)]. Fr. 3-1 (480 mg) bylo přečištěno pomocí HPLC [MeOH–H2O (10 : 90, obj./obj.)], čímž byl získán kankanosid B (2, 19 mg, 0,018 procenta), kyselina geniposidová (8, 32 mg, 0,030 procent) a ajugol (12, 12 mg, 0,011 procent). Frakce 4 (13,10 g) byla podrobena sloupcové chromatografii na silikagelu s obrácenými fázemi [390 g, MeOH-H2O (10 : 90 —> 20 : 80 — 30 : 70 — 40 : 60 — 50 : 50, obj./obj.) → MeOH] za vzniku sedmi frakcí [Fr. 4-1 (6114 mg), Fr. 4-2 (430 mg), Fr. 4-3 (1058 mg), Fr. 4-4 (170 mg), Fr. 4-5 (2595 mg), Fr. 4-6 (1635 mg) a Fr. 4-7 (1064 mg)]. Fr. 4-2 (430 mg) bylo dále separováno pomocí HPLC [MeOH-H2O (5:95, obj./obj.)] za vzniku 2 (70 mg, 0,012 procenta) a kankanosidu C (3, 16 mg, 0,0027 procenta) . Fr. 4-6 (1058 mg) bylo také separováno pomocí HPLC [MeOH–H2O (15 : 85, obj./obj.)], čímž byla získána kyselina mussaenosidová (7, 116 mg, 0,020 procenta) a 8-epiloganová kyselina (9, 193 mg, 0,033 procenta). Frakce 5 (15,15 g) byla podrobena sloupcové chromatografii na silikagelu s reverzní fází [455 g, MeOH-H20 (0 : 100 -> 10 : 90 -> 20 : 80 -> 40 : 60 -> 50 : 50, obj./obj.) -> MeOH ], čímž se získá sedm zlomků [Fr. 5-1 (9311 mg), Fr. 5-2 (1114 mg), Fr. 5-3 (306 mg), Fr. 5-4 (347 mg), Fr. 5-5 (1620 mg), Fr. 5-6 (1453 mg) a Fr. 5-7 (1106 mg)]. Fr. 5-1 (9311 mg) byl krystalizován z MeOH, čímž byl získán D-mannitol (3337 mg, 4,19 procent).

Známé sloučeniny (7-18) byly identifikovány porovnáním jejich fyzikálních dat ([a]D, IR, 'H-NMR, 13C-NMR, MS) s uvedenými hodnotami1,7,19-24,26,27) popř. ty z komerčních vzorků.25) Kankanosid A (1): amorfní prášek, [a]D25 107,4 stupně (c 1,50, MeOH). FAB-MS s kladným iontem s vysokým rozlišením: Vypočteno pro C16H26O8Na (M Na) 369,1525; Nalezeno 369,1522. IR (KBr): 3410, 2940, 1647, 1076 cm1. 'H-NMR (500 MHz, CD3OD a pyridin-d5) d: uvedeno v tabulce 1. 13C-NMR (125 MHz, CD3OD a pyridin-d5) dC: uvedeno v tabulce 2. FAB-MS s pozitivním iontem: m /z 369 (M Na). Negativní ion FAB-MS: m/z 345 (MH).

Kankanosid B (2): amorfní prášek, [a]D26 118,7 stupně (c 0,10, MeOH). FAB-MS s kladným iontem s vysokým rozlišením: Vypočteno pro C15H24O10Na (M Na) 387,1267; Nalezeno 387,1261. IR (KBr): 3410, 2940, 1647, 1085 cm1. 'H-NMR (500 MHz, CD3OD) d: uvedeno v tabulce 1. 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) dC: uvedeno v tabulce 2. FAB-MS s pozitivním iontem: m/z 387 (M Na). Negativní ion FAB-MS: m/z 363 (MH).

Kankanosid C (3): amorfní prášek, [a]D 26 34.0 stupňů (c 1.00, MeOH). Negativní ionty FAB-MS s vysokým rozlišením: Vypočteno pro C15H24C1010 (MH) 399,1058; Nalezeno 399,1077. IR (KBr): 3410, 2964, 1159, 1078, 1048, 949 cm1. 'H-NMR (500 MHz, CD3OD) d: uvedeno v tabulce 1. 13C NMR (125 MHz, CD3OD) dC: uvedeno v tabulce 2. Negativní ion FAB-MS: m/z 399, 401 (MH).

Kankanosid D (4): amorfní prášek, [a]D 25 30,6 stupně (c 0,50, MeOH). FAB-MS s kladným iontem s vysokým rozlišením: Vypočteno pro C15H26O7Na (M Na) 341,1204; Nalezeno 341,1210. IR (KBr): 3410, 2940, 1655, 1078, 1040 cm1. 'H-NMR (500 MHz, CD3OD) d: uvedeno v tabulce 3. 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) dC: uvedeno v tabulce 4. FAB-MS s pozitivním iontem: m/z 341 (M Na). Negativní ion FAB-MS: m/z 317 (MH).

Kankanol (5): amorfní prášek, [a]D25 11,1 stupně (c 1,40, MeOH). CI-MS s vysokým rozlišením: Vypočteno pro C9H14C104 (MH) 221,0580; Nalezeno 221,0582. IR (KBr): 3399, 3004, 1165, 1096, 1059, 1048, 955 cm1. 'H-NMR (500 MHz, CD3OD) d: uvedeno v tabulce 1. 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) dC: uvedeno v tabulce 2. CI-MS m/z (procenta): 221 (MH) (5 223 (MH) (2), 185 (88), 167 (100), 149 (71) a 57 (49).

Kankanosid E (6): amorfní prášek, [a]D 25 20,0 stupně (c 2.00, MeOH). FAB-MS s kladným iontem s vysokým rozlišením: Vypočteno pro C16H28O8Na (M Na) 371,1682; Nalezeno 371,1690. UV [MeOH, nm (loge)]: 215 (4,16). IR (KBr): 3410, 2940, 1647, 1085, 1043 cm1. 'H-NMR (500 MHz, CD3OD) d: uvedeno v tabulce 3. 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) dC: uvedeno v tabulce 4. FAB-MS s pozitivním iontem: m/z 371 (M Na). Negativní ion FAB-MS: m/z 347 (MH).

cistanche extrakt přínos

Kyselá hydrolýza 1-4 a 6 s 1M HCl

Roztok 1-4 nebo 6 (každý 1,5 mg) v 1 M HC1 (0,5 ml) byl zahříván pod zpětným chladičem po dobu 3 hodin. Po ochlazení byla reakční směs nalita do ledové vody a neutralizována Amberlitem IRA-400 (OH forma) a pryskyřice byla odstraněna filtrací. Poté byl filtrát extrahován EtOAc. Vodná vrstva byla podrobena HPLC analýze za následujících podmínek: HPLC kolona, ​​Ka senzor LC NH{{1{19}}}}, 4,6 mm id 250 mm (Tokyo Kasei Co., Ltd., Tokyo, Japonsko); detekce, optická rotace [Shodex OR-2 (Showa Denko Co., Ltd., Tokio, Japonsko)]; mobilní fáze, CH3CN-H20 (75:25, obj./obj.); druhá rychlost 0,8 ml/min; teplota kolony, teplota místnosti. Identifikace D-glukózy přítomné ve vodné vrstvě byla provedena porovnáním jejího retenčního času a optické rotace s těmi u autentického vzorku: tR 12,3 min (pozitivní optická rotace)

Enzymatická hydrolýza 1, 4 a 6 s b-glukosidázou

Na roztok 1 (7,7 mg) v H2O (1,5 ml) se působí b-glukosidázou (5,{8}} mg, od mandle, Oriental Yeast Co., Tokio, Japonsko) a roztok se míchá při 37 stupních na 3 d. Poté, co byl k reakční směsi přidán EtOH, bylo rozpouštědlo odstraněno za sníženého tlaku a zbytek byl purifikován pomocí HPLC [MeOH-H2O (55:45, obj./obj.)], čímž byl získán kanagenin a (1a, 2,3 mg, 56 procent). . Podobným postupem se získá (R)-rotundiol33,34) (4a, 1,2 mg, 69 procent) a (2E,6R)-8-hydroxy-2,6-dimethyl{{30} kyselina oktanová36) (6a, 6,8 mg, 62 procent) byly získány z 4 (3,5 mg) a 6 (20,4 mg), v daném pořadí.

Kankagenin a (la): bílý prášek, [a]D25 18,4 stupně (c 0,20, MeOH). EI-MS s vysokým rozlišením: Vypočteno pro C10H16O3 (M) 184,1099; Nalezeno 184,1106. IR (KBr): 3410, 2940, 1684 cm1. 'H-NMR (500 MHz, CD3OD) d: uvedeno v tabulce 1. 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) dC: uvedeno v tabulce 2. EI MS: m/z (procenta): 184 (M, 37) 95 (100).

Alkalické zpracování 14 s 5% vodným KOH

Roztok 14 (23.0 mg) v 5% vodném KOH (1,{5}} ml) byl míchán při 80 stupních po dobu 2 hodin. Reakční směs byla neutralizována Amberlitem HCR-W2 (H forma). Odstranění rozpouštědla z filtrátu za sníženého tlaku poskytlo zbytek, který byl přečištěn pomocí HPLC [MeOH-H2O (5:95, obj./obj.)] za vzniku 2 (4,0 mg, 16 procent) a 1932 (10,5 mg , 43 procent).

Ošetření 14 kyselinou 5% vodnou HC1

Roztok 14 (25.0 mg) v 5% vodné HCl (2,{5}} ml) byl míchán při teplotě místnosti po dobu 3 hodin. Reakční směs byla nalita do ledové vody a celá reakční směs byla extrahována EtOAc. EtOAc extrakt se postupně promyje nasyceným vodným NaHC03 a solankou, poté se suší nad bezvodým práškem MgS04 a filtruje se. Odstranění rozpouštědla z filtrátu za sníženého tlaku poskytlo zbytek, který byl oddělen pomocí HPLC [MeOH-H20 (20: 80, obj./obj.)], čímž byla získána sloučenina 14a (4,0 mg, 25 procent).

14a

Bílý prášek, [a]D20 21,5 stupně (c 0,30, MeOH). CI-MS s vysokým rozlišením: Vypočteno pro C9H14C104 (MH) 221,0580; Nalezeno 221,0587. IR (KBr): 3410, 2962, 1365, 1152, 1055, 945 cm1. 'H-NMR (500 MHz, CD3OD) d: uvedeno v tabulce 1. 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) dC: uvedeno v tabulce 2. CI-MS: m/z (procenta): 221 (MH) ( 7), 223 (MH) (3), 203 (M H20) (97), 205 (M H20) (33), 185 (7), 167 (12), 159 (32), 121 (27), 110 (48), 95 (64), 85 (100), 67 (56) a 57 (65).

Acetylace 5 a 14a

Na roztok 5 (2,5 mg) v pyridinu (0,5 ml) se působí anhydridem kyseliny octové (Ac20, 0,4 ml) a směs se míchá 12 hodin při teplotě místnosti. Reakční směs byla nalita do ledové vody a celá reakční směs byla extrahována EtOAc. EtOAc extrakt byl postupně promyt 5% vodnou HC1, nasyceným vodným NaHC03 a solankou, poté vysušen nad bezvodým MgS04 a přefiltrován. Odstraněním rozpouštědla z filtrátu za sníženého tlaku byl získán zbytek, který byl přečištěn pomocí HPLC [MeOH-H20 (35:65, obj./obj.)], čímž byla získána sloučenina 5a (2,3 mg, 77 procent). Podobným postupem se také připravila sloučenina 14b (2,7 mg, 87 procent) a čistila se pomocí HPLC [MeOH-H20 (55:45, obj./obj.)] z 14a (2,1 mg).

5a

Bílý prášek, [a]D20 1,8 stupně (c 0,18, MeOH). CI MS s vysokým rozlišením: Vypočteno pro C11H15O5 (MH) 227,0919; Nalezeno 227,0925. IR (KBr): 2962, 1734, 1374, 1258, 1237, 1169, 1103, 1053, 947 cm1. 'H-NMR (500 MHz, CD3OD) d: uvedeno v tabulce 1. 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) dC: uvedeno v tabulce 2. CI-MS m/z (procenta): 227 (MH) (28 209 (M H20) (4), 184 (3), 166 (45), 149 (22), 138 (38), 122 (44), 94 (31), 85 (100) a 57 (34 ).

14b

Bílý prášek, [a]D20 23,7 stupně (c 0,06, MeOH). CI-MS s vysokým rozlišením: Vypočteno pro C13H18C106 (MH) 305,0792; Nalezeno 305,0790. IR (KBr): 1744, 1376, 1243, 1231, 1001, 941 cm1. 'H-NMR (500 MHz, CD3OD) d: uvedeno v tabulce 1. 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) dC: uvedeno v tabulce 2. CI-MS: m/z (procenta): 305 (MH) ( 2), 307 (MH) (1), 263 (MH C2H30) (6), 265 (MH C2H30) (3), 245 (30), 203 (8), 185 (100), 167 (7), 149 (33), 121 (26), 95 (15), 85 (37) a 57 (93).

Poděkování

Tento výzkum byl podpořen 21. programem COE, Academic Frontier Project a grantem na podporu vědeckého výzkumu od Ministerstva školství, kultury, sportu, vědy a technologie Japonska. Autoři děkují profesoru Xiaoguang Jia z Institutu tradiční čínské a etnologické medicíny Xinjiang v Urumqi v Číně za identifikaci rostlinného materiálu.

cistanche prospěch

Reference a poznámky

1) Kobayashi H., Oguchi H., Takizawa N., Miyase T., Ueno A., Usmanghani K., Ahmad M., Chem. Pharm. Bull., 35, 3309-3314 (1987).

2) Xinjiang Science and Technology Press, "Culture Techniques of Xinjiang Staple Medicinal Plants", Xinjiang Institute of Traditional Chinese and Ethnologic Medicines Ed., 2004, str. 84-88.

3) Du N., Zhou P., Wang J., Liu C., Li W., Zhongguo Yaoke Daxue Xue bao, 24, 46-48 (1993).

4) Xue D., Zhongguo Zhongyao Zazhi, 22, 170-171 (1997).

5) Song Z., Mo S., Chen Y., Tu P., Li W., Zhao Y., Zheng J., Zhongguo Zhongyao Zazhi, 25, 728-730 (2000).

6) Song Z., Tu P., Zhao Y., Zheng J., Zhongcaoyao, 31, 808-810 (2000).

7) Yoshizawa F., Deyama T., Takizawa N., Usmanghani K., Ahmad M., Chem. Pharm. Bull., 38, 1927—1930 (1990).

8) Matsuda H., Morikawa T., Tao J., Ueda K., Yoshikawa M., Chem. Pharm. Bull., 50, 208-215 (2002).

9) Morikawa T., Matsuda H., Toguchida I., Ueda K., Yoshikawa M., J. Nat. Prod., 65, 1468-1474 (2002).

10) Tao J., Morikawa T., Toguchida I., Ando S., Matsuda H., Yoshikawa M., Bioorg. Med. Chem., 10, 4005-4012 (2002).

11) Morikawa T., Tao J., Ando S., Matsuda H., Yoshikawa M., J. Nat. Prod., 66, 638-645 (2003).

12) Tao J., Morikawa T., Ando S., Matsuda H., Yoshikawa M., Chem. Pharm. Bull., 51, 654-662 (2003).

13) Matsuda H., Morikawa T., Xie H., Yoshikawa M., Planta Med., 70, 847-855 (2004).

14) Sun B., Morikawa T., Matsuda H., Tewtrakul S., Harima S., Yoshikawa M., J. Nat. Prod., 67, 1464—1469 (2004).

15) Morikawa T., Sun B., Matsuda H., Wu LJ, Harima S., Yoshikawa M., Chem. Pharm. Bull., 52, 1194—1199 (2004).

16) Xie H., Wang T., Matsuda H., Morikawa T., Yoshikawa M., Tani T., Chem. Pharm. Bull., 53, 1416—1422 (2005).

17) Morikawa T., Xie H., Matsuda H., Yoshikawa M., J. Nat. Prod., 69 (2006) v tisku.

18) Morikawa T., Xie H., Matsuda H., Wang T., Yoshikawa M., Chem. Pharm. Bull., 54, 506—513 (2006).

19) Kobayashi H., Karasawa H., Miyase T., Fukushima S., Chem. Pharm. Bull., 33, 3645-3650 (1985).

20) Otsuka H., Phytochemistry, 33, 617-622 (1993).

21) Zhao W., Yang G., Xu R., Qin G., Phytochemistry, 41, 1553-1555 (1996).

22) Kobayashi H., Karasawa H., Miyase T., Fukushima S., Chem. Pharm. Bull., 32, 1729-1734 (1984).

23) Xu Z., Yang S., Yang J., Lu R., Zhongcaoyao, 30, 244-246 (1999).

24) Wang SJ, Pei YH, Hua HM, Chin. Chem. Lett., 12, 343-344 (2001).

25) Tyto známé sloučeniny byly identifikovány porovnáním jejich fyzikálních dat s komerčně získanými vzorky.

26) Pires R., Burger K., Tetrahedron, 53, 9213-9218 (1997).

27) Kamal A., Ramana KV, Ramana AV, Babu AH, Tetrahedron: Asymmetry, 14, 2587—2594 (2003).

28) 1H- a 13C-NMR spektra 1-6 a příbuzných sloučenin (19, 1a, 5a, 14a, 14b) byla přiřazena pomocí nezkresleného zesílení pomocí polarizačního přenosu (DEPT), korelační spektroskopie s dvojitým kvantovým filtrem ( DQF COSY), experimenty heteronukleární vícenásobné kvantové koherence (HMQC) a heteronukleární vícenásobné vazby (HMBC).

29) Nishizawa M., Kodama S., Yamase Y., Kayano K., Hatakeyama S., Ya mada H., Chem. Pharm. Bull., 42, 982-984 (1994).

30) Yoshikawa M., Ueda T., Matsuda H., Yamahara J., Murakami N., Chem. Pharm. Bull., 42, 1691-1693 (1994).

31) Matsuda H., Shimoda H., Uemura T., Ueda T., Yamahara J., Yoshikawa M., Chem. Pharm. Bull., 47, 1753-1758 (1999).

32) Damtoft S., Jensen SR, Nielsen BJ, Phytochemistry, 24, 2281—2283 (1985).

33) Watanabe K., Takada Y., Matsuo N., Nishimura H., Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1979-1980 (1995).

34) Takikawa H., Yamazaki Y., Mori K., Eur. J. Org. Chem., 229-232 (1998).

35) Kitagawa I., Fukuda Y., Taniyama T., Yoshikawa M., Chem. Pharm. Bull., 39, 1171-1176 (1991).

36) Yamaguchi K., Shinohara C., Kojima S., Sodeoka M., Tsuji T., Biosci. Biotech. Biochem., 63, 731-735 (1999).